从小鼠大脑和颅骨中分离免疫细胞

大脑是神经系统的中枢，受到颅骨的保护。颅骨下方是三层结缔组织，称为脑膜——硬脑膜、蛛网膜和软脑膜。脑脊液 （CSF） 在蛛网膜基质和软脑膜之间的蛛网膜下腔循环，缓冲大脑并通过淋巴系统清除废物 ^1,2。总之，这种独特的架构提供了一个安全和支持性的环境，可以维持大脑的稳定性并保护它免受潜在的伤害。

长期以来，大脑一直被认为是免疫特权的。然而，这一概念已被部分放弃，因为越来越多的证据表明，除了薄壁组织中的常驻小胶质细胞外，大脑的边界，包括脉络丛和脑膜，还承载着多种免疫细胞³。这些细胞在维持体内平衡、监测大脑健康和启动对脑损伤的免疫反应方面起着关键作用。值得注意的是，最近的研究结果表明，颅骨参与脑膜免疫，并可能有助于受伤后大脑的免疫反应。2018 年，Herisson 等人开创性地发现了连接颅骨骨髓和脑膜的直接血管通道，从而建立了白细胞迁移的解剖途径 ^4,5。后来，Cugurra 等人证明，脑膜中的许多髓系细胞（例如单核细胞和中性粒细胞）和 B 细胞并非源自血液⁶。使用颅骨皮瓣移植和选择性照射方案等技术，作者提供了令人信服的证据，证明颅骨骨髓是脑膜中髓系细胞的局部来源，也是 CNS 损伤后 CNS 实质的局部来源⁶。此外，另一项研究表明，脑膜 B 细胞由颅骨骨髓持续供应⁷。最近，一种称为蛛网膜袖口出口 （ACE） 的新结构已被确定为硬脑膜和大脑之间免疫细胞运输的直接门户⁸。

这些令人兴奋的发现对于免疫细胞浸润到受伤大脑的起源（例如，缺血性中风后）具有重要意义。大量证据表明，中风后，许多免疫细胞会浸润大脑，导致急性脑损伤和慢性脑恢复。传统观念认为，这些细胞是血液中循环的白细胞，渗透到大脑中，这在很大程度上是由中风引起的血脑屏障损伤促成的。然而，这一观念受到了挑战。在一项研究中，小鼠颅骨和胫骨中的免疫细胞标记不同，中风后 6 小时，发现颅骨中中性粒细胞和单核细胞的减少明显更大。缺血性大脑中存在胫骨和更多颅骨衍生的中性粒细胞。这些数据表明，在急性卒中期，缺血性脑中的中性粒细胞主要起源于颅骨骨髓⁴。有趣的是，CSF 可能会指导这种迁移。事实上，最近的两篇报道表明，CSF 可以通过颅骨通道将来自大脑的信号线索直接传递到颅骨骨髓中，并在 CNS 损伤后指导颅骨骨髓中的细胞迁移和造血 ^9,10。

鉴于这些最近的发现，在研究对脑部疾病的免疫反应时，分析大脑和颅骨骨髓中免疫细胞的变化变得非常重要。在此类研究中，下游分析需要足够数量的高质量免疫细胞，例如细胞分选、流式细胞术分析和单细胞 RNA 测序 （scRNA-seq）。在这里，总体目标是提出两种优化的程序，用于从脑组织和颅骨骨髓制备单细胞悬液。需要注意的是，颅骨的颅骨（额骨、枕骨和顶骨）通常用于提取骨髓，而这种骨髓在整个研究中被特称为颅骨骨髓。

该协议得到了杜克研究所动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。本研究使用雄性 C57Bl/6 小鼠 （3-4 个月大;22-28 g）。材料 表中列出了试剂和所用设备的详细信息。

1. 小鼠脑单细胞悬液

注意: 图 1 说明了脑细胞分离方案的概述。

1. 麻醉、插管和固定小鼠，如前所述¹¹.
2. 在皮肤和下面的肌肉层上做一个上腹部切口，然后小心地切开横膈膜和肋骨，在胸腔中形成开口。
3. 用冷 PBS 填充 30 mL 注射器， 并通过硅胶管 将其连接到钝灌注针上。小心地将灌注针插入左心室。
4. 在右心房做一个小切口以允许血液引流，然后以 ~ 10 mL/min 的流速灌注¹² 只小鼠 3-4 分钟。
   注意:为了改善大脑中的血液清除率，可以考虑增加灌注液的体积并添加肝素。
5. 将鼠标斩首，在头顶的皮肤上做一个中线切口，露出头骨。
6. 使用钝镊子小心刮掉覆盖在颅骨上的任何结缔组织。
7. 使用锋利的解剖剪刀沿中线和两侧小心地剪断颅骨缝合线，形成皮瓣。
8. 轻轻提起颅骨皮瓣，露出大脑，用钝钳小心地将大脑从颅腔中取出。
9. 将大脑浸入含有冰冷 PBS 的培养皿中，并去除任何残留的脑膜组织。
   注:为了更好地保持细胞活力，建议在冰上或 4 °C 下执行以下所有步骤。
10. 将大脑置于预冷的 15 mL 玻璃 Dounce 匀浆器中，该匀浆器含有 20 mL（全脑）或 12 mL（半脑）冰旧 HBSS 缓冲液。
11. 使用松散的 Dounce 杵在冰上轻轻缓慢地分离脑组织，敲击约 100-120 次。
    注意:此步骤对于获得大量健康的脑细胞至关重要。此步骤大约需要 10 分钟。当悬浮液中看不到大量脑组织块时，停止匀浆。此时，杵可以很容易地向下移动，而无需任何力。
12. 在 50 mL 离心管中通过 70 μm 细胞过滤器过滤所得脑组织悬液。
13. 用 5 mL HBSS 冲洗 Dounce 管，然后继续过滤以最大限度地收集细胞。
14. 将过滤的组织悬浮液在 4 °C 下以 550 x g 离心 6 分钟。
15. 使用真空抽吸器去除上清液，并将细胞沉淀重悬于 1 mL 30% 等渗密度梯度溶液中。
    注:要制备 15 mL 的 30% 等渗密度梯度溶液，请混合 4.5 mL 的 100% 储备密度梯度培养基、1.5 mL 的 10× PBS 和 9 mL 的 ddH₂O。
16. 将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，加入 9 mL（全脑）或 6 mL（半脑）的 30% 密度梯度溶液。
17. 轻轻倒置试管以确保充分混合。
18. 立即将试管以 845 x g 的速度离心，加速和制动器设置为 3 级，在 4 °C 下离心 20 分钟。
19. 轻轻地从离心机中取出试管，不要摇晃，并使用连接到真空装置的 1 mL 尖端小心吸出髓鞘上层。
    注意:不要干扰此层至关重要。任何残留的髓鞘都会对细胞健康产生负面影响并影响下游分析。
20. 吸出上清液，留下 1-2 mL，然后用至少 10 mL 的冷 HBSS 重悬细胞沉淀。
21. 在 4 °C 下以 550 x g 离心 6 分钟。
22. 用至少 7 mL 的冷 HBSS 再洗涤一次。
23. 去除尽可能多的上清液，并使用 100-200 μL 流式细胞术缓冲液重悬细胞进行流式细胞术分析。
    注:本研究使用的流式细胞术 FACS 缓冲液在 1× PBS 中含有 0.5% BSA 和 2 mM EDTA。建议使用 96 孔 V 形底板进行细胞染色，以尽量减少洗涤步骤中的细胞损失。
24. 使用各个实验室建立的标准方案进行流式细胞术分析¹³.
    1. 简而言之，在 96 孔 V 形底板中将 80 μL 细胞悬液与 20 μL 抗体混合物混合，并在 4 °C 下孵育 25 分钟。
    2. 用 200 μL FACS 缓冲液洗涤，然后用 100 μL HBSS 加细胞活力染色试剂重悬细胞。
    3. 在 4 °C 下孵育 15 分钟后，用 FACS 缓冲液洗涤，并将细胞重悬于 200 μL FACS 缓冲液中用于流式细胞术分析。

2. 小鼠颅骨骨髓单细胞悬液的制备

注意: 图 2 描述了颅骨骨髓分离程序的概述。

1. 如步骤 1.4 中所述灌注鼠标。
2. 将鼠标斩首，在头皮上做一个中线皮肤切口，露出头骨。
3. 切开颅骨，从枕骨大孔开始，用锋利的剪刀沿着颅骨的外侧向前移动。然后，提起并去除颅骨。
   注:可以从同一只小鼠中收获大脑并使用步骤 1 进行处理，从而能够分析来自大脑和颅骨骨髓的免疫细胞。
4. 在解剖显微镜下，使用钝钳小心地从颅骨上剥下硬脑膜。
   注意:从枕骨边缘开始，慢慢分离，然后稳步向额叶区域前进，向内工作更容易。
5. 将培养皿中的颅骨放在冰上，用 1 mL 移液器冲洗颅骨，确保去除其表面的血液残留物。
6. 将颅骨转移到新培养皿中，加入足以浸入颅骨的新鲜冷 PBS。
7. 使用无菌剪刀在冷 PBS 中将颅骨切成约 3 mm x 3 mm 的碎片。
   注意:裁剪方法可能会影响颅骨骨髓提取的效率。建议使用相同的裁剪方法，以最大程度地减少可变性。切开缝合线也很重要。 图 2B 说明了一种方法。
8. 使用 18 G 针头在 500 μL 微量离心管的底部戳一个孔。
9. 将此试管插入含有 20 μL 冷 PBS 的 1.5 mL 微量离心管中。
10. 将颅骨碎片转移到 500 μL 试管中。
    注意:骨碎片应松散包装以提高提取效率。
11. 在 4 °C 下以 10,000 x g 离心 30 秒。
    注:为了最大限度地提高细胞回收率，请使用 18 G 针头轻轻搅拌颅骨碎片，然后重复此步骤 1-2 次。
12. 将收集的颅骨骨髓细胞重悬于 500 μL 红细胞裂解缓冲液中，并在室温下孵育 30 秒。
13. 将悬浮液转移至含有 4 mL 冷 PBS 的 15 mL 离心管中。
14. 在 4 °C 下以 400 x g 离心 6 分钟。
15. 用 5 mL 冷 PBS 再洗涤一次。
16. 将细胞沉淀重悬于适当的缓冲液中。对于流式细胞术，我们通常使用 500 μL FACS 缓冲液。
17. 对于流式细胞术分析，进行细胞计数并使用大约 1 x 10⁶ 个细胞进行抗体染色。
    注:确保在抗体染色¹³ 之前包括 Fc 封闭步骤。

为了从小鼠脑组织中制备免疫细胞，该方案通常产生具有高活力的细胞 （84.1% ± 2.3% [平均值 ± SD]）。这些细胞中约有 70%-80% 为 CD45 阳性。正如预期的那样，在正常小鼠大脑中，几乎所有 CD45 + 细胞都是小胶质细胞 （CD45LowCD11b+）。该方案已在实验室中用于各种应用，包括流式细胞术分析、荧光激活细胞分选 （FACS） 和 scRNA-seq 分析。例如，在卒中模型中进行了流式细胞术分析（图 3）。小鼠接受短暂性卒中模型、30 分钟细丝大脑中动脉闭塞 （MCAO） 14。中风后第 3 天，从小鼠大脑制备细胞，并用常见的免疫细胞表面标志物染色。门控策略如图 3A 所示。与之前的研究一致13,15，观察到同侧半球 CD45High 细胞显着增加（图 3B、C），表明免疫细胞浸润到大脑中。

对于颅骨骨髓方案，颅骨骨髓细胞（约 2 x 106 个细胞）的产量始终如一，并且具有出色的活力 （93.8% ± 1.8% [平均 ± SD]）。正如预期的那样，这些细胞中的大多数是 CD45 阳性。为了说明该方案的实用性，进行了一项比较研究以表征幼稚小鼠股骨和颅骨骨髓中的免疫细胞组成（图 4）。如代表性图所示，股骨和颅骨骨髓之间的免疫细胞组成相似（图 4A、B）。有趣的是，股骨中中性粒细胞的频率似乎高于颅骨（图 4C）。然而，这一发现需要进一步验证，因为这项试点研究的样本量很小。

图 1:脑细胞分离方案概述。请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:颅骨骨髓细胞分离方案。 （A） 程序概述。（B） 推荐的颅骨切割模式。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:中风大脑中免疫细胞的代表性流式细胞术分析。（A） 门控策略的一个例子。这些图描绘了以下免疫细胞群:小胶质细胞（CD45低CD11b+）、NK 细胞（CD45高NK1.1+）、中性粒细胞（CD45高Ly6G+）、T 细胞（CD45高CD11b-CD3+）和 B 细胞（CD45高CD11b-CD19+）。此示例表示中风后第 3 天同侧半球脑免疫细胞的分析。（B，C）将免疫细胞浸润到中风大脑中。年轻雄性小鼠接受短暂性大脑中动脉闭塞 （MCAO）。第 3 天，收集大脑并将其分为左（对侧）和右（同侧）半球。根据所述方案制备脑细胞，然后进行流式细胞术分析。代表性图显示浸润到同侧半球的免疫细胞增加（CD45High 细胞;B）. 定量数据显示在条形图 （C） 中。根据流式细胞术数据中记录的细胞计数和体积计算细胞数。数据以 SEM ±平均值表示。*p < 0.05。请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:颅骨骨髓细胞的代表性流式细胞术分析。为了进行比较，包括对股骨骨髓细胞的分析。这些图描述了以下免疫细胞群:NK 细胞 （CD45+NK1.1+）、中性粒细胞 （CD45+CD11b+Ly6G+）、T 细胞 （CD45+CD11b-CD3+） 和 B 细胞 （CD45+CD11b-CD19+）。（A） 股骨髓的代表性图。（B） 颅骨骨髓的代表性图。（C） 股骨和颅骨骨髓免疫细胞组成的比较。数据以 SEM ±平均值表示。*p < 0.05。请单击此处查看此图的较大版本。

没有。