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利用分裂荧光素酶重组检测法测量活细胞中内质网-线粒体接触

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DOI：

10.3791/66862

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2024年10月11日

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Science Education, College of Medicine, Charles R. Drew University of Medicine and Science

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们建立了一种分裂荧光素酶重组检测方法，用于在活细胞中监测内质网与线粒体之间的接触。利用该方法，我们描述了一种在化学处理条件下，对HEK293T细胞中这些细胞器间偶联水平进行定量测量的实验方案。

摘要

内质网（ER）-线粒体接触位点在细胞健康与稳态中发挥关键作用，例如调节 Ca2+ 和脂质稳态、线粒体动力学、自噬体和线粒体自噬体的生成以及细胞凋亡。内质网与线粒体之间正常偶联的破坏与多种神经退行性疾病相关，包括阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和遗传性痉挛性截瘫。深入探究内质网-线粒体接触失调如何导致细胞死亡，以及恢复这些接触至正常水平是否能够改善神经退行性病变，具有重要意义。因此，改进用于检测此类接触水平的检测方法，将有助于阐明这些疾病的致病机制。最终，建立简单且可靠的检测方法将促进新型治疗策略的开发。本文介绍 一种分裂荧光素酶检测法，用于在活细胞中定量测定内质网-线粒体接触水平。该方法可用于研究这些接触位点的病理生理功能，并可用于高通量筛选中识别其调控因子。

引言

内质网与线粒体之间的相互作用对细胞稳态和存活至关重要1,2,3,4。先前的研究证据表明，内质网-线粒体接触位点的任何类型紊乱或失调均可能促进多种神经退行性疾病、代谢性疾病、心血管疾病以及癌症的发生发展5,6,7,8,9,10。例如，线粒体异常增加Ca2+摄取可导致线粒体通透性转换孔开放，从而引发细胞死亡，这在某些阿尔茨海默病模型中常见5,11。类似地，内质网-线粒体接触减少会导致ATP生成降低 以及Ca2+摄取受损，这在肌萎缩侧索硬化症模型中已有观察5,11,12。随着针对内质网-线粒体接触的研究不断深入，越来越多与疾病相关的蛋白质和基因被发现可能影响这些接触位点。尽管目前已有大量知识和证据揭示了内质网-线粒体接触位点的作用，但仍需大量工作以阐明这些接触如何导致细胞功能丧失并最终引发细胞死亡。

目前已开发出多种方法用于评估两种膜之间的接近程度、结构形态以及细胞器接触位点之间的距离3,4,13。用于监测内质网与线粒体偶联的方法包括基于荧光标记的成像14,15、基于FRET报告分子的成像16以及基于分裂荧光探针的成像17,18，这些方法通常采用落射荧光显微镜和共聚焦显微镜。超分辨率显微镜和原子分辨率显微镜也是精确可视化细胞器间接触的有力工具，但由于需要高度专用的显微镜设备和技术专长，其在接触位点分析中的应用仍有限19。此外，透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）以及其他电子显微技术，如电子断层扫描（ET）和冷冻电子显微镜（cryo-electron microscopy），也常被使用，因为它们能够提供接触位点的高分辨率超微结构图像，而这些信息通常难以通过其他实验方法获得20,21,22。然而，这些基于电镜的方法通量极低，且可能受到化学固定程序的影响。近年来，基于邻近标记的方法也被用于检测接触位点并鉴定新的接触位点蛋白。例如，邻近连接实验（PLA）已被用于量化细胞器间的接近程度23,24，而改良版的抗坏血酸过氧化物酶（APEX）实验则被用于鉴定新的接触位点蛋白25,26。需要认识到的是，上述所有方法在检测细胞器接触方面各有优势和内在局限性。因此，必须结合多种技术手段，才能对细胞器接触位点进行全面深入的解析。

此前，我们已建立分裂型Renilla荧光素酶8重组检测法（split-Rluc检测法），用于监测内质网（ER）与线粒体膜接触水平（图1A）24,26,27。简而言之，将Renilla荧光素酶的两个分裂片段分别与定位于内质网或线粒体的靶向序列偶联。当两者共转染细胞时，酶的两个分裂片段分别表达于内质网或线粒体膜上。当内质网与线粒体彼此靠近时，两个分裂片段相互结合，重构出具有荧光素酶活性的完整酶分子。在构建split-Rluc质粒时，我们以pBAD/Myc-His载体中的Renilla荧光素酶8（Rluc8）作为初始模板27。分裂位点（位于第91与92位氨基酸之间）依据先前报道确定27。对于N端片段（Rluc8的1-91位氨基酸），通过PCR将其DNA序列连接至pcDNA3.1 TOPO载体中FLAG标签的3'端，并融合小鼠AKAP1线粒体靶向序列27。对于靶向内质网的C端片段（Rluc8的92-311位氨基酸），将其编码序列连接至myc标签的5'端以及酵母UBC6内质网定位序列。本研究中，我们对split-Rluc质粒进行了优化，使Renilla荧光素酶的两个分裂片段在同一载体（pCAG）的同一启动子下表达，并在两者之间插入来自Thosea asigna病毒的自剪切肽T2A（2A序列），从而在表达后自动切割为两个独立片段（图1B）。质粒DNA图谱及序列详见补充文件1和补充图S1。利用该系统，我们检测了三种化学物质（抑制参与肌动蛋白聚合的GTP酶）对内质网-线粒体接触的影响。该split-Rluc检测法是一种简单且稳健的检测体系，适用于细胞器间接触调节剂的高通量筛选24。

方案

1. 细胞培养与接种（第1天）

  1. 在含有10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HEK293T细胞（置于100 mm培养皿中），于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中维持培养。
  2. 开始实验前，在显微镜下观察培养皿中细胞的融合度。当细胞融合度达到约80–90%时，吸去培养基，并用10 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）清洗细胞，准备将细胞接种至6孔板中。
  3. 吸去DPBS，加入1 mL含酚红的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液处理细胞。孵育3分钟，随后从培养箱中取出培养皿，加入9 mL完全培养基（含10% FBS的DMEM）以终止胰蛋白酶反应。轻柔吹打数次，确保所有贴壁细胞均被吹下。将细胞悬液转移至50 mL离心管中。
  4. 在室温下以300 × g离心5分钟。吸去上清液，用1 mL新鲜培养基（DMEM + 10% FBS）重悬细胞沉淀。
  5. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
    1. 轻轻涡旋混匀离心管中的细胞悬液，确保细胞分布均匀。立即吸取10 µL细胞悬液转移至1.7 mL微量离心管中，并向同一管中加入90 µL培养基。
    2. 轻柔混匀后，用移液器将10 µL细胞悬液沿盖玻片边缘缓慢加入血细胞计数板的两个计数室中。
    3. 在显微镜下使用10倍物镜对焦血细胞计数板的网格线。聚焦清晰后，使用手动计数器统计其中一个16格区域（4 × 4格）内的细胞数量。重复此操作，直至完成全部四个16格区域的计数。
    4. 取四个角落16格区域的平均细胞数，乘以105，计算出每毫升细胞悬液中的总细胞数。
      注：除使用血细胞计数板外，也可根据仪器制造商的操作说明使用自动细胞计数仪进行细胞计数。
  6. 完成细胞计数后，将细胞以7.5 × 105个/孔的密度接种于6孔板中，每孔加入2 mL培养基。在50 mL离心管中加入所需体积的细胞悬液及13 mL培养基，混匀后将2 mL稀释后的细胞悬液分别加入6个孔中。
    1. 接种前，根据公式C1V1 = C2V2计算每孔7.5 × 105个细胞所需的细胞悬液体积，其中C1为初始细胞浓度（个/mL），V1为所需初始细胞悬液体积，C2为目标细胞密度（个/mL），V2为细胞接种所需的最终体积。
  7. 加样完成后，轻敲培养板各侧，使细胞均匀分布，随后将培养板置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中过夜培养。

2. 聚乙烯亚胺（PEI）介导的细胞转染及转染后细胞接种（第2天）

  1. 从培养箱中取出6孔板，吸除每孔中的原有培养基。每孔加入2 mL新鲜培养基。
  2. 用分裂的片段转染细胞Rluc 质粒 DNA（pCAG-Mito）RlucN-T2A-RlucCER-IRES-mCherry) 溶于TE缓冲液（pH 8.0）中。
    1. 每个孔中，在1.7 mL微量离心管内，将DNA（750 ng）与PEI（DNA/PEI质量比为1:3）加入200 µL DMEM培养基中混匀。迅速在8号档涡旋振荡约2秒，确保充分混合形成复合物。随后，在微型离心机中短暂离心以沉淀液体<3 s。
    2. 将DNA/PEI混合物在室温下孵育15分钟，然后将混合物（逐滴加入）加至含细胞的6孔板培养基表面。轻轻敲击培养板（使混合物均匀分布），随后在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育2 6 小时。
  3. 孵育期间，通过向每个孔中加入70 µL PDL（50 µg/mL，溶于DPBS）来制备多聚-D-赖氨酸（PDL）包被的96孔板，并在37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中孵育2 至少1小时。移除PDL溶液，随后用100 µL DPBS洗涤每个孔2次。第二次洗涤结束后，确保完全移除残留的DPBS。
  4. 转染后6小时，准备将转染后的细胞接种至多聚赖氨酸包被的96孔板中。
    1. 从培养箱中取出含有转染细胞的6孔板，吸除培养基，每孔加入2 mL DPBS洗涤一次。吸除DPBS后，每孔加入350 µL含酚红的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，孵育1–2分钟。为终止胰蛋白酶反应，每孔加入1.7 mL培养基。
    2. 将细胞连同培养基转移至50 mL离心管后，以300 × g 在台式离心机中离心5分钟。吸除培养基，用1 mL新鲜培养基重悬细胞沉淀。使用血细胞计数板对细胞数量进行计数（如步骤1.5所述）。
  5. 将细胞以每平方厘米4 × 10⁴个的密度接种于多聚-D-赖氨酸（PDL）包被的96孔板中4 每孔加入100 µL培养基中的细胞悬液，细胞数量按需确定。具体操作如下：在50 mL离心管中，加入所需体积的细胞悬液（计算方法见下文）以及适量培养基，总体积为12 mL。使用多通道移液器，将100 µL稀释后的细胞悬液加入96孔板的每个孔中。将细胞置于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育18 h。2.
    1. 计算获得 4 × 10 所需的细胞数量4 细胞/孔，使用 C1V1 = C2V2 其中 C1 为初始细胞数量（细胞数/mL），V1 是初始细胞悬液所需的体积，C2 是所需的目标细胞密度（细胞数/mL），以及 V2 是细胞接种所需的最终体积。

3. 活细胞中化学处理及荧光素酶检测（第3天）

  1. 在1.7 mL离心管中，通过将每种储备液（50 mM Rhosin、25 mM Ehop-016和50 mM ZCL278，均溶于DMSO）按1:1,000比例稀释于所需体积的培养基中（50 µL/孔 × 孔数），分别配制50 µM Rhosin（50 mM储备液溶于DMSO）、25 µM Ehop-016（25 mM储备液溶于DMSO）和50 µM ZCL278（50 mM储备液溶于DMSO）三种新鲜溶液。向每种溶液中加入活细胞底物（50 mM储备液溶于DMSO） 海肾 荧光素酶按1:2,000稀释至终浓度为25 µM。使用初始浓度为50 µM的ZCL278培养基溶液，通过系列稀释制备0.5、5和50 µM的ZCL278溶液。
    注意：如果化学孵育时间少于1-1.5小时，可先将细胞与活细胞底物预孵育（对于 海肾 荧光素酶）孵育1-1.5小时，随后对细胞进行各化学物质处理。为优化高通量药物筛选方案，我们同时加入化学物质和活细胞底物。
  2. 从含有转染细胞的96孔板的每个孔中移除培养基，并向每孔加入50 µL化学物与底物培养基的混合液。
  3. 孵育细胞1小时、2小时或5小时后，从培养箱中取出培养板，放入化学发光酶标仪中，检测发光信号。
    1. 开始前，请确保已打开酶标仪电源。启动微孔板读板软件，通过点击新建文件 新建会话. 设置 温度 酶标仪的读数功能 37 °C 通过点击 培养箱，勾选温度选项，并输入 37 °C. 在……之下 板布局，选择该选项 未知 通过点击并拖动来指定需要测量的孔位。
    2. 在……下方 实验方案，点击 发光 并坚持 默认设置设置完成后，将微孔板（不加盖）放入酶标仪中，并选择 运行平板检测. 点击 开始 将出现保存文件窗口。通过重命名文件并点击 保存.
      注意：发光反应将持续进行 >加入活细胞底物后24小时
  4. 读取完成后，移除 从酶标仪中取出板，然后单击 运行平板 在 将培养板放回加湿培养箱中（37 °C，5% CO₂）。2直至下一次读数。
  5. 实验结束后，将发光数据导入绘图软件，以每个变量（如化学物质或浓度）为横坐标（x轴），相对发光单位（RLU）为纵坐标（y轴）作图，并对数据进行分析。

4. 使用其他方法验证分裂-Rluc 检测。

  1. 进行其他实验，如邻近连接实验（PLA）、透射电子显微镜观察以及线粒体钙离子摄取监测，以验证此前所述split-Rluc实验所获得的结果24。

结果

我们采用上述方案检测了三种已知可抑制特定GTP酶的化合物对内质网-线粒体接触水平的影响。CDC42、RHO和RAC是可促进肌动蛋白聚合的GTP酶28，其活性分别可被ZCL278、Rhosin和Ehop-016所抑制24。将转染了分裂-Rluc的HEK293T细胞分别用DMSO（对照）、ZCL278（50 µM）、Rhosin（50 µM）或Ehop-016（25 µM）处理，并在1 h、2 h和5 h时间点进行孵育。通过酶标仪在指定时间点测定分裂-Rluc的活性（图2）。

与对照组 DMSO 处理的细胞相比，Rhosin（RHO GTPase 抑制剂）处理的细胞在处理 1 小时、2 小时和 5 小时时，荧光素酶活性均未表现出显著变化（p > 0.9999，p = 0.6956，p > 0.9999）（图 2）。这些结果表明，Rhosin 不影响内质网与线粒体之间的接触，提示 RHO GTPase 活性不参与调控这两种细胞器之间的接触连接。

相比之下，RAC GTPase 抑制剂 Ehop-016 在处理 1 小时、2 小时和 5 小时时的荧光素酶活性均显著低于 DMSO 处理组（p = 0.0106，p = 0.0009，p = 0.0024）（图 2）。这些数据表明，RAC GTPase 活性对于维持细胞内正常内质网-线粒体相互作用是必需的。

最后，CDC42抑制剂ZCL278在荧光素酶活性上表现出最显著的变化（图2ZCL278处理的细胞与对照DMSO相比，荧光素酶活性显著降低，在所有三个时间点均具有最低的p值，并保持p < 0.0001。 < 0.0001。我们的数据表明，当ZCL278抑制CDC42 GTPase活性时，内质网-线粒体耦合受到显著抑制，这与我们此前使用原始分裂系统的研究结果一致R在分别转染了编码分裂型荧光素酶两部分的两种载体的细胞中进行的荧光素酶检测24.

鉴于ZCL278表现出的显著效果，尤其是与其他GTP酶抑制剂相比，进一步在不同浓度[0.5 µM、5 µM、50 µM]下测试了ZCL278的活性，并以DMSO作为对照。在给药后1 h、2 h和5 h测得的荧光素酶活性显示剂量依赖性反应；其中0.5 µM ZCL278对荧光素酶活性的影响最弱，5 µM的作用更强，而50 µM则表现出对重建酶活性最显著的抑制作用（图3）。综上所述，我们的结果表明，ZCL278以剂量依赖的方式下调分裂型Rluc活性，并且随着时间推移，相较于低浓度，较高浓度的ZCL278（CDC42抑制剂）相对于对照DMSO仍表现出显著的变化。

为了验证我们的分裂-Rluc 检测方法，可采用一些已建立的独立检测手段，如邻近连接实验（PLA）、透射电子显微镜（TEM）以及线粒体钙离子摄取监测（图4 及未显示数据）24。异丙肾上腺素是一种β2肾上腺素受体激动剂，也是我们在内质网-线粒体接触促进剂筛选中鉴定出的化合物之一（图4A），被用于证实分裂-Rluc 在异丙肾上腺素处理后 Luciferase 活性的增加确实是由于内质网与线粒体之间接触增强所致，这一点通过 PLA 信号强度的变化以及线粒体钙离子摄取情况得到了验证（图4B-E）。

分裂型Rluc构建体示意图；荧光素酶活性检测；细胞转染方法；发光强度测定。
图1：分裂型Rluc 重组成像检测。（A） 分裂型RLuc 检测的示意图。当线粒体与内质网之间不存在膜接触时，Mito-RlucN 与 RlucC-ER 无法相互作用，因此无 Rluc8 酶活性。然而，当内质网与线粒体膜发生接触时，Mito-RlucN 与 RlucC-ER 相互作用，恢复完整的酶活性，可通过底物转化为发光信号进行检测。（B） 分裂型Rluc DNA 构建体（pCAG-MitoRlucN-T2A-RlucCER-IRES-mCherry）的示意图。（C） 在 HEK293T 细胞中进行分裂型Rluc 检测的工作流程图。缩写：Mito = 线粒体；ER = 内质网；IRES = 内部核糖体进入位点；rb_glob pA = 兔β-珠蛋白多聚腺苷酸化信号；T2A = 来自Thosea asigna病毒的自剪切肽 2A 序列。请点击此处查看此图的放大版本。

柱状图，不同时间点的药物处理比较，RLU 倍数变化，显著性差异。
图2：分裂-RGTPase抑制剂处理细胞中，与ER-Mito接触水平相对应的luc活性。 （A-C） 荧光素酶活性重建于（A1 h，（B）2 小时，或（C) DMSO（对照）处理后5 h，Rhosin [50 µM]，Ehop-016 [25 µM]，或 ZCL278 [50 µM]处理（每组n=12）。所有数据均采用单因素方差分析（ANOVA）进行多重比较分析。P值表示为p > 0.05（无显著性，ns），p ≤ 0.05（*），p ≤ 0.01（**），p ≤ 0.001（***），p ≤ 0.0001（****）。误差线表示均值 ± 测量标准误。缩写：Mito = 线粒体；ER = 内质网；RLU = 相对光单位。 请点击此处以查看此图的放大版本。

比较DMSO和ZCL278处理1、2、5小时后RLU倍数变化的柱状图；统计分析。
图3：使用ZCL278处理细胞后，通过分裂型Rluc活性检测ER-线粒体接触水平。(A-C) 在加入DMSO（对照）或ZCL278（浓度分别为[0.5 µM]、[5 µM]或[50 µM]）后，于(A) 1小时、(B) 2小时或(C) 5小时检测到的重组荧光素酶活性（每组n = 12）。所有数据均采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行多重比较分析。P值表示为p > 0.05（ns），p ≤ 0.05（*），p ≤ 0.01（**），p ≤ 0.001（***），p ≤ 0.0001（****）。误差条表示均值±测量标准误。缩写：Mito = 线粒体；ER = 内质网；RLU = 相对光单位。请点击此处查看该图的放大版本。

柱状图显示 RLU 倍数变化，显微镜图像显示 PLA 和 Sec61-GFP，钙离子浓度测定
图 4：分裂型验证Rluc 检测 (A) 裂分信号定量分析示例R用化合物筛选发现的11种ER-线粒体接触促进剂药物（包括异丙肾上腺素）处理HEK293T细胞后的luc活性。B) DMSO 或异丙肾上腺素处理的 HeLa 细胞中邻近连接实验的示例1 µM）。PLA信号（红色）表明内质网与线粒体之间存在紧密接触。Sec61-GFP（绿色）：标记内质网；DAPI（蓝色）：细胞核。C) A 中 PLA 信号的定量分析（n = 4 次实验，每次 77–97 个细胞；Mann-Whitney 检验）。(D) 组胺刺激下的线粒体钙离子摄取100 µM）。Mito-R-GECO1 荧光强度变化（取多个 HeLa 细胞的平均值）在 DMSO 或异丙肾上腺素处理的细胞中每 2.5 秒绘制一次。箭头表示组胺添加。E左侧：线粒体钙离子摄取的最大峰值 A非配对双尾 t-检验（n = 10，DMOS；14，异丙肾上腺素）。右侧：线粒体钙摄取速率（如图所示） A；7.5 至 12.5 秒）。Mann-Whitney 检验（n = 12，DMSO；11，异丙肾上腺素）。该图改编自 Lim 等人。24缩写：RLU = 相对光单位；PLA = 邻近连接实验。 请点击此处以查看此图的放大版本。

表1：内质网-线粒体接触点现有技术的总结。 各种方法的优势与局限性列表。请点击此处下载该表格。

补充文件 1：包含质粒 pCAG-MitoRlucN-T2A-RlucCER-IRES-mCherry 的 DNA 序列（PDF 和 GBK 格式）的压缩文件。 请点击此处下载该文件。

补充图 S1：pCAG-MitoRlucN-T2A-RlucCER-IRES-mCherry 质粒图谱。 请点击此处下载该文件。

讨论

我们已采用了一种分裂-海肾 荧光素酶8重组实验（分裂-Rluc 检测）来定量内质网-线粒体耦合水平。在本研究中，我们对原始的分裂型Rluc 报告基因构建体24 通过构建单个载体 pCAG-MitoRlucN-T2A-RlucCER-IRES-mCherry，编码每个分裂片段Rluc 组分（MitoRlucN 和 RlucC内质网（ER）和来自自剪切肽2A的序列 Thosea asigna 病毒，以确保每种分裂型荧光素酶的两半部分表达量相同。作为底物用于 海肾 荧光素酶，而非腔肠素，使用一种改良的活细胞底物（腔肠素的保护性衍生物；参见 材料表) 出于以下原因被选用。首先，与在水环境（尤其是在血清中）会产生自发光的腔肠素不同，这种保护性衍生物在含有10%血清的培养基中产生的自发光极低（通常无法检测），因此其信号与背景之比高于腔肠素所产生的信号。其次，与腔肠素在加入底物后发光强度迅速达到峰值但随即快速衰减不同，该修饰型活体底物在加入底物后约1.5小时达到最高发光强度，并维持该水平 持续超过24小时。反应动力学的这些变化使得在多孔板中检测发光信号更加便捷，对高通量筛选尤为有利。此外，由于保护型底物产生的发光信号在长时间内保持稳定，因此可对同一批样品在多个时间点进行测量，而无需在不同时间点分别制备和检测多组样品（每组样品仅单时间点测量）。

利用这种更新版的分裂-Rluc 构建体，我们检测了RHO、RAC和CDC42 GTP酶是否参与内质网-线粒体接触的形成。我们在表达分裂-Rluc 组分的HEK293T细胞中分别添加了GTP酶抑制剂：Rhosin（RHO抑制剂）、Ehop-016（RAC抑制剂）和ZCL278（CDC42抑制剂）。实验结果显示，ZCL278是抑制内质网-线粒体接触形成的最强效抑制剂，Ehop-016的抑制作用次之，而Rhosin对这些接触无明显影响。这些数据表明，CDC42介导的肌动蛋白聚合（以及在较小程度上RAC介导的肌动蛋白聚合）对于维持细胞内内质网与线粒体之间的接触是必需的，而RHO介导的肌动蛋白聚合可能并不重要。

为确保最大效率，本实验方案中有多个关键步骤必须加以考虑。首先，必须测试转染的质粒用量，因为过量的DNA可能对细胞产生毒性作用。其次，由于细胞数量会显著影响所测得的荧光素酶水平，因此在整个实验过程中应尽量保持细胞密度与方案中所述一致，以确保在检测时细胞达到理想且稳定的80%汇合度。如果在化学物质处理期间细胞达到完全汇合，可能会导致发光信号减弱，因为汇合状态的细胞总体蛋白质合成水平较低。第三，为防止在添加化学物质和底物时细胞脱落，我们使用预先包被多聚-D-赖氨酸（Poly-D-Lysine）的96孔板。第四，本方案中使用的化合物（包括底物）应分装保存于-20 °C或更低温度（如-70 °C），并在使用时立即解冻后直接加入细胞中。最后，由于温度波动可能影响荧光素酶活性，建议优先使用板内圈的孔位，而避免使用外圈的孔。

分裂-Rluc8 检测法提供了一种简便且稳健的方法来测定内质网与线粒体之间的接触，适用于高通量筛选；然而，也存在一些需要注意的局限性。在细胞生理学方面，由于持续过表达构建体DNA，可能导致细胞行为发生改变。目前，我们正在开发带有可诱导启动子的构建体，以应对因持续过表达可能引起的细胞生理变化。此外，当该检测用于筛选目的时，应注意药物可能通过以下间接效应产生假阳性结果：i) 表达水平的变化，ii) 目标蛋白片段在细胞器中定位效率的改变，或 iii) 重组荧光素酶酶活性的变化。由于这些局限性，该检测必须与其他方法联合使用，以进一步验证实验结果。表1列出了多种检测这些接触位点的方法及其各自的优缺点。我们已结合其他方法进行验证，包括但不限于邻近连接实验（PLA）——用于检测蛋白质间的接近性，以及透射电子显微镜（TEM）——可清晰可视化细胞器之间的接触，从而确认分裂-Rluc 检测中相对光单位（RLU）的变化确实源于内质网与线粒体接触位点的改变（图4 和 Lim 等人24）。我们还展示了内质网与线粒体接触的改变与钙离子转移和线粒体分裂等功能参数之间存在相关性（图4 和 Lim 等人24）。为确保药物对分裂-Rluc 活性的影响并非源于分裂-Rluc 基因表达的增加，可在加入药物的同时添加转录或翻译抑制剂，正如我们此前所采用的方法24。

对于在体外培养的分化神经元中应用分裂型Rluc系统（其转染效率较低）的情况，可采用病毒感染（使用表达分裂型Rluc组分的慢病毒）作为替代方法。该方法还可进一步拓展，用于构建筛选系统，即通过病毒感染或CRISPR介导的基因编辑，使细胞（例如人诱导性多能干细胞）稳定表达分裂型Rluc的两个组分——MitoRlucN和RlucCER。然而，在构建稳定表达系统时需注意，可能存在对更耐受分裂型Rluc系统的细胞进行筛选的压力，这类细胞可能无法代表正常的生理状态。这种适应性变化或筛选过程可能引入实验结果的偏差。

总之，尽管存在上述某些局限性，分裂-Rluc 是一种快速、简便且功能强大的检测方法，适用于高通量筛选调控细胞内细胞器间接触的小分子或基因，这一点已在我们先前的药物筛选研究中得到证实24.

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢杰弗里·戈尔登博士（Cedars-Sinai 医疗中心）对本文稿的审阅。本工作部分由国家神经疾病和卒中研究所（NINDS，R01NS113516）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.7 mL 安全密封微量离心管Sorenson16070
6孔板 TC 处理USA ScientificCC7682-7506
10 mL 移液器吸头 OneTipUSA Scientific1110-3700
10 μL 移液器吸头 OneTipUSA Scientific1110-3700
20-200 μL 斜面吸头 OneTipUSA Scientific1111-1210
50 mL 聚丙烯锥形管Falcon352070
96孔翻盖式微量管架ThermoFisher Scientific8770-11
96孔板 TC 处理 USA ScientificCC7682-7596
100 mm x 20 mm TC 处理培养皿USA ScientificCC7682-3394
1250 μL 吸头 OneTipUSA Scientific1112-1720
Centrifuge 5910 Ri - 制冷离心机Eppendorf5943000131
二甲基亚砜，无水，≥99.9%Sigma-Aldrich276855-100ML
DMEM，高糖ThermoFisher Scientific11965092
DPBS，无钙，无镁ThermoFisher Scientific14190144
EHop 016Bio-Techne Tocris6248溶于 DMSO；-70 °C 保存
EnduRen 活细胞底物PromegaE6481分装后于 -70 °C 保存
Eppendorf 2-20 μL 移液器Eppendorf3123000039
Eppendorf Research plus 100-1000 μL 移液器Eppendorf3123000063
Eppendorf Research Plus 1-10 µL 移液器Eppendorf3123000020
Eppendorf Research plus 12通道移液器Eppendorf3125000028
Eppendorf Research plus 200 μL 移液器Eppendorf 3123000055
胎牛血清，经鉴定，符合 USDA 批准地区标准ThermoFisher Scientific10437028
Forma Steri-Cycle CO2 培养箱，184 L，抛光不锈钢ThermoFisher Scientific381
手持计数器Sigma-AldrichHS6594
HEK 293T 细胞ATCCCRL-3216
血细胞计数板 - Neubauer 明线，双计数室LW ScientificCTL-HEMM-GLDR
Invitrogen TE 缓冲液ThermoFisher Scientific8019005
显微镜ZeissAxiovert 25 CFL
小型离心机Benchmark ScientificC1012
适用于 50 mL 锥形管、15 mL 锥形管和微量离心管的多管架Boekel Scientific120008
PEI MAX - 转染级线性聚乙烯亚胺盐酸盐（分子量 40,000）Polysciences24765-100MG
Pipet-Aid XPUSA Scientific4440-0101
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐Sigma-AldrichP6407-5MG
Rhosin 盐酸盐Bio-Techne Tocris5003溶于 DMSO；-70 °C 保存
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红ThermoFisher Scientific25300054
Varioskan LUX 多功能微孔板读板仪ThermoFisher ScientificVL0000D0
涡旋振荡器ThermoFisher Scientific22153658 级
VWR 真空抽吸系统VWR75870-734
ZCL 278Bio-Techne Tocris4794溶于 DMSO；-70 °C 保存

参考文献

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利用分裂荧光素酶重组检测法测量活细胞中内质网-线粒体接触
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