为了研究脑部疾病中的免疫反应，一种常用的方法是分析免疫细胞的变化。本文提供了两种简单且有效的方案，用于从小鼠脑组织和颅骨骨髓中分离免疫细胞。
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本文内容
摘要
摘要
越来越多的证据表明，脑部疾病（如脑缺血和自身免疫性脑脊髓炎）引发的免疫反应不仅发生在脑组织内，也发生在颅骨中。要分析脑损伤（如中风）后脑组织和颅骨骨髓中免疫细胞群体的变化，关键一步是获得足量且高质量的免疫细胞，以用于后续分析。本文提供了两种优化方案，用于从脑组织和颅骨骨髓中分离免疫细胞。这两种方案的优势在于操作简便、快速高效，能够获得大量活细胞。这些细胞适用于多种下游应用，例如细胞分选、流式细胞术和转录组分析。为验证这些方案的有效性，我们对中风后脑组织及正常脑颅骨骨髓进行了流式细胞术免疫表型分析，所得结果与已发表研究的发现一致。
引言
大脑作为神经系统的中枢，受到颅骨的保护。颅骨下方有三层结缔组织，称为脑膜，分别为硬脑膜、蛛网膜和软脑膜。脑脊液（CSF）在蛛网膜与软脑膜之间的蛛网膜下腔中循环，对脑组织起到缓冲作用，并通过类淋巴系统清除代谢废物1,2。这种独特的结构共同为大脑提供了安全且支持性的环境，维持其稳定性并防止潜在损伤。
长期以来，大脑被认为具有免疫豁免特性。然而，随着越来越多的证据表明，除了脑实质中固有的小胶质细胞外，脑的边界区域（包括脉络丛和脑膜）也存在多种多样的免疫细胞，这一观点已部分被放弃3。这些细胞在维持稳态、监测脑健康以及启动对脑损伤的免疫反应中发挥着关键作用。值得注意的是，最近的研究发现颅骨参与脑膜免疫，并可能在脑损伤后参与脑内免疫反应。2018年，Herisson 等人首次发现了一种直接连接颅骨骨髓与脑膜的血管通道，从而建立了白细胞迁移的解剖学通路4,5。随后，Cugurra 等人证明，脑膜中的许多髓系细胞（如单核细胞和中性粒细胞）以及B细胞并非来源于血液6。通过颅骨骨瓣移植和选择性照射等技术，作者提供了有力证据，表明在中枢神经系统（CNS）损伤后，颅骨骨髓是....
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方案
该方案已获杜克大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准。本研究使用雄性C57Bl/6小鼠（3-4月龄；22-28 g）。所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 小鼠脑组织的单细胞悬液制备
注意：图1 展示了脑细胞分离方案的总体流程。
- 麻醉、插管并固定小鼠，操作方法如前所述11.
- 通过皮肤及皮下肌肉层做上腹部切口，小心切开膈肌和肋骨，以打开胸腔。
- 用30 mL注射器吸取冷PBS，然后将其连接到钝头灌注针上 通过 硅胶管。将灌注针小心插入左心室。
- 在右心房处做一个小切口以允许血液流出，随后进行灌注12 以约 10 mL/min 的流速灌注小鼠 3-4 分钟。
注意：为了改善脑组织中的血液清除效果，可考虑增加灌注液体积并添加肝素。 - 处死小鼠，沿头部顶部皮肤正中线做切口以暴露颅骨。
- 使用钝头镊子小心地刮除颅骨上方的结缔组织。
- 使用锋利的解剖剪沿中线及两侧颅骨缝仔细剪开，形成一个骨瓣。
- 轻轻抬起颅骨瓣以暴露....
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结果
为了制备小鼠脑组织中的免疫细胞，该方案通常可获得高活力的细胞（84.1% ± 2.3% [均值 ± 标准差]）。这些细胞中约有70%-80%为CD45阳性。在正常小鼠脑组织中，几乎所有CD45+细胞均为小胶质细胞（CD45LowCD11b+），符合预期。本方案已在实验室中用于多种应用，包括流式细胞术分析、荧光激活细胞分选（FACS）以及单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析。例如，在卒中模型中进行了流式细胞术分析（图3）。小鼠接受短暂性卒中模型处理，即30分钟线栓法大脑中动脉闭塞（MCAO）14。卒中后第3天，从小鼠脑组织中制备细胞，并用常见的免疫细胞表面标志物进行染色。门控策略如图3A所示。与先前研究结果一致13,15，同侧半球中CD45High细胞显著增加（
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讨论
本文介绍了两种简单且有效的方案，用于从脑组织和颅骨骨髓中分离免疫细胞。这些方案能够稳定地获得大量活细胞，适用于多种后续实验，特别是流式细胞术分析。
为了研究多种脑部疾病中的神经炎症，已有许多实验室建立并使用了从脑组织中制备免疫细胞的方案15,16,17。常见的方法包括基于酶的细胞解离，随后进行梯度分离。通常在这些方案中，脑组织被剪碎后，在含有胶原酶和DNase的消化液中于37 °C轻柔振荡孵育30–60分钟。消化完成后，通过移液或Dounce匀浆等机械方法进一步解离细胞。细胞经细胞筛（例如70 µm筛）过滤后，进行梯度离心（通常使用30%/70%密度梯度液），以去除髓鞘、红细胞和碎片，并富集白细胞。然而，该方法需要在37 °C下进行较长时间的酶消化，可能会显著改变脑内免疫细胞的转录组和蛋白质组。事实上，系统性研究表明，酶解法会引起特定脑细胞转录组和蛋白组型的显著改变
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致谢
感谢 Kathy Gage 在编辑工作中的出色贡献。插图 由 BioRender.com 制作 完成。本研究获得了杜克大学医学中心麻醉科以及美国国立卫生研究院（NIH）基金 NS099590、HL157354 和 NS127163 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 mL 微量离心管 | VWR | 76332-066 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | VWR | 76332-068 | |
| 15 mL 圆锥形离心管 | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
| 18 G × 1 英寸 BD PrecisionGlide 针头 | BD Biosciences | 305195 | |
| 1× HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| 50 mL 圆锥形离心管 | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
| 96 孔 V 型底微孔板 | SARSTEDT | 82.1583 | |
| AURORA 流式细胞仪 | Cytek bioscience | ||
| BSA | Fisher | BP9706-100 | |
| CD11b-AF594 | BioLegend | 101254 | 1:500 稀释 |
| CD19-BV785 | BioLegend | 115543 | 1:500 稀释 |
| CD19-FITC | BioLegend | 115506 | 1:500 稀释 |
| CD3-APC | BioLegend | 100312 | 1:500 稀释 |
| CD3-PE | BioLegend | 100206 | 1:500 稀释 |
| CD45-Alex 700 | BioLegend | 103128 | 1:500 稀释 |
| CD45-BV421 | Biolegend | 103133 | 1:500 稀释 |
| 70 µm 细胞筛 | Avantor | 732-2758 | |
| 敷料镊 | V. Mueller | NL1410 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Fc 封闭抗体 | Biolegend | 101320 | 1:100 稀释 |
| 镊子 | Roboz | RS-5047 | |
| LIVE/DEAD 可固定蓝色死细胞染色试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | N7167 | 1:500 稀释 |
| Ly6G-BV421 | BioLegend | 127628 | 1:500 稀释 |
| Ly6G-PerCp-cy5.5 | BioLegend | 127615 | 1:500 稀释 |
| NK1.1-APC-cy7 | BioLegend | 108723 | 1:500 稀释 |
| Percoll（密度梯度介质） | Cytiva | 17089101 | |
| 磷酸盐缓冲液（10×） | Gibco | 70011-044 | |
| 红细胞裂解缓冲液（10×） | BioLegend | 420302 | |
| 剪刀 | SKLAR | 64-1250 | |
| WHEATON Dounce 组织研磨器，15 mL 规格 | DWK Life Sciences | 357544 |
参考文献
- Bohr, T., et al. The glymphatic system: Current understanding and modeling. iScience. 25 (9), 104987(2022).
- Jiang-Xie, L. F., et al. Neuronal dynamics direct cerebrospinal fluid perfusion and brain clearance. Nature. 627 (8002), 157-164 (2024).
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