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方法文章

利用分裂荧光素酶重组检测法测量活细胞中内质网-线粒体接触

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⸱

DOI：

10.3791/66862

⸱

2024年10月11日

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Science Education, College of Medicine, Charles R. Drew University of Medicine and Science

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们建立了一种分裂荧光素酶重组检测方法，用于在活细胞中监测内质网与线粒体之间的接触。利用该方法，我们描述了一种在化学处理条件下，对HEK293T细胞中这些细胞器间偶联水平进行定量测量的实验方案。

摘要

内质网（ER）-线粒体接触位点在细胞健康与稳态中发挥关键作用，例如调节 Ca2+ 和脂质稳态、线粒体动力学、自噬体和线粒体自噬体的生成以及细胞凋亡。内质网与线粒体之间正常偶联的破坏与多种神经退行性疾病相关，包括阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和遗传性痉挛性截瘫。深入探究内质网-线粒体接触失调如何导致细胞死亡，以及恢复这些接触至正常水平是否能够改善神经退行性病变，具有重要意义。因此，改进用于检测此类接触水平的检测方法，将有助于阐明这些疾病的致病机制。最终，建立简单且可靠的检测方法将促进新型治疗策略的开发。本文介绍 一种分裂荧光素酶检测法，用于在活细胞中定量测定内质网-线粒体接触水平。该方法可用于研究这些接触位点的病理生理功能，并可用于高通量筛选中识别其调控因子。

引言

内质网与线粒体之间的相互作用对细胞稳态和存活至关重要1,2,3,4。先前的研究证据表明，内质网-线粒体接触位点的任何类型紊乱或失调均可能促进多种神经退行性疾病、代谢性疾病、心血管疾病以及癌症的发生发展5,6,7,8,9,10。例如，线粒体异常增加Ca2+摄取可导致线粒体通透性转换孔开放，从而引发细胞死亡，这在某些阿尔茨海默病模型中常见5,11。类似地，内质网-线粒体接触减少会导致ATP生成降低 以及Ca2+摄取受损，这在肌萎缩侧索硬化症模型中已有观察5,11,12。随着针对内质网-线粒体接触的研究不断深入，越来越多与疾病相关的蛋白质和基因被发现可能影响这些接触位点。尽管目前已有大量知识和证据揭示了内质网-线粒体接触位点的作用，但仍需大量工作以阐明这些接触如何导致细胞功能丧失并最终引发细胞死亡。

目前已开发出多种方法用于评估两种膜之间的接近程度、结构形态以及细胞器接触位点之间的距离3,4,13。用于监测内质网与线粒体偶联的方法包括基于荧光标记的成像14,15、基于FRET报告分子的成像16以及基于分裂荧光探针的成像17,18，这些方法通常采用落射荧光显微镜和共聚焦显微镜。超分辨率显微镜和原子分辨率显微镜也是精确可视化细胞器间接触的有力工具，但由于需要高度专用的显微镜设备和技术专长，其在接触位点分析中的应用仍有限19。此外，透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）以及其他电子显微技术，如电子断层扫描（ET）和冷冻电子显微镜（cryo-electron microscopy），也常被使用，因为它们能够提供接触位点的高分辨率超微结构图像，而这些信息通常难以通过其他实验方法获得20,21,22。然而，这些基于电镜的方法通量极低，且可能受到化学固定程序的影响。近年来，基于邻近标记的方法也被用于检测接触位点并鉴定新的接触位点蛋白。例如，邻近连接实验（PLA）已被用于量化细胞器间的接近程度23,24，而改良版的抗坏血酸过氧化物酶（APEX）实验则被用于鉴定新的接触位点蛋白25,26。需要认识到的是，上述所有方法在检测细胞器接触方面各有优势和内在局限性。因此，必须结合多种技术手段，才能对细胞器接触位点进行全面深入的解析。

此前，我们已建立分裂型Renilla荧光素酶8重组检测法（split-Rluc检测法），用于监测内质网（ER）与线粒体膜接触水平（图1A）24,26,27。简而言之，将Renilla荧光素酶的两个分裂片段分别与定位于内质网或线粒体的靶向序列偶联。当两者共转染细胞时，酶的两个分裂片段分别表达于内质网或线粒体膜上。当内质网与线粒体彼此靠近时，两个分裂片段相互结合，重构出具有荧光素酶活性的完整酶分子。在构建split-Rluc质粒时，我们以pBAD/Myc-His载体中的Renilla荧光素酶8（Rluc8）作为初始模板27。分裂位点（位于第91与92位氨基酸之间）依据先前报道确定27。对于N端片段（Rluc8的1-91位氨基酸），通过PCR将其DNA序列连接至pcDNA3.1 TOPO载体中FLAG标签的3'端，并融合小鼠AKAP1线粒体靶向序列27。对于靶向内质网的C端片段（Rluc8的92-311位氨基酸），将其编码序列连接至myc标签的5'端以及酵母UBC6内质网定位序列。本研究中，我们对split-Rluc质粒进行了优化，使Renilla荧光素酶的两个分裂片段在同一载体（pCAG）的同一启动子下表达，并在两者之间插入来自Thosea asigna病毒的自剪切肽T2A（2A序列），从而在表达后自动切割为两个独立片段（图1B）。质粒DNA图谱及序列详见补充文件1和补充图S1。利用该系统，我们检测了三种化学物质（抑制参与肌动蛋白聚合的GTP酶）对内质网-线粒体接触的影响。该split-Rluc检测法是一种简单且稳健的检测体系，适用于细胞器间接触调节剂的高通量筛选24。

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方案

1. 细胞培养与接种（第1天）

  1. 在含有10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HEK293T细胞（置于100 mm培养皿中），于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中维持培养。
  2. 开始实验前，在显微镜下观察培养皿中细胞的融合度。当细胞融合度达到约80–90%时，吸去培养基，并用10 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）清洗细胞，准备将细胞接种至6孔板中。
  3. 吸去DPBS，加入1 mL含酚红的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液处理细胞。孵育3分钟，随后从培养箱中取出培养皿，加入9 mL完全培养基（含10% FBS的DMEM）以终止胰蛋白酶反应。轻柔吹打数次，确保所有贴壁细胞均被吹下。将细胞悬液转移至50 mL离心管中。
  4. 在室温下以300 × g离心5分钟。吸去上清液，用1 mL新鲜培养基（DMEM + 10% FBS）重悬细胞沉淀。
  5. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
    1. 轻轻涡旋混匀离心管中的细胞悬液，确保细胞分布均匀。立即吸取10 µL细胞悬液转移至1.7 mL微量离心管中，并向同一管中加入90 µL培养基。
    2. 轻柔混匀后，用移液器将10 µL细胞悬液沿盖玻片边缘缓慢加入血细胞计数板的两个计数室中。
    3. 在显微镜下使用10倍物镜对焦血细胞计数板的网格线。聚焦清晰后，使用手动计数器统计其中一个16格区域（4 × 4格）内的细胞数量。重复此操作，直至完成全部四个16格区域的计数。
    4. 取四个角落16格区域的平均细胞数，乘以105，计算出每毫升细胞悬液中的总细胞数。
      注：除使用血细胞计数板外，也可根据仪器制造商的操作说明使用自动细胞计数仪进行细胞计数。
  6. 完成细胞计数后，将细胞以7.5 × 105个/孔的密度接种于6孔板中，每孔加入2 mL培养基。在50 mL离心管中加入所需体积的细胞悬液及13 mL培养基，混匀后将2 mL稀释后的细胞悬液分别加入6个孔中。
    1. 接种前，根据公式C1V1 = C2V2计算每孔7.5 × 105个细胞所需的细胞悬液体积，其中C1为初始细胞浓度（个/mL），V1为所需初始细胞悬液体积，C2为目标细胞密度（个/mL），V2为细胞接种所需的最终体积。
  7. 加样完成后，轻敲培养板各侧，使细胞均匀分布，随后将培养板置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中过夜培养。

2. 聚乙烯亚胺（PEI）介导的细胞转染及转染后细胞接种（第2天）

  1. 从培养箱中取出6孔板，吸除每孔中的原有培养基。每孔加入2 mL新鲜培养基。
  2. 用分裂的片段转染细胞Rluc 质粒 DNA（pCAG-Mito）RlucN-T2A-RlucCER-IRES-mCherry) 溶于TE缓冲液（pH 8.0）中。
    1. 每个孔中，在1.7 mL微量离心管内，将DNA（750 ng）与PEI（DNA/PEI质量比为1:3）加入200 µL DMEM培养基中混匀。迅速在8号档涡旋振荡约2秒，确保充分混合形成复合物。随后，在微型离心机中短暂离心以沉淀液体<3 s。
    2. 将DNA/PEI混合物在室温下孵育15分钟，然后将混合物（逐滴加入）加至含细胞的6孔板培养基表面。轻轻敲击培养板（使混合物均匀分布），随后在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育2 6 小时。
  3. 孵育期间，通过向每个孔中加入70 µL PDL（50 µg/mL，溶于DPBS）来制备多聚-D-赖氨酸（PDL）包被的96孔板，并在37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中孵育2 至少1小时。移除PDL溶液，随后用100 µL DPBS洗涤每个孔2次。第二次洗涤结束后，确保完全移除残留的DPBS。
  4. 转染后6小时，准备将转染后的细胞接种至多聚赖氨酸包被的96孔板中。
    1. 从培养箱中取出含有转染细胞的6孔板，吸除培养基，每孔加入2 mL DPBS洗涤一次。吸除DPBS后，每孔加入350 µL含酚红的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，孵育1–2分钟。为终止胰蛋白酶反应，每孔加入1.7 mL培养基。
    2. 将细胞连同培养基转移至50 mL离心管后，以300 × g 在台式离心机中离心5分钟。吸除培养基，用1 mL新鲜培养基重悬细胞沉淀。使用血细胞计数板对细胞数量进行计数（如步骤1.5所述）。
  5. 将细胞以每平方厘米4 × 10⁴个的密度接种于多聚-D-赖氨酸（PDL）包被的96孔板中4 每孔加入100 µL培养基中的细胞悬液，细胞数量按需确定。具体操作如下：在50 mL离心管中，加入所需体积的细胞悬液（计算方法见下文）以及适量培养基，总体积为12 mL。使用多通道移液器，将100 µL稀释后的细胞悬液加入96孔板的每个孔中。将细胞置于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育18 h。2.
    1. 计算获得 4 × 10 所需的细胞数量4 细胞/孔，使用 C1V1 = C2V2 其中 C1 为初始细胞数量（细胞数/mL），V1 是初始细胞悬液所需的体积，C2 是所需的目标细胞密度（细胞数/mL），以及 V2 是细胞接种所需的最终体积。

3. 活细胞中化学处理及荧光素酶检测（第3天）

  1. 在1.7 mL离心管中，通过将每种储备液（50 mM Rhosin、25 mM Ehop-016和50 mM ZCL278，均溶于DMSO）按1:1,000比例稀释于所需体积的培养基中（50 µL/孔 × 孔数），分别配制50 µM Rhosin（50 mM储备液溶于DMSO）、25 µM Ehop-016（25 mM储备液溶于DMSO）和50 µM ZCL278（50 mM储备液溶于DMSO）三种新鲜溶液。向每种溶液中加入活细胞底物（50 mM储备液溶于DMSO） 海肾 荧光素酶按1:2,000稀释至终浓度为25 µM。使用初始浓度为50 µM的ZCL278培养基溶液，通过系列稀释制备0.5、5和50 µM的ZCL278溶液。
    注意：如果化学孵育时间少于1-1.5小时，可先将细胞与活细胞底物预孵育（对于 海肾 荧光素酶）孵育1-1.5小时，随后对细胞进行各化学物质处理。为优化高通量药物筛选方案，我们同时加入化学物质和活细胞底物。
  2. 从含有转染细胞的96孔板的每个孔中移除培养基，并向每孔加入50 µL化学物与底物培养基的混合液。
  3. 孵育细胞1小时、2小时或5小时后，从培养箱中取出培养板，放入化学发光酶标仪中，检测发光信号。
    1. 开始前，请确保已打开酶标仪电源。启动微孔板读板软件，通过点击新建文件 新建会话. 设置 温度 酶标仪的读数功能 37 °C 通过点击 培养箱，勾选温度选项，并输入 37 °C. 在……之下 板布局，选择该选项 未知 通过点击并拖动来指定需要测量的孔位。
    2. 在……下方 实验方案，点击 发光 并坚持 默认设置设置完成后，将微孔板（不加盖）放入酶标仪中，并选择 运行平板检测. 点击 开始 将出现保存文件窗口。通过重命名文件并点击 保存.
      注意：发光反应将持续进行 >加入活细胞底物后24小时
  4. 读取完成后，移除 从酶标仪中取出板，然后单击 运行平板 在 将培养板放回加湿培养箱中（37 °C，5% CO₂）。2直至下一次读数。
  5. 实验结束后，将发光数据导入绘图软件，以每个变量（如化学物质或浓度）为横坐标（x轴），相对发光单位（RLU）为纵坐标（y轴）作图，并对数据进行分析。

4. 使用其他方法验证分裂-Rluc 检测。

  1. 进行其他实验，如邻近连接实验（PLA）、透射电子显微镜观察以及线粒体钙离子摄取监测，以验证此前所述split-Rluc实验所获得的结果24。

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结果

我们采用上述方案检测了三种已知可抑制特定GTP酶的化合物对内质网-线粒体接触水平的影响。CDC42、RHO和RAC是可促进肌动蛋白聚合的GTP酶28，其活性分别可被ZCL278、Rhosin和Ehop-016所抑制24。将转染了分裂-Rluc的HEK293T细胞分别用DMSO（对照）、ZCL278（50 µM）、Rhosin（50 µM）或Ehop-016（25 µM）处理，并在1 h、2 h和5 h时间点进行孵育。通过酶标仪在指定时间点测定分裂-Rluc的活性（图2）。

与对照组 DMSO 处理的细胞相比，Rhosin（RHO GTPase 抑制剂）处理的细胞在处理 1 小时、2 小时和 5 小时时，荧光素酶活性均未表现出显著变化（p > 0.9999，p = 0.6956，p > 0.9999）（图 2）。这些结果表明，Rhosi...

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讨论

我们已采用了一种分裂-海肾 荧光素酶8重组实验（分裂-Rluc 检测）来定量内质网-线粒体耦合水平。在本研究中，我们对原始的分裂型Rluc 报告基因构建体24 通过构建单个载体 pCAG-MitoRlucN-T2A-RlucCER-IRES-mCherry，编码每个分裂片段Rluc 组分（MitoRlucN 和 RlucC内质网（ER）和来自自剪切肽2A的序列 Thosea asigna 病毒，以确保每种分裂型荧光素酶的两半部分表达量相同。作为底物用于 海肾 荧光素酶，而非腔肠素，使用一种改良的活细胞底物（腔肠素的保护性衍生物；参见 材料表) 出于以下原因被选用。首先，与在水环境（尤其是在血清中）会产生自发光的腔肠素不同，这种保护性衍生物在含有10%血清的培养基中产生的自发光极低（通常无法检测...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢杰弗里·戈尔登博士（Cedars-Sinai 医疗中心）对本文稿的审阅。本工作部分由国家神经疾病和卒中研究所（NINDS，R01NS113516）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.7 mL 安全密封微量离心管Sorenson16070
6孔板 TC 处理USA ScientificCC7682-7506
10 mL 移液器吸头 OneTipUSA Scientific1110-3700
10 μL 移液器吸头 OneTipUSA Scientific1110-3700
20-200 μL 斜面吸头 OneTipUSA Scientific1111-1210
50 mL 聚丙烯锥形管Falcon352070
96孔翻盖式微量管架ThermoFisher Scientific8770-11
96孔板 TC 处理 USA ScientificCC7682-7596
100 mm x 20 mm TC 处理培养皿USA ScientificCC7682-3394
1250 μL 吸头 OneTipUSA Scientific1112-1720
Centrifuge 5910 Ri - 制冷离心机Eppendorf5943000131
二甲基亚砜，无水，≥99.9%Sigma-Aldrich276855-100ML
DMEM，高糖ThermoFisher Scientific11965092
DPBS，无钙，无镁ThermoFisher Scientific14190144
EHop 016Bio-Techne Tocris6248溶于 DMSO；-70 °C 保存
EnduRen 活细胞底物PromegaE6481分装后于 -70 °C 保存
Eppendorf 2-20 μL 移液器Eppendorf3123000039
Eppendorf Research plus 100-1000 μL 移液器Eppendorf3123000063
Eppendorf Research Plus 1-10 µL 移液器Eppendorf3123000020
Eppendorf Research plus 12通道移液器Eppendorf3125000028
Eppendorf Research plus 200 μL 移液器Eppendorf 3123000055
胎牛血清，经鉴定，符合 USDA 批准地区标准ThermoFisher Scientific10437028
Forma Steri-Cycle CO2 培养箱，184 L，抛光不锈钢ThermoFisher Scientific381
手持计数器Sigma-AldrichHS6594
HEK 293T 细胞ATCCCRL-3216
血细胞计数板 - Neubauer 明线，双计数室LW ScientificCTL-HEMM-GLDR
Invitrogen TE 缓冲液ThermoFisher Scientific8019005
显微镜ZeissAxiovert 25 CFL
小型离心机Benchmark ScientificC1012
适用于 50 mL 锥形管、15 mL 锥形管和微量离心管的多管架Boekel Scientific120008
PEI MAX - 转染级线性聚乙烯亚胺盐酸盐（分子量 40,000）Polysciences24765-100MG
Pipet-Aid XPUSA Scientific4440-0101
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐Sigma-AldrichP6407-5MG
Rhosin 盐酸盐Bio-Techne Tocris5003溶于 DMSO；-70 °C 保存
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红ThermoFisher Scientific25300054
Varioskan LUX 多功能微孔板读板仪ThermoFisher ScientificVL0000D0
涡旋振荡器ThermoFisher Scientific22153658 级
VWR 真空抽吸系统VWR75870-734
ZCL 278Bio-Techne Tocris4794溶于 DMSO；-70 °C 保存

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分裂荧光素酶检测内质网-线粒体接触活细胞成像膜接触位点神经退行性疾病高通量筛选线粒体动力学钙稳态发光酶标仪HEK293T细胞
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