从小鼠脑和颅骨中分离免疫细胞

摘要

为了研究脑部疾病中的免疫反应，一种常用的方法是分析免疫细胞的变化。本文提供了两种简单且有效的方案，用于从小鼠脑组织和颅骨骨髓中分离免疫细胞。

摘要

越来越多的证据表明，脑部疾病（如脑缺血和自身免疫性脑脊髓炎）引发的免疫反应不仅发生在脑组织内，也发生在颅骨中。要分析脑损伤（如中风）后脑组织和颅骨骨髓中免疫细胞群体的变化，关键一步是获得足量且高质量的免疫细胞，以用于后续分析。本文提供了两种优化方案，用于从脑组织和颅骨骨髓中分离免疫细胞。这两种方案的优势在于操作简便、快速高效，能够获得大量活细胞。这些细胞适用于多种下游应用，例如细胞分选、流式细胞术和转录组分析。为验证这些方案的有效性，我们对中风后脑组织及正常脑颅骨骨髓进行了流式细胞术免疫表型分析，所得结果与已发表研究的发现一致。

引言

大脑作为神经系统的中枢，受到颅骨的保护。颅骨下方有三层结缔组织，称为脑膜，分别为硬脑膜、蛛网膜和软脑膜。脑脊液（CSF）在蛛网膜与软脑膜之间的蛛网膜下腔中循环，对脑组织起到缓冲作用，并通过类淋巴系统清除代谢废物^1,2。这种独特的结构共同为大脑提供了安全且支持性的环境，维持其稳定性并防止潜在损伤。

长期以来，大脑被认为具有免疫豁免特性。然而，随着越来越多的证据表明，除了脑实质中固有的小胶质细胞外，脑的边界区域（包括脉络丛和脑膜）也存在多种多样的免疫细胞，这一观点已部分被放弃³。这些细胞在维持稳态、监测脑健康以及启动对脑损伤的免疫反应中发挥着关键作用。值得注意的是，最近的研究发现颅骨参与脑膜免疫，并可能在脑损伤后参与脑内免疫反应。2018年，Herisson 等人首次发现了一种直接连接颅骨骨髓与脑膜的血管通道，从而建立了白细胞迁移的解剖学通路^4,5。随后，Cugurra 等人证明，脑膜中的许多髓系细胞（如单核细胞和中性粒细胞）以及B细胞并非来源于血液⁶。通过颅骨骨瓣移植和选择性照射等技术，作者提供了有力证据，表明在中枢神经系统（CNS）损伤后，颅骨骨髓是脑膜及CNS实质中髓系细胞的局部来源⁶。此外，另一项研究提出，脑膜B细胞持续由颅骨骨髓供应⁷。最近，一种被称为蛛网膜袖口通道（arachnoid cuff exit, ACE）的新结构被确认为免疫细胞在硬脑膜与脑之间迁移的直接门户⁸。

这些令人振奋的发现对理解损伤后脑组织中浸润性免疫细胞的来源具有重要意义（例如缺血性脑卒中后）。大量证据表明，脑卒中发生后，多种免疫细胞会浸润脑组织，既参与急性期脑损伤，也影响慢性期脑功能恢复。传统观点 这些细胞是血液中循环的白细胞，能够浸润大脑，这一过程主要由脑卒中引起的血脑屏障损伤所促进。然而，这一观点已受到质疑。在一项研究中，小鼠颅骨和胫骨中的免疫细胞被分别标记，脑卒中发生6小时后，颅骨中的中性粒细胞和单核细胞数量显著减少的程度明显更大 与胫骨，且缺血性脑组织中存在更多来自颅骨的中性粒细胞。这些数据表明，在急性卒中阶段，缺血性脑组织中的中性粒细胞主要起源于颅骨骨髓⁴有趣的是，脑脊液可能引导这一迁移过程。事实上，最近两项研究报告表明，脑脊液可直接将来自大脑的信号传递至颅骨骨髓 通过 颅骨通道，并在中枢神经系统损伤后指导颅骨骨髓中的细胞迁移和造血作用^9,10.

鉴于这些最新发现，在研究脑部疾病免疫反应时，分析脑组织和颅骨骨髓中免疫细胞的变化变得尤为重要。在这类研究中，需要获得足够数量且高质量的免疫细胞，以进行后续分析，如细胞分选、流式细胞术分析以及单细胞RNA测序（scRNA-seq）。本文旨在介绍两种优化后的单细胞悬液制备方法，分别用于脑组织和颅骨骨髓。需要特别说明的是，本研究中所指的颅骨骨髓通常取自颅盖骨（包括额骨、枕骨和顶骨），并始终称为颅骨骨髓。

方案

该方案已获杜克大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准。本研究使用雄性C57Bl/6小鼠（3-4月龄；22-28 g）。所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 小鼠脑组织的单细胞悬液制备

注意：图1 展示了脑细胞分离方案的总体流程。

1. 麻醉、插管并固定小鼠，操作方法如前所述¹¹.
2. 通过皮肤及皮下肌肉层做上腹部切口，小心切开膈肌和肋骨，以打开胸腔。
3. 用30 mL注射器吸取冷PBS，然后将其连接到钝头灌注针上 通过 硅胶管。将灌注针小心插入左心室。
4. 在右心房处做一个小切口以允许血液流出，随后进行灌注¹² 以约 10 mL/min 的流速灌注小鼠 3-4 分钟。
   注意：为了改善脑组织中的血液清除效果，可考虑增加灌注液体积并添加肝素。
5. 处死小鼠，沿头部顶部皮肤正中线做切口以暴露颅骨。
6. 使用钝头镊子小心地刮除颅骨上方的结缔组织。
7. 使用锋利的解剖剪沿中线及两侧颅骨缝仔细剪开，形成一个骨瓣。
8. 轻轻抬起颅骨瓣以暴露脑组织，并使用钝头镊子小心地将脑组织从颅腔中取出。
9. 将脑组织浸入含有冰冻 PBS 的培养皿中，并去除残留的脑膜组织。
   注意：为了更好地保持细胞活性，建议将以下所有步骤在冰上或4 °C条件下进行。
10. 将脑组织置于预冷的15 mL玻璃Dounce匀浆器中，加入20 mL（全脑）或12 mL（半脑）冰上预冷的HBSS缓冲液。
11. 在冰上使用松散的Dounce研杵，轻轻且缓慢地研磨脑组织，约进行100-120次。
    注意：此步骤对于获得大量健康脑细胞至关重要，耗时约10分钟。当悬液中不再可见明显的脑组织块时，停止匀浆。此时，研杵可无需施力即能顺畅下移。
12. 将所得的脑组织悬液通过70 µm细胞滤筛过滤至50 mL离心管中。
13. 用5 mL HBSS冲洗Dounce管，然后进行过滤以最大程度收集细胞。
14. 将过滤后的组织悬液在550 x g 4 °C下离心6分钟。
15. 使用真空抽滤器移除上清液，并将细胞沉淀重悬于1 mL 30%等渗密度梯度溶液中。
    注意：配制 15 mL 30% 等渗密度梯度溶液，需混合 4.5 mL 100% 储存密度梯度介质、1.5 mL 10× PBS 和 9 mL ddH₂O。₂O.
16. 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，加入9 mL（全脑）或6 mL（半脑）30%密度梯度溶液。
17. 轻轻倒置试管，以确保充分混匀。
18. 立即以845 x g离心试管 g 在4 °C条件下，以3级加速度和3级制动离心20分钟。
19. 从离心机中轻轻取出离心管，避免振荡，使用连接真空泵的1 mL吸头小心吸除上层髓鞘层。
    注意：此层切勿扰动。残留的任何髓鞘均可能对细胞活性产生不利影响，并干扰后续分析。
20. 吸弃上清液，保留1-2 mL，用至少10 mL冷的HBSS重悬细胞沉淀。
21. 550 × g 离心 g 4 °C下离心6分钟。
22. 用至少7 mL的冷HBSS再洗涤一次。
23. 尽可能吸除上清液，并用100–200 µL流式细胞术缓冲液重悬细胞，用于流式细胞术分析。
    注意：本研究中使用的流式细胞术FACS缓冲液含有0.5% BSA和2 mM EDTA的1× PBS溶液。建议使用96孔V型底板进行细胞染色，以尽量减少洗涤步骤中的细胞损失。
24. 使用各实验室建立的标准方案进行流式细胞术分析¹³.
    1. 简而言之，将80 µL细胞悬液与20 µL抗体混合液加入96孔V型底板中，混匀后于4 °C孵育25分钟。
    2. 用200 µL FACS缓冲液洗涤，然后用100 µL HBSS加细胞活力染色试剂重悬细胞。
    3. 4 °C孵育15分钟后，用FACS缓冲液洗涤，并将细胞重悬于200 µL FACS缓冲液中，用于流式细胞术分析。

2. 小鼠颅骨骨髓单细胞悬液的制备

注意：图2展示了颅骨骨髓分离操作的总体流程。

1. 按照步骤1.4所述对小鼠进行灌注。
2. 将小鼠断头，并在头皮正中做皮肤切口以暴露颅骨。
3. 使用锋利的剪刀从枕骨大孔开始，沿颅骨两侧向前剪开颅骨，然后抬起并移除颅盖骨。
   注意：可从同一只小鼠中获取脑组织，并使用步骤1进行处理，从而实现对脑组织和颅骨骨髓中免疫细胞的联合分析。
4. 在解剖显微镜下，用钝头镊子小心地从颅骨上剥离硬脑膜。
   注意：建议从枕骨边缘开始，缓慢分离并向额部方向逐步推进，操作时由外向内进行。
5. 将颅盖骨置于冰上的培养皿中，并用1 mL移液器以冷PBS冲洗颅盖骨，确保清除其表面的血液残留物。
6. 将颅盖骨转移至另一含有足量新鲜冷PBS的新培养皿中，使其完全浸没。
7. 在冷PBS中，使用无菌剪刀将颅盖骨剪成约3 mm × 3 mm的碎片。
   注意：剪碎方法可能影响颅骨骨髓提取效率。建议采用一致的剪碎方法以减少实验变异。同时，务必剪开颅缝。图2B展示了一种可行的操作方式。
8. 使用18 G针头在500 µL微量离心管底部戳一个小孔。
9. 将此管插入含有20 µL冷PBS的1.5 mL微量离心管中。
10. 将颅盖骨碎片转移至500 µL的上层管中。
    注意：骨碎片应松散填充，以提高提取效率。
11. 在4 °C条件下，以10,000 × g离心30秒。
    注意：为最大化细胞回收率，可用18 G针头轻轻搅动颅盖骨碎片，并重复此步骤1–2次。
12. 将收集的颅骨骨髓细胞重悬于500 µL红细胞裂解缓冲液中，在室温下孵育30秒。
13. 将悬液转移至含有4 mL冷PBS的15 mL离心管中。
14. 在4 °C条件下，以400 × g离心6分钟。
15. 再用5 mL冷PBS洗涤一次。
16. 将细胞沉淀重悬于适当的缓冲液中。用于流式细胞术时，通常使用500 µL FACS缓冲液。
17. 进行流式细胞术分析时，计数细胞，并取约1 × 10⁶个细胞用于抗体染色。
    注意：抗体染色前务必包含Fc阻断步骤¹³。

结果

为了制备小鼠脑组织中的免疫细胞，该方案通常可获得高活力的细胞（84.1% ± 2.3% [均值 ± 标准差]）。这些细胞中约有70%-80%为CD45阳性。在正常小鼠脑组织中，几乎所有CD45⁺细胞均为小胶质细胞（CD45^LowCD11b⁺），符合预期。本方案已在实验室中用于多种应用，包括流式细胞术分析、荧光激活细胞分选（FACS）以及单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析。例如，在卒中模型中进行了流式细胞术分析（图3）。小鼠接受短暂性卒中模型处理，即30分钟线栓法大脑中动脉闭塞（MCAO）¹⁴。卒中后第3天，从小鼠脑组织中制备细胞，并用常见的免疫细胞表面标志物进行染色。门控策略如图3A所示。与先前研究结果一致^13,15，同侧半球中CD45^High细胞显著增加（图3B、C），表明免疫细胞浸润入脑组织。

在颅骨骨髓实验方案中， consistently 获得大量颅骨骨髓细胞（约 2 × 10⁶ 个细胞），且细胞活力优异（93.8% ± 1.8% [均值 ± 标准差]）。如预期所示，这些细胞大多数为 CD45 阳性。为展示该实验方案的应用价值，我们开展了一项比较研究，以表征正常小鼠股骨与颅骨骨髓中的免疫细胞组成（图4）。如代表性图谱所示，股骨与颅骨骨髓的免疫细胞组成相似（图4A、B）。有趣的是，中性粒细胞在股骨中的频率似乎高于颅骨（图4C）。然而，由于本预试验的样本量较小，该发现尚需进一步验证。

图1：脑细胞分离方案的总体流程。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 2：颅骨骨髓细胞分离方案。（A）操作流程概览。（B）推荐的颅骨切割方式。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：脑卒中脑组织中免疫细胞的代表性流式细胞术分析。（A）设门策略示例。图中显示以下免疫细胞群：小胶质细胞（CD45^LowCD11b⁺）、NK 细胞（CD45^HighNK1.1⁺）、中性粒细胞（CD45^HighLy6G⁺）、T 细胞（CD45^HighCD11b^-CD3⁺）和 B 细胞（CD45^HighCD11b^-CD19⁺）。本示例代表脑卒中后第 3 天同侧半球脑组织中免疫细胞的分析结果。（B,C）浸润至脑卒中脑组织的免疫细胞。雄性年轻小鼠接受短暂性大脑中动脉闭塞（MCAO）处理。第 3 天采集脑组织，并分离为左侧（对侧）和右侧（同侧）半球。按照所述方案制备脑细胞，随后进行流式细胞术分析。代表性图示显示同侧半球（CD45^High 细胞）中浸润的免疫细胞增加（B）。定量数据以柱状图展示（C）。细胞数量根据流式细胞术数据中记录的细胞计数和体积计算得出。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。*p < 0.05。请点击此处查看本图的放大版本。

图 4：颅骨骨髓细胞代表性流式细胞术分析。 为便于比较，同时展示了股骨骨髓细胞的分析结果。图中显示以下免疫细胞群体：自然杀伤细胞（NK 细胞，CD45⁺NK1.1⁺）、中性粒细胞（CD45⁺CD11b⁺Ly6G⁺）、T 细胞（CD45⁺CD11b^-CD3⁺）和 B 细胞（CD45⁺CD11b^-CD19⁺）。（A）股骨骨髓的代表性图谱。（B）颅骨骨髓的代表性图谱。（C）股骨与颅骨骨髓免疫细胞组成的比较。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。*p < 0.05。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文介绍了两种简单且有效的方案，用于从脑组织和颅骨骨髓中分离免疫细胞。这些方案能够稳定地获得大量活细胞，适用于多种后续实验，特别是流式细胞术分析。

为了研究多种脑部疾病中的神经炎症，已有许多实验室建立并使用了从脑组织中制备免疫细胞的方案^15,16,17。常见的方法包括基于酶的细胞解离，随后进行梯度分离。通常在这些方案中，脑组织被剪碎后，在含有胶原酶和DNase的消化液中于37 °C轻柔振荡孵育30–60分钟。消化完成后，通过移液或Dounce匀浆等机械方法进一步解离细胞。细胞经细胞筛（例如70 µm筛）过滤后，进行梯度离心（通常使用30%/70%密度梯度液），以去除髓鞘、红细胞和碎片，并富集白细胞。然而，该方法需要在37 °C下进行较长时间的酶消化，可能会显著改变脑内免疫细胞的转录组和蛋白质组。事实上，系统性研究表明，酶解法会引起特定脑细胞转录组和蛋白组型的显著改变¹⁸，这可能导致后续转录组分析（如单细胞RNA测序，scRNA-seq）中出现假象。相比之下，本文报道的方案在整个操作过程中采用低温下的机械解离方法，从而抑制细胞代谢，更好地保持细胞的转录和蛋白质组状态，最大限度地减少潜在的实验假象。在方案优化过程中，我们注意到使用大尺寸Dounce匀浆器对脑组织进行匀浆对于获得较高的细胞得率和较低的细胞死亡率至关重要。在Dounce匀浆过程中，大量存在的细胞外基质、细胞碎片和胞质成分可能对细胞具有毒性。使用过量缓冲液有助于稀释这些有毒物质，从而减轻其有害影响，提高细胞活力。流式细胞术数据显示，采用本方案制备的免疫细胞活力约为85%。此外值得注意的是，仅使用30%密度梯度液进行离心即可有效富集脑免疫细胞并去除髓鞘，这也有助于降低细胞制备的成本。

目前对颅骨骨髓中免疫细胞的研究仍然有限。一种常用的从小鼠颅顶骨分离细胞的方法是将颅骨切割成小块，然后用研杵机械研磨这些骨块⁶。本实验方案采用短暂离心法，该方法改编自已发表的从股骨和胫骨中制备骨髓细胞的方案¹⁹。对于这些长骨，只需截去骨的一端即可通过离心收集骨髓。对于颅骨，则需将其切成若干小块以打开骨髓腔。建议采用一致的切割模式，以获得可重复的细胞计数结果。此外，为了最大限度地回收骨髓细胞，颅骨碎片可在每次离心之间进行混匀，重复离心2–3次。

两种方案均存在局限性。首先，使用30%密度梯度溶液离心可能无法有效去除脑组织中残留的红细胞，这可能是由于灌注不完全所致。此外，若在特定条件下髓鞘结构发生改变，30%的密度梯度溶液可能并非去除髓鞘的最佳浓度，此时需要建立其他密度梯度溶液的工作浓度。其次，尽管流式细胞术分析表明采用所述方案获得的脑免疫细胞具有良好的细胞活力，但其在其他应用中的适用性仍需评估，例如可能使用放线菌素D的转录组学分析。第三，颅骨骨髓的制备仅使用颅顶骨，但需注意的是，免疫细胞也存在于颅骨的许多其他部位。最后，脑膜（尤其是硬脑膜）含有多种免疫细胞，并在脑内稳态及功能障碍中发挥重要作用²⁰。针对脑膜的免疫学分析，可参考其他文献中已发表的方案^17,21,22,23。

综上所述，本文描述了从小鼠脑组织和颅骨中分离免疫细胞的两种可靠方案。这些方案有望用于获取大量高质量的细胞，适用于多种下游应用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 mL 微量离心管	VWR	76332-066
1.5 mL 微量离心管	VWR	76332-068
15 mL 圆锥形离心管	Thermo Fisher Scientific	339651
18 G × 1 英寸 BD PrecisionGlide 针头	BD Biosciences	305195
1× HBSS	Gibco	14175-095
50 mL 圆锥形离心管	Thermo Fisher Scientific	339653
96 孔 V 型底微孔板	SARSTEDT	82.1583
AURORA  流式细胞仪	Cytek bioscience
BSA	Fisher	BP9706-100
CD11b-AF594	BioLegend	101254	1:500 稀释
CD19-BV785	BioLegend	115543	1:500 稀释
CD19-FITC	BioLegend	115506	1:500 稀释
CD3-APC	BioLegend	100312	1:500 稀释
CD3-PE	BioLegend	100206	1:500 稀释
CD45-Alex 700	BioLegend	103128	1:500 稀释
CD45-BV421	Biolegend	103133	1:500 稀释
70 µm 细胞筛	Avantor	732-2758
敷料镊	V. Mueller	NL1410
EDTA	Invitrogen	15575-038
Fc 封闭抗体	Biolegend	101320	1:100 稀释
镊子	Roboz	RS-5047
LIVE/DEAD 可固定蓝色死细胞染色试剂盒	Thermo Fisher Scientific	N7167	1:500 稀释
Ly6G-BV421	BioLegend	127628	1:500 稀释
Ly6G-PerCp-cy5.5	BioLegend	127615	1:500 稀释
NK1.1-APC-cy7	BioLegend	108723	1:500 稀释
Percoll（密度梯度介质）	Cytiva	17089101
磷酸盐缓冲液（10×）	Gibco	70011-044
红细胞裂解缓冲液（10×）	BioLegend	420302
剪刀	SKLAR	64-1250
WHEATON Dounce 组织研磨器，15 mL 规格	DWK Life Sciences	357544