本方案介绍了一种在大鼠模型中优化的两步胶原酶肝脏灌注技术，并展示了分离肝细胞的应用 体外 长期培养三维类器官
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摘要
摘要
原代肝细胞是一种常用的工具 体外 肝脏相关研究。然而，由于这些细胞在培养过程中会迅速丧失形态、活力和功能，其长期维持一直是一项挑战。一种近期用于长期培养的方法是生成三维（3D）类器官，一种 体外 一种基于肝脏自我再生能力在培养皿中重建组织的工具。已有发表的实验方案旨在从原代成年肝细胞（Hep-Orgs）中获得长期功能性的三维类器官。该三维类器官这一前沿工具的应用依赖于从成年组织中分离细胞的能力，而这一初始步骤对于获得高质量的最终结果至关重要。始于20世纪70年代的两步胶原酶灌注法，至今仍是一种获取单个肝细胞的有效方法。本文旨在详述手术操作中的所有关键步骤，从而优化大鼠模型中原代肝细胞的分离流程。此外，特别关注PREPARE指南的应用，以提高实验成功率并确保结果的高质量。本详细方案可帮助研究人员加快并优化从原代成年大鼠肝细胞建立三维类器官的后续工作。与二维培养的肝细胞相比，Hep-Orgs在第15天仍保持活性并持续增殖，显示出长期培养的潜力。
引言
原代肝细胞是研究中一种重要且广泛应用的工具 体外 肝脏相关研究。然而，由于肝类器官在培养数天后会失去形态和功能，其扩增与维持历来具有挑战性1二维培养条件尤其对具有多边形形态和极性结构、且具有分化良好的顶膜与基底侧膜的肝细胞而言是一种限制。事实上，肝细胞与培养板的黏附会干扰其正常功能，因为这会导致细胞骨架变平，细胞间以及细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用受限，从而降低细胞极性及相关信号通路的活性2.
为了克服该方法的局限性，Dunn 及其同事3首次采用了胶原双层法。这种培养方法被称为"夹心培养法"，其原理是在基质的两层之间接种原代肝细胞。该方法具有多种优势，包括可实现长期培养、维持肝细胞的多边形形态，以及保持与新鲜分离肝细胞相当的转录活性4。一种基于相同原理的类似方法，即底层由 Matrigel 构成、上层由胶原构成的培养体系，已证实可形成结构完善的胆小管网络5。
尽管夹层培养法在肝细胞生长方面具有可靠性，但本研究旨在建立一种3D类器官培养，一种 体外 用于在培养皿中重建组织并架起通往个性化医疗潜在桥梁的工具，可生成疾病特异性的生物学见解，识别分子靶点，进行药物测试，建立生物样本库，并为类器官芯片等创新技术开辟新前景6原代肝细胞被包埋在称为半球形基质滴的结构中 "穹顶" 以促进类器官在穹顶内的稳健生长，并确保培养基中的可溶性因子（包括肝细胞生长因子（HGF）和表皮生长因子（EGF））的流动。这些生长因子可直接激活信号通路，以维持肝细胞的存活7肝脏类器官通常来源于从胚胎期或成年大鼠、小鼠、人类（以及狗和猫）肝脏中分离出的干细胞/前体细胞8即使三维构象能够促进干细胞向成熟肝细胞的分化，该工具仍缺乏原始原代组织的成熟度9为了解决这一问题，2018年，两个不同的研究团队9,10 同时发表了一种从成年小鼠原代肝细胞（称为Hep-Orgs）建立长期三维肝类器官培养的实验方案。该方案模拟了肝脏再生过程中增殖性损伤应答，使肝细胞在高水平炎症细胞因子环境中生长，类似于部分肝切除后的状态。事实上，上述研究证明肝细胞在损伤后可转变为胆管样状态。12 或当胆管上皮细胞增殖受到抑制时13它们的双潜能特性赋予了细胞可塑性，这对于类器官等复杂结构的形成至关重要。因此，这些方案克服了原代肝细胞无法扩增的问题。 体外.
三维类器官这一前沿工具需要具备从成年组织中分离细胞的能力，而这一初始步骤对于获得高质量的最终结果至关重要。尽管三维类器官制备可被视为一种近期发展且仍在完善的技术（因为“类器官”这一术语由Lancaster提出）14 和 Huch15 仅十年前），两步胶原酶灌注法还是一种由 Seglen 在 20 世纪 70 年代提出的老方法16聚焦于该领域最新的研究成果，Ng 的实验方案17 和 Shen18 可被视为在大鼠中实施该操作的金标准，而Cabral等人的方法则19 和 Charni-Natan20 对于小鼠而言，研究人员通常专注于选择最佳的细胞外基质（ECM）和生长因子以构建三维类器官，却常遭遇诸如手术操作不当、肝细胞存活率和得率低、或细菌污染水平高等问题。这些问题会延长后续实验周期，并增加后续实验所需的动物数量。相反，若手术及细胞分离步骤经过良好优化，则可获得大量高活性的肝细胞，从而制备大量类器官，显著减少动物使用量。本方案主要通过使用商业化试剂并优化门静脉精确灌注技术，确保肝脏灌注与消化步骤的最佳化，以解决上述问题 原位.
为了提高动物研究的质量、可重复性和可转化性，我们认真考虑了PREPARE指南：动物研究与实验程序规划建议（Planning Research and Experimental Procedures on Animals: Recommendations for Excellence）21。这些报告指南通过周密的规划来提高研究成功的可能性，是实施Russel和Burch提出的“3R原则”（替代、减少和优化）的重要步骤。PREPARE指南涵盖了15个主要主题，应根据每个具体的研究项目予以考虑。本文将描述我们在项目规划与准备阶段所重点关注的主题。
本研究旨在以详尽、细致且逻辑清晰的实验方案，全面描述大鼠模型手术中的关键步骤，以帮助研究人员加快并优化后续工作。在我们初次开展这些实验时，曾遇到细菌污染、肝脏消化效率低、原代肝细胞得率低以及肝细胞活性差等问题，这些问题极易影响技术操作的成功率。本方案通过展示如何识别并解决这些关键技术难点，优化了大鼠原代肝细胞的分离流程。大鼠肝脏灌注及随后的原代成年肝细胞分离是多种应用中的主要前期步骤。特别是，本方案适用于所有需要获得高得率、高质量且高活性成年肝细胞的实验操作。该方案的结果适用于建立 体外 用于研究肝脏生理学与病理学的模型
方案
所有实验操作和动物饲养均按照意大利法律和欧洲共同体指令的指导原则进行。根据2014年第26号法令第31条，本实验方案已获得当地动物护理委员会和意大利卫生部（许可编号 n° 321/2022-PR）的批准。
1. 动物实验的准备工作
注意：培养基和缓冲液的成分请参见表1，商品信息请参见材料表。
- 将水浴锅预热至 42 °C，然后将灌注缓冲液和 1x PBS 放入水浴中预热约 20 分钟。
注意：由于酶对温度敏感，消化缓冲液仅在灌注程序成功启动后才进行预热。在灌注过程中，需将溶液始终保持在水浴中。 - 将 William's 完全培养基和含 3% P/S 的 PBS 置于冰上。
- 准备好蠕动泵，并将管路连接至装有灌注缓冲液的玻璃瓶和气泡捕集器。
- 在启动泵进行管路预充时，使用温热的灌注缓冲液充满管路，以排除空气并冲洗残留的乙醇（使用低泵速）。此步骤对于检查泵的正常运行及管路是否泄漏也至关重要。
2. 肝细胞分离的准备工作
- 在动物实验操作过程中，将以下器械暴露于紫外光下：100 mm 培养皿、100 µm 细胞筛、M号刮刀、大号镊子、冰用烧杯、冰用托盘。
3. 动物初始操作与麻醉
- 通过腹腔注射麻醉剂混合物（赛拉嗪终浓度：22.5 mg/kg；氯胺酮终浓度：112.5 mg/kg；总体积约 0.8–1.0 mL）对成年大鼠（体重 250–350 g，10–12 周龄）进行麻醉。
- 通过夹捏脚趾监测麻醉深度，直至大鼠对有害刺激不再产生反应。通常需要 5 分钟。该麻醉剂量可确保达到深度外科麻醉状态，从而最大限度降低实验过程中动物的痛苦或不适风险。
注意：本实验中采用放血法作为大鼠安乐死的辅助方法，以确保动物已被有效处死。 - 剃除腹部毛发，并用 70% 乙醇清洁，以减少手术期间的细菌污染。
注意：本手术为非存活性手术，因此无需维持完全无菌条件。 - 将大鼠置于解剖托盘中央，并用针固定四肢。
- 从下腹部正中至肋骨处，沿皮肤和肌肉做 U 形切口，夹住皮肤并向头部方向翻折，暴露肠管。
- 小心将肠管移至动物左侧，移出腹腔外，暴露肝门静脉和下腔静脉。
- 使用镊子将棉线从门静脉下方穿过，并打两个相距 1 cm 的结，使静脉位于两结之间。
注意：黑色缝线更易于观察。 - 向下腔静脉注射 100–150 IU 肝素（溶于 1× PBS，总体积 300 µL），以防止血液凝固。
4. 插管与肝脏灌注
- 以低速（流速小于 1 mL/min）启动泵。
- 在缝线水平处，以与门静脉呈平坦角度的方式将 18 G 留置针插入门静脉。
- 手动拔出内针，仅保留套管在静脉内。血液将流入套管，填满堵塞部位，从而避免下一步中产生气泡。
- 当灌注缓冲液在管路中流动时，使用鲁尔锁接头按下 C 按钮将套管连接至出口端。
- 此时打结固定，一个结扎在静脉内的导管上，另一个结扎在进入静脉前的导管上，以确保导管处于正确且稳定的位置。
- 剪开下腔静脉以使血液流出。确保肝脏在 2–3 秒内迅速肿胀并褪色（数秒内）。这表明灌注缓冲液已正确流经肝脏。
注意：若部分肝叶仍呈红色，说明留置针插入过深；若仅出现局部红斑，可轻敲肝脏以促进特定区域的灌注。在开放的腹腔上倾倒少量 1× PBS，有助于清除血液并检查是否存在泄漏。 - 缓慢将泵流速增加至 10 mL/min，并维持至少 10 分钟，以充分清除肝脏中的血液。
- 灌注过程中，使用棉签对下腔静脉施加压力，每次持续 10 秒：确保夹闭时肝脏肿胀，松开时肝脏回缩。周期性重复加压操作（5–10 次），并观察肝脏的肿胀与回缩情况。
注意：此步骤是肉眼验证灌注效果的关键检查点，对于保证肝细胞高活力及最大化最终收获量至关重要。通过主动验证该过程，缓冲液可有效到达肝脏血管系统的各个部分，这是单纯被动排血无法实现的。
5. 肝脏消化
- 灌流结束后，切换至预热的消化缓冲液，保持液体流动不间断，并避免管路中产生气泡。
注意：暂时降低流速有助于完成此步骤。消化缓冲液中含有酚红，便于观察从灌流缓冲液到消化缓冲液的转换过程。 - 将泵速提高至 20 mL/min，并周期性地用棉签轻压肝脏，以促进其肿胀和松弛。
- 此步骤持续约 15 分钟后，应确认肝脏逐渐变得松软。此时可拔出针头，停止泵液。
- 由于消化后的肝包膜较为脆弱，需轻柔且小心地解剖肝脏：用镊子夹住肝叶之间的中央结缔组织，切断肝脏与其他器官的所有连接，然后将肝脏提起。
- 将肝脏浸入预冷的 PBS + 3% P/S 溶液中数秒进行清洗，随后将其放入含有预冷 William's 完全培养基的离心管中。
注意：动物放血和死亡可确保通过下腔静脉完成灌流。动物死亡的确认依据为：肝脏被取出时诱发气胸，膈肌被完全解剖，且经检查已无呼吸和心跳活动。
6. 肝细胞纯化
- 在生物安全柜中，将肝脏转移至盛有15 mL冷的William's完全培养基的100 mm培养皿中，并置于装满冰的托盘上。
- 用刮勺用力按压器官，使细胞释放到培养基中。
注意：如果消化步骤操作正确，细胞应易于释放，无需对肝脏施加过大压力。不要将肝脏切成小块，保持其完整。使肝脏始终浸没在培养基中可促进细胞释放。 - 收集含有细胞的培养基，并通过100 µm滤网过滤，同时转移至无菌锥形管中。过滤可去除结缔组织和未消化的组织碎片。
- 向培养皿中被压碎的肝脏加入约15 mL冷的William's完全培养基，以帮助释放更多细胞。重复步骤6.2和6.3。
- 至少重复一次步骤6.4，直至所有细胞均被释放。如有必要，可将培养基分装至多个锥形管中，并使用多个100 µm滤网。
注意：肝细胞释放后、过滤前，由于肝细胞的存在，培养基应呈现不透明状。剩余的肝脏组织应呈纤维状，随后予以丢弃。 - 将含有肝细胞的滤过培养基在4 °C条件下以50 × g离心3分钟，使用低速刹车。
注意：肝细胞密度高于其他肝脏细胞。由于离心力较低，只有肝细胞会形成沉淀，而其他细胞则保留在上清液中。 - 弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。在管中轻轻加入约40 mL冰冻的William's完全培养基，缓慢吹打2至3次，以重新悬浮细胞沉淀。
注意：必须小心重悬细胞沉淀，以避免损伤细胞。 - 在4 °C条件下以50 × g离心3分钟。
注意：初次操作时，建议在第二次离心后、进入下一步前，使用1:10台盼蓝染色法计数活细胞。若所有细胞均已死亡，此步骤可避免浪费培养基和时间。 - 弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于25 mL冰冻的William's完全培养基中。
- 向管中加入25 mL 90%密度梯度溶液，并轻轻混匀。
注意：密度梯度溶液可根据密度差异分离活肝细胞与死肝细胞及细胞碎片。 - 在4 °C条件下以200 × g离心10分钟。管底应可见明显沉淀，对应为活肝细胞；梯度上层则形成清晰的一层，由死肝细胞组成。
注意：若完全无沉淀，可尝试轻轻摇动混匀溶液后重复离心。 - 从梯度顶部吸除死细胞层，保留1–2 mL培养基与沉淀。
- 将沉淀重悬于30–40 mL William's完全培养基中。
注意：整个操作过程中仅使用25 mL移液管。孔径更小的移液管可能降低肝细胞活力。所有步骤均需在冰上进行，以维持+4°C环境。 - 在4°C条件下以200 × g离心10分钟，然后吸除上清液。
7. 肝细胞培养与RNA收集
- 加入适量培养基用于细胞计数。用1:10的台盼蓝进行细胞活力计数。
- 二维肝细胞培养
- 将细胞以每孔500,000个细胞的浓度接种于胶原包被的6孔板中，使用预热的William's完全培养基。
- 将细胞培养物置于37 °C、含95%空气和5% CO2的湿润化培养箱中。
- 4小时后，更换为新的预热William's完全培养基。
- 将细胞继续置于培养箱中培养，每天更换培养基。
- 在接种前（第0天）以及培养第1至第3天时，收集原代肝细胞用于RNA提取。
- 按照试剂盒说明书提取RNA，并反转录为cDNA，通过RT-qPCR检测肝细胞标志基因的表达。引物列表见表2。
- 三维长期肝细胞培养：
- 将细胞重悬于冷的纯基质胶中，浓度为每20 µL含1,000–10,000个细胞。
注意：尽量避免产生基质气泡。 - 使用预冷的移液枪头，将含有细胞的基质液滴接种至预热的细胞培养板中。
- 将培养板倒置，在细胞培养箱中孵育20–30分钟。
- 将培养板翻转正放，加入预热的三维长期肝细胞培养基及根据Peng的研究22指定的特定培养基，并将细胞继续置于培养箱中培养。
- 每2–3天更换一次三维长期肝细胞培养基。
- 培养至少14天后，将肝类器官（Hep-Orgs）从基质中分离，通过台盼蓝染色和EdU增殖检测评估存活的肝类器官，并根据Peng的研究进行传代。
- 将细胞重悬于冷的纯基质胶中，浓度为每20 µL含1,000–10,000个细胞。
结果
在完成设置步骤（步骤 6.13）后，我们从约 300 g 大鼠肝脏中每次分离获得的细胞产量可达 1 × 108 个细胞。通过台盼蓝计数法测定细胞活力为 78% 至 97%。
正如先前研究所述1,18,19，培养中的原代肝细胞会在数天内失去其形态、肝脏特异性功能并发生死亡。
文献中已知23,24，原代成人肝细胞会迅速失去立方形-六边形形态，在数天内转变为“成纤维细胞样”形状并死亡。图1展示了各个阶段：接种于胶原包被的培养板后4小时，肝细胞贴附于表面，呈典型单层铺展，具有立方形形态，细胞边界清晰，细胞间连接呈线性，细胞表面光滑（图1A）。第1天，原代肝细胞获得典型的六边形形状，脂滴开始可见（图1B）。第2-3天，脂滴增多（图1C-1D）；而在第4-5天，细胞内开始积聚肌动蛋白应力纤维（图1E-F）。我们还评估了原代二维培养中从第1天到第5天的活细胞百分比，并与接种前第0天的存活率进行比较（图2）。可以观察到，培养的最初几天内细胞活力已出现急剧下降：第1天为49.5%（标准差12.7），第2天降至45.2%（标准差18.2），第3天为33.5%（标准差0.77）。第4天活细胞比例已降至16.9%（标准差5.4），第5天进一步降至9.1%（标准差0.38）。因此，显然在二维培养中原代肝细胞形态的丧失伴随着快速进行性的细胞死亡。
分离的肝细胞在接种前（第0天）表现出肝细胞标志基因（ABCD3、ALB、KRT18、PCK1、SERPIN、TDO2）的高mRNA表达水平，RT-qPCR检测证实了这一点（图3）。所有分析的基因在培养第1天即显示出随培养时间延长而表达下降的趋势。mRNA表达水平的变化凸显了原代肝细胞在培养过程中功能和活力的逐渐丧失。
分离的肝细胞被接种于三维基质液滴中，并随时间观察其形成的三维类器官结构。培养第1天时，单个肝细胞悬浮于基质液滴中（图4A）。细胞浓度被有意保持在较低水平，以提供充足的生长空间，同时也便于我们直观地追踪类器官的生长过程。原代肝细胞在培养的最初几天内显示出细胞分裂现象（图4C）。此外，Hep-Orgs在第0天测得直径约为30 μm，到第2天时尺寸几乎翻倍，此后直至第15天持续维持这一增长趋势（第1天为33.08 μm，第2天为64.86 μm，第5天为45.06 μm，第7天为55.19 μm，第10天为51.93 μm，第15天为62.90 μm）。关于Hep-Orgs的形态，第1天时呈圆形，随后几天逐渐发展为典型的“葡萄串样”结构（肝类器官的典型特征）。
在3D基质中培养的肝细胞可存活数周，使用台盼蓝染色法检测，在培养15天后存活率为23% ±10%（图4B，第一行）。为验证大鼠肝类器官（Hep-Orgs）的增殖能力，在第15天进行了EdU检测（图4D）。然而，Hoechst染色显示存在大量单细胞而非肝类器官，尽管EdU掺入率较低（9% ± 7%），但仍可见肝细胞（绿色细胞）具有增殖活性（图4B，第二行）。
图 1：原代肝细胞在胶原包被培养板上的二维培养随时间变化情况。 图像以 20 倍放大倍数拍摄，分别为铺板后（A）4 小时的相差显微镜图像、（B）第 1 天、（C）第 2 天、（D）第 3 天、（E）第 4 天、（F）第 5 天。每张图片中均标有对应 50 µm 的比例尺。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：胶原蛋白包被培养板中二维培养的原代活细胞。 该图显示了从第1天到第5天的活细胞百分比，以第0天接种的活细胞为100%进行比较。结果以三次不同实验的单次重复、平均值及标准差表示（* p值 ≤ 0.05；** p值 ≤ 0.005）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：通过 RT-qPCR 检测原代肝细胞中肝细胞标志物的 mRNA 表达。 结果以 β-Actin 和/或 GAPDH（管家基因）为内参进行标准化，并相对于第 0 天铺板前采集的原代肝细胞（设定为 1）表示。数据至少来自 3 次独立实验，以平均值 ± 标准差表示（**+ p 值 ≤ 0.001）。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：随时间推移在基质液滴中进行的肝细胞三维培养。（A）将分离的肝细胞接种于基质液滴中以进行长期肝类器官（Hep-Orgs）培养：图中可见基质液滴位于孔板表面（红色圆圈 = 一个液滴）。（B） 第15天传代前通过台盼蓝染色测定的活细胞百分比及通过EdU检测测定的增殖细胞百分比。EdU阳性细胞的定量分析使用ImageJ2软件完成。结果以至少3次独立实验的平均值±标准差（SD）表示。（C） 大鼠肝类器官（Hep-Orgs）在三维培养条件下不同生长时间点（第1、2、5、7、10、15天）的相差显微图像。图片放大倍数为20倍。每张图片中均标注了对应50 µm的比例尺。（D） 第15天大鼠肝类器官的EdU掺入检测结果。图片放大倍数为20倍。 请点击此处查看该图的高清版本。
表1：缓冲液与培养基成分。 本表列出了本实验方案中使用的所有缓冲液及细胞培养基的名称及其组分（含终浓度）。请点击此处下载该表格。
表2：大鼠引物列表。 本表列出了用于RT-qPCR实验的引物序列。请点击此处下载该表格。
讨论
三维类器官是个性化医疗的前沿领域，可实现肝细胞的长期培养。该创新技术的质量依赖于获得高产量的活体原代肝细胞，以及高质量的肝脏灌注和肝细胞分离操作。这一传统方法至今仍被广泛使用，但其包含多个可能具有挑战性的步骤。在实践该操作过程中，我们曾遇到一些关键问题，如细菌污染、肝脏消化效率低、原代肝细胞产量低以及肝细胞活力差，这些问题均可能严重影响该技术的成功率。基于现有的金标准方案17,18，本文重点阐述如何克服常见问题，明确原代大鼠肝细胞分离过程中最关键的步骤，并总结那些零散但极易影响大鼠模型实验成败的操作要点。尽管肝脏灌注操作具有一定难度，且对操作者的技术精度要求较高，但它能够确保原代肝细胞在产量、完整性、活力和功能方面的高质量，而这些特性对于后续实验阶段至关重要。
在项目规划阶段，我们仔细参考了 PREPARE 指南检查清单21。我们特别关注了以往文献，比较了不同的前期研究，并与部分作者取得了联系（PREPARE 指南检查清单 _主题 A1）。类器官技术本身是一种重要的减少动物使用数量的方法，因为细胞可在培养中传代长达 7 个月（PREPARE 指南检查清单 _主题 A3）。通过与动物设施工作人员的沟通，我们选定了一名经验丰富的技术人员，其为实验操作提供了协助，并有助于避免使用多余的实验动物（PREPARE 指南检查清单 _主题 B5）。我们还获得了进行肝脏灌注所必需的合适蠕动泵（PREPARE 指南检查清单 _主题 B6）。
Ng的出版物17 和沈18 是最近描述大鼠操作步骤的研究。本方案所关注的主要问题在先前研究中尚未涉及，包括商用溶液的使用，以及精确门静脉插管技术的优化，以确保肝脏灌注和消化步骤达到最佳效果，同时维持肝脏的完整性 原位。尽管沈的方案18 和 Ng17 使用自制溶液，我们的方案基于商业化的灌注和消化溶液，以减少缓冲液制备过程中的变异性。消化酶浓度过高可能对肝细胞产生损伤，影响细胞质量和活力25使用商业试剂盒对于提高实验方案的可重复性至关重要，可确保标准化操作。此外，由Ng执行的该方案17 由于需要在消化阶段之前切除肝脏，该操作可能具有挑战性。我们的方案基于在不切除肝脏的情况下进行肝脏灌注和消化，待这两个阶段完成后才切除肝脏，从而简化了操作流程。在细胞得率和细胞活力方面，本方案的结果与以往研究相当。
在手术开始前对灌注管路进行清洗和消毒，以及手术前后对皮肤进行消毒，对于限制细菌污染至关重要。此外，在使用乙醇清洗后以及用培养基冲洗前，必须将管路彻底干燥，这对提高细胞存活率尤为关键。事实上，若将少量乙醇注入肝脏，即可在手术过程中导致细胞死亡。
注射溶液的温度非常重要，但还必须考虑胶原酶对温度的敏感性。因此，我们在开始手术操作前将灌注缓冲液预热至 42 °C，而消化缓冲液仅在灌注步骤期间才放入温浴中。在导管上游的管路中添加一个气泡捕获装置，可防止气泡进入导管，同时在灌注液用尽时避免空气进入肝脏17。
缓冲液成分、灌注压力和流速应在适当范围内17我们发现，低压力和低流速会导致得率降低，并对细胞活力产生不利影响，因为缓冲液无法充分到达细小血管。另一方面，流速也不应过高，以保持格利森囊（Glisson's capsule）的完整性。由于细胞黏附的完整性依赖于 Ca2+ 18，灌注缓冲液是一种含钙的缓冲液2+-含EDTA的无钙溶液可破坏细胞间含钙的连接桥，因此对于去除钙离子以及清除肝脏中的血液至关重要。以10 mL/min的流速灌注8–15分钟，可确保EDTA充分作用于所有细胞，2+无酶溶液。灌注不足可能导致消化效果降低。
消化缓冲液含有 Ca2+，因为消化胶原基质的胶原酶需要 Ca2+ 依赖于消化缓冲液的流速应至少保持在 20 mL/min，消化时间则取决于胶原酶的活性。若使用我们特定的消化缓冲液, 我们需要灌注15分钟，最终灌注体积为300 mL溶液。如果消化不完全，细胞间连接仍会保留，后续的机械压力将损伤细胞，降低细胞活力。缓慢增加流速有助于减轻灌注对细胞造成的应激影响。在手术过程中，我们重点关注了短暂的 下腔静脉 夹闭及随后的肝脏肿胀：此步骤显著提高了消化效率和细胞回收率。消化结束时，肝脏应呈现浅棕色且质地柔软。肝脏切除完成后，用含3%青霉素-链霉素的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗分离的肝脏，可降低细菌载量，有助于避免后续操作中的污染。
在生物安全柜中进行肝细胞分离操作时，使用 25 mL 移液管可避免因小口径移液管导致肝细胞活力下降。我们增加了一个可选步骤以提高原代肝细胞的得率，即在研磨后的肝脏上倾倒 William's 完全培养基，以便在生物安全柜内重复刮取操作。该步骤在过滤从分离肝脏中释放的细胞悬液后进行，有助于清洗培养皿并从肝包膜中回收更多细胞。若需施加较高压力使肝细胞通过滤器，则细胞活力将显著降低19。
肝细胞在二维培养条件下无法存活超过2天，这促使我们寻找一种替代的长期培养模型。成年肝类器官（Hep-Org）是一种适合长期培养肝细胞的模型。与二维培养的肝细胞相比，Hep-Org在第15天仍保持活性并处于活跃增殖状态，显示出长期培养的潜力。
大鼠肝脏灌注及随后的原代成年肝细胞分离是多种应用的主要初步步骤。尽管该技术的可重复性可能受到限制，因为该过程涉及多个步骤和变量，但关注操作过程的视觉描述有助于以较高的成功率重现该方法。本方案通过指出关键步骤并展示如何应对这些问题，优化了原代大鼠肝细胞分离流程，所得结果适用于建立 体外 模型，如肝类器官的生成，用于研究肝脏生理学与病理学。
披露
所有作者均已披露任何及所有利益冲突。
致谢
我们感谢的里雅斯特大学SorrentinoLab的Davide Selvestrel博士和Giovanni Sorrentino教授在EdU增殖实验中给予的帮助。本工作由意大利银行（Banca d'Italia）提供资助。 特设的 资助和院内FIF资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| A83-01- ALK5 抑制剂 IV | Twin Helix | T3031 | |
| B27 | Thermofisher Scientific | 0080085SA | |
| CFX Connect 实时荧光定量 PCR 检测系统 | Bio-Rad | ||
| CHIR99021 | Twin Helix | T2310 | |
| Click EdU Alexa 488 成像试剂盒 | Thermofisher Scientific | C10499 | |
| Ⅰ型胶原，大鼠尾来源溶液 | Merck | C3867-1VL | |
| 地塞米松 | Merck | D4902 | |
| EGF | Merck | E9644 | |
| 胎牛血清（FBS） | Euroclone | ECS0180L | |
| GELTREX LDEV FREE RGF BME | Thermofisher Scientific | A1413202 | |
| 肝素钠 25000 IU/5 ml | B. Braun Melsungen AG | B01AB01 | |
| HGF | Peprotech | 100-39H | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒溶液 100x | Thermofisher Scientific | 41400045 | |
| L-谷氨酰胺溶液 | Euroclone | ECB3000D | |
| 肝脏消化培养基 | Thermofisher Scientific | 17703-034 | |
| 肝脏灌注培养基 | Thermofisher Scientific | 17701038 | |
| N2 添加剂 | Thermofisher Scientific | 17502048 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Merck | A9165 | |
| 烟酰胺 | Merck | N-0636 | |
| 非必需氨基酸 | Merck | M7145 | |
| Normocin | Aurogene | ant-nr-1 | |
| PBS 缓冲液 1X | PanReac AppliChem | A0964,9050 | |
| 青霉素-链霉素溶液 100x | Euroclone | ECB3001D | |
| Percoll | Santa Cruz | sc-296039A | |
| 蠕动泵 | Ismatec™ | MS-4/12 Reglo Digital Pump | |
| TNFa | Peprotech | 300-01A | |
| TRI 试剂 | Merck | T9424 | |
| 管路 | Ismatec™ | ID.2,79mm | |
| Williams' E 培养基，不含谷氨酰胺 | Thermofisher Scientific | 31415029 | |
| Y27632 | Twin Helix | T1725 |
参考文献
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