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医源性损伤再现：大鼠尿道狭窄建模的电切术技术

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DOI：

10.3791/66864

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2024年10月11日

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1Department of Urology, The Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging, The Fifth Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University

本文内容

摘要

本研究介绍了一种通过电切术损伤大鼠尿道而建立的新型、高效且稳定的尿道狭窄大鼠模型，该模型能有效模拟临床中观察到的医源性损伤。

摘要

尿道狭窄（US）是泌尿外科一种常见的临床疾病，其特点是在所有年龄段中发病率和病理性改变均较高。目前针对尿道狭窄的治疗方法，如尿道扩张术和内镜下尿道切开术，均无法完全治愈该疾病，且复发率和并发症发生率较高。

此外，尿道狭窄（US）的发病机制尚不明确。为了探索其发病机制并开发新的治疗策略，建立一个能够准确反映临床表现的标准化大鼠模型至关重要。本研究介绍了一种使用高频电刀在大鼠中诱导尿道狭窄的简便且可重复的方法。该方法采用设定为单极混合切割模式、功率4 W的电刀进行纵向切口，从而造成显著的尿道损伤。组织病理学分析显示尿道上皮增厚、炎症细胞浸润以及胶原纤维排列紊乱。该模型有效模拟了大鼠尿道内电切术所致的医源性损伤。综上所述，本研究成功建立了一种新型、高效且稳定的大鼠尿道狭窄模型，能够紧密模拟临床情况，为深入研究尿道狭窄的发病机制及开发新的治疗方法提供了有价值的工具。

引言

尿道狭窄（US）是最古老的泌尿系统疾病之一，至今仍广泛存在。近期数据显示，每10万名男性中约有229至627例尿道狭窄患者1。患有尿道狭窄的患者会出现一系列症状，包括下尿路症状2、疼痛3以及性功能障碍4。目前有多种治疗方法可供选择，如尿道切开术、尿道成形术和尿道扩张术5。然而，这些治疗常伴随出血、感染和尿失禁等问题，增加了疾病负担，并表现出不同的复发率6,7。因此，确定最有效的治疗方案仍是研究人员和临床医生面临的重要挑战。

尿道狭窄（US）通常表现为由于尿道黏膜及其周围海绵体组织的纤维化和瘢痕化导致的前尿道管腔狭窄8。尽管该病较为常见，但其病因和发病机制尚不明确，且目前缺乏适用于深入研究的合适动物模型。医源性损伤，尤其是经尿道手术所致的损伤，是当前尿道狭窄的主要原因，占病例总数的41%9。因此，理想的尿道狭窄研究动物模型应能准确模拟临床常见的损伤情况，具有与人类相近的基因组和蛋白质组相似性，并具备良好的稳定性和可重复性。此类模型将极大促进对尿道狭窄发病机制的深入研究，并推动更有效治疗方法的开发。

为了研究常见临床类型的致病过程和机制，已利用大型动物（如兔子10,11、狗12和猪13,14）建立了多种动物模型，所采用的技术包括电凝、电切15以及博来霉素注射16。然而，这些模型常因样本量受限以及与人类存在遗传差异而面临挑战。此外，使用大型动物的成本效益也需考虑；尽管日常护理费用高昂，大型动物术后还存在较高的感染风险，需要大量的术后护理和较高的支出。已有充分文献表明，啮齿类动物在多个器官系统中与人类具有相似的生理和病理特征。最近一项研究显示，啮齿类动物与人类的泌尿道细胞之间存在同源性17。此外，大鼠的购买、饲养和术后护理成本显著低于大型动物18。因此，建立尿道狭窄的大鼠模型被认为是合适的；然而，目前关于此类大鼠模型的建立方法描述尚不充分。

既往研究采用手术器械（如刀片或针头）在大鼠模型中诱导尿道损伤19。该方法可能损伤尿道周围血管，导致明显出血，存在一定风险。此外，这些手术操作具有主观性，可能导致机械性损伤程度不一致，缺乏用于建模的定量标准，从而可能影响后续治疗研究中对尿道修复效果的评估。

鉴于上述考虑，显然有必要开发一种新的美国鼠类模型。为了建立一种高效、经济且稳定的美国模型，我们在研究中采用了一种高频电刀设备。该模型将有助于进一步探究美国的发病机制，并在开展临床试验之前评估新的治疗方法。

方案

本研究使用了二十只6月龄的雄性Sprague-Dawley大鼠，每只体重为400–500 g。所有动物实验均遵循中山大学第五附属医院机构动物护理和使用委员会的指导方针进行（批准编号：00349）。动物饲养于温度和光照条件受控的设施中。尿道狭窄的一个基本特征是尿道内瘢痕组织的形成。根据已确立的瘢痕形成时间线，即通常在损伤后4周内发生，我们将术后4周时尿道内出现可辨识的瘢痕组织作为实验终点。

1. 外科手术器械的准备

  1. 准备以下手术材料：特氟龙涂层导管（0.6 x 1 mm）、可吸收缝线（6-0）、缝合剪、组织镊、持针钳、平头镊、高频电外科设备（图1），包括高频电刀面板、手术电极高频电刀以及肛门导电棒（参见材料表）。
  2. 使用含75%乙醇的酒精棉片清洁手术区域。
  3. 准备以单极电切模式使用高频电刀。
    1. 使用电源线将高频电刀连接至接地的220 V主电源。
    2. 将已灭菌的手控刀柄和导电棒分别插入对应的插孔中（图1C）。
      注意：确保所有电源线均牢固连接，以保障手术安全。

2. 动物准备

  1. 用注射器抽取戊巴比妥钠（60 mg/kg）。
  2. 用惯用手抓住大鼠尾巴，非惯用手固定其耳部和颈部皮肤，以确保大鼠被牢固固定。
  3. 暴露大鼠下腹部，并用浸有75%乙醇的棉球对该区域进行消毒。
  4. 在下腹部腹中线旁约1–2 mm处，以45°角将注射器针头插入腹腔。
    注意：当针头穿透腹膜时，会感到阻力突然消失。
  5. 轻柔回抽注射器活塞，确认注射器内无血液或液体。
  6. 缓慢注射戊巴比妥钠，完成注射后拔出针头，并再次用浸有75%乙醇的棉球对注射部位进行消毒。
  7. 观察大鼠呼吸节律，并捏压其后肢足垫以检查反射。
    注意：在开始手术前，需确认大鼠呼吸平稳且无任何反射。
  8. 挤出红霉素眼膏，用棉签蘸取适量，涂抹于双眼角膜表面，以防止手术过程中角膜干燥。
  9. 确认麻醉成功后，使用电动剃毛器剃除下腹部及会阴部毛发。
  10. 用生理盐水浸湿的纸巾擦拭剃毛区域，清除松动的毛发。
  11. 用浸有碘伏的纱布擦拭该区域两次，以减少皮肤刺激。
  12. 将深度麻醉的大鼠仰卧置于设定为37°C的加热垫上。手术过程中佩戴医用手套，确保无菌操作。

3. 尿道插管与损伤操作

  1. 将导电棒插入大鼠肛门，以建立与高频电刀机的有效闭合回路（图2A）。
  2. 对大鼠进行尿道插管，以辅助定位，并在外科手术后续操作步骤中提供支撑。
    1. 用液体石蜡润滑导尿管。
    2. 挤压阴茎周围皮肤使其从腹部伸出，暴露阴茎。
    3. 使用浸有碘伏的纱布海绵对大鼠阴茎进行消毒。
    4. 用光滑镊子轻轻撑开尿道口，将已润滑的导管插入尿道。
    5. 根据尿道收缩节律，小心地将特氟龙涂层导管插入尿道；避免强行插入（图2B）。
    6. 若遇到阻力，应轻柔地将阴茎向腹侧牵拉，调整其弯曲角度，并继续推进导管进入膀胱，直至尿液流出（图2C）。
    7. 通过确认阴茎与腹部呈约45°角，判断插管成功（图2D）。
  3. 打开高频电刀机，点击高频电刀面板上的按钮，选择单极混合切割模式，并将功率设定为4 W，用于后续逐层电切阴茎组织。
  4. 使切口与导管对齐。按住电外科刀手柄上的黄色按钮，沿导管标记线从阴茎皮肤切至尿道外层，使用电刀进行切割，直至暴露尿道（图3A、B）。
    注意：务必按下用于电切的黄色按钮，而非用于电凝的蓝色按钮。
  5. 继续用电刀在尿道上做0.5 cm的纵向切口，确保横径为0.1 cm，直至可见导管（图3C）。
  6. 使用可吸收缝线（6-0）逐层缝合伤口及浅表皮肤层，可采用连续或间断缝合方式（图3D、E）。
  7. 拔除尿道导管，并复位阴茎（图3F）。
  8. 关闭高频电刀机，并从大鼠肛门中取出导电棒。
  9. 使用酒精（75%乙醇）擦拭布清洁手术器械。

4. 术后护理

  1. 将大鼠置于预热的垫板上（37 °C），并密切监测其从麻醉状态的恢复情况。需仔细观察大鼠的生理状况，包括呼吸节律、体温和意识水平。
    注意：在未观察到大鼠完全恢复前，不得将其放回笼中。
  2. 将大鼠饲养于清洁的笼具中，并在水瓶中加入含吗啡的饮水（0.4 mg/kg），用于术后每日镇痛管理。
  3. 给予非甾体抗炎药（如卡洛芬，0.5 mg/kg，皮下注射），以促进大鼠从术后疼痛中完全恢复。

5. 组织学评估

  1. 手术后四周，通过提起大鼠尾巴诱导排尿反射。将大鼠放入安乐死箱中，打开 CO2 输气管阀门，使用过量 CO2 人道地对大鼠实施安乐死。
  2. 确认大鼠无呼吸、无运动且瞳孔散大后关闭阀门。继续观察大鼠生理状态 2 分钟，以确认安乐死成功。
  3. 将大鼠从安乐死箱中取出。
  4. 使用浸有 75% 乙醇的擦拭巾清洁手术区域及手术器械。
  5. 解剖腹部以观察膀胱充盈情况，并完整取下尿道组织。
  6. 取下尿道后，将大鼠放入密封袋中，并置于 4 °C 冰箱中，交由实验技术人员后续处理。
  7. 对尿道组织进行大体病理学形态学评估，重点关注组织的颜色和表面光滑度。
  8. 使用苏木精-伊红（H&E）染色法对尿道组织进行染色，以观察伤口结构和尿路上皮细胞层。
    1. 将切片浸入二甲苯中进行脱蜡（每次 5 分钟，共 2 次）。
    2. 按顺序使用乙醇对切片进行水化（100% 乙醇 1 次 × 3 分钟，95% 乙醇 1 次 × 3 分钟，85% 乙醇 1 次 × 3 分钟，75% 乙醇 1 次 × 3 分钟）。
    3. 用去离子水清洗切片（2 分钟）。
    4. 使用苏木精对切片染色（10 分钟）。
    5. 用去离子水清洗切片（5 分钟）。
    6. 使用分化液对样本进行分化（40 秒）。
    7. 用去离子水清洗切片（每次 3 分钟，共 2 次）。
    8. 使用伊红对切片染色（2 分钟）。
    9. 按顺序使用乙醇对切片进行脱水（100% 乙醇 1 次 × 3 秒，95% 乙醇 1 次 × 3 秒，85% 乙醇 1 次 × 3 秒，75% 乙醇 1 次 × 3 秒）。
    10. 将切片浸入 100% 乙醇（1 分钟），然后用二甲苯透明化（每次 1 分钟，共 2 次）。
    11. 滴加中性树胶，加盖盖玻片封片。
  9. 对尿道组织进行 Masson 三色染色，以突出显示胶原纤维结构。
    1. 将切片浸入二甲苯中进行脱蜡（每次 5 分钟，共 2 次）。
    2. 按顺序使用乙醇对切片进行水化（100% 乙醇 1 次 × 3 分钟，95% 乙醇 1 次 × 3 分钟，85% 乙醇 1 次 × 3 分钟，75% 乙醇 1 次 × 3 分钟）。
    3. 用去离子水清洗切片（2 分钟）。
    4. 使用 Weigert 铁苏木精溶液对切片染色（5 分钟）。
    5. 用去离子水清洗切片（5 分钟）。
    6. 使用猩红-酸性品红溶液对切片染色（5 分钟）。
    7. 用去离子水清洗切片（每次 3 分钟，共 2 次）。
    8. 使用磷钼酸溶液对切片染色（5 分钟）。
    9. 将切片放入苯胺蓝溶液中（5 分钟），之后弃去溶液。
    10. 冲洗切片，经酒精脱水，并用二甲苯透明化。
    11. 滴加中性树胶，加盖盖玻片封片。
  10. 使用 TGF-β 抗体进行免疫荧光染色，以评估尿路上皮细胞层。
    1. 向压力锅中加入适当的抗原修复缓冲液。将压力锅置于加热板上并调至最大功率加热。
    2. 待液体沸腾后，将切片从自来水中转移至压力锅中。在锅体外表面冲冷水，同时加热切片 10 分钟。
    3. 关闭压力锅，取出切片，并冷却至室温。
    4. 用 PBS 溶液清洗切片。
    5. 使用液态阻断笔标记样本边缘。
    6. 将切片浸入含 0.3% Triton X-100 的 PBS 中 30 分钟。
    7. 在 PBS 中轻轻振荡清洗切片（每次 5 分钟，共 2 次）。
    8. 在室温下用含 10% 山羊血清的 PBS 进行封闭（60 分钟）。
    9. 吸除封闭液，加入一抗，在 4 °C 下孵育过夜。
    10. 用 1× PBS 清洗切片（每次 5 分钟，共 3 次）。
    11. 加入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光标记二抗，进行孵育。
    12. 用 1× PBS 清洗切片（每次 3 分钟，共 3 次）。
    13. 封片并加盖盖玻片。
  11. 使用切片扫描仪配备的 40 倍物镜对染色切片进行数字化扫描。
  12. 使用指定软件（材料表）分析图像，并测量尿路上皮厚度。
    1. 打开软件。
    2. 点击 本地计算机 以选择染色切片图像。
    3. 点击 测量距离 以测量尿路上皮厚度。
    4. 记录尿路上皮厚度的数据。

结果

本研究中所述方案成功在大鼠中建立了稳定的尿道狭窄模型，并表现出高度可重复性。手术平均持续时间为20分钟，操作过程中未出现技术问题。术后4周成功获取了尿道组织标本。

实验组大鼠的膀胱出现过度膨胀的迹象，而对照组大鼠的膀胱则呈空虚状态（图4）。这些观察结果表明，在实验建模后，大鼠的排尿功能出现了显著障碍。

术后四周，实验组伤口部位已形成蜡白色瘢痕组织，凸出于尿道表面(图5B)，而对照组尿道切口区域则呈现光滑、淡红色的正常外观(图5A)。

尿道组织切片经苏木精和伊红（H&E）染色后进行组织学检查，结果显示尿路上皮显著增厚，并伴有淋巴细胞聚集。此外，Masson染色发现明显的红染区域，提示尿道上皮组织出现增生和化生，且胶原纤维排列紊乱（Masson染色的详细图像见补充图S1），表明平滑肌和胶原纤维结构存在异常（图6）。

对冷冻切片进行的免疫荧光分析显示，术后尿道组织中TGF-β表达增加（图7），提示尿道结构的形成与TGF-β表达上调相关。

用于导管和镊子心脏手术设置的外科工具和心电图屏幕。
图 1：建立超声模型所使用的关键器械。（A）特氟龙涂层导管（0.6 × 1 mm）；（B）可吸收缝线（6-0）、组织镊、持针钳和光滑镊子（从左至右）；（C）高频电外科笔和肛门导电棒；（D）高频电刀的控制面板。请点击此处查看该图的放大版本。

大鼠手术操作：导管插入和切口步骤的标注顺序图示。
图 2：手术准备。（A）剃除大鼠下半腹部的毛发，并连接肛门导电杆。（B-D）示意图显示尿道导管在尿道内的放置位置。请点击此处查看该图的放大版本。

用于组织修复的小动物外科手术方法；按顺序展示的实验步骤。
图3：电切术过程。（A）显示在阴茎皮肤上制作一条0.8 cm的纵向切口；（B）暴露尿道；（C）显示通过电切分离尿道壁各层，直至可见尿道内的导管；（D,E）显示移除尿道导管并复位阴茎。请点击此处查看该图的放大版本。

手术技术示意图；组织切口结果特写；活检程序分析。
图 4：大鼠在解剖条件下膀胱的充盈状态。 （A）显示对照组大鼠的空膀胱；（B）显示实验组大鼠的过度充盈膀胱。膀胱位于红色虚线轮廓内。 请点击此处查看该图的放大版本。

比较解剖学：两种实验设置（A和B）中解剖的器官，显示组织结构；实验。
图5：切除尿道样本的大体观察结果。（A）正常尿道组织。（B）尿道瘢痕组织。请点击此处查看该图的放大版本。

组织学组织分析；染色切片，标记的显微成像；以微米为单位的尺寸测量。
图 6：尿道样本组织学分析结果。（A）对照组尿道组织的H&E染色切片（原始放大倍数100倍）。（B）尿道肿块的Masson三色染色切片（原始放大倍数100倍）。（C）正常尿路上皮厚度的放大图及测量数据，厚度为85.9 µm。比例尺 = 20 µm。（D）实验组尿道组织的H&E染色切片（原始放大倍数100倍）。（E）实验组尿道组织的Masson三色染色切片（原始放大倍数100倍）。比例尺 = 100 µm。（F）尿道瘢痕的放大图及增厚尿路上皮的测量数据——231.2 µm。比例尺 = 20 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

多色蛋白质标记实验中显示组织染料分布的荧光显微镜图像。
图7：切除尿道样本的免疫组织化学结果。 TGF-β 抗体标记突出显示尿路上皮细胞；当抗体与细胞结合时发出绿色荧光。(A-C) 显示对照组尿路上皮细胞中的信号强度较低，而 (D-F) 显示实验组尿路上皮细胞中的信号强度较高。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充图 S1：尿道样本Masson染色的完整图像。 （A）对照组的Masson染色结果；（B）实验组的Masson染色结果。 请点击此处下载该文件。

讨论

尿石症对医疗系统造成重大负担，并产生显著的经济影响，对患者的心理和生理健康均产生不利影响20。目前仍需要一种不仅能彻底治愈尿石症，还能有效预防其复发的治疗方法。

在本研究中，我们采用大鼠模型建立了一种简单且可重复的方法，用于模拟患者尿道损伤，随后进行经尿道手术诱导的尿道损伤。大鼠作为动物模型备受青睐，因其成本低、易于操作、具有良好的重复性，并能提供可靠的数据。本研究所使用的大鼠模型相较于其他模型具有多项优势：该模型常用于各类组学分析，且易于管理。此外，啮齿类动物与人类在泌尿道上皮细胞基因表达上的相似性，使得大鼠尿道损伤模型特别适用于深入的研究21。

如图7所示，TGF-β在对照组和实验组的尿道全层均有表达，且实验组中TGF-β的表达水平明显高于对照组。既往研究已证实，损伤后尿道上皮细胞几乎都会发生表型转化，转变为肌成纤维细胞，而这一过程主要由TGF-β驱动。TGF-β通过调控细胞外基质（ECM）的生成、免疫调节、细胞增殖、迁移和分化，在瘢痕形成中发挥重要作用22,23。我们的研究结果表明，TGF-β的过表达可能促进尿道瘢痕的形成，且TGF-β的分泌不仅局限于创面局部的组织细胞，还需要整个尿道的参与。

雄性大鼠尿道直径小且具有曲度，这在建模后检测尿动力学变化方面带来挑战。目前关于评估雄性大鼠排尿功能方法的研究十分有限。在本研究中，我们采用间接方法，通过术后4周评估膀胱充盈状态来观察排尿功能的变化。在刺激排尿反射后，观察暴露的鼠腹部发现，实验组表现出持续的膀胱充盈，提示建模后排尿功能存在显著障碍。这些结果与尿道狭窄患者临床上出现的排尿困难症状一致24。然而，建立可用于雄性大鼠尿液参数生理学研究的方法，例如排尿频率、平均排尿量和排尿效率等，仍然是一个挑战。

高频电刀的工作模式和功率设置对手术损伤程度具有重要影响。本研究介绍了一种手术技术，可确保在大鼠中建立尿道狭窄模型时产生适当的损伤程度，并确定高频电刀的适宜功率为4 W。目前构建大鼠尿道狭窄模型最常用的方法是使用针头或手术刀片进行切口25。然而，由于大鼠尿道直径小且表面光滑，使用手术刀片容易导致持续性出血，可能无意中损伤周围血管。

高频电刀通过向组织施加稳定且可调节的电流，实现止血与切割同步进行，显著提高了手术的稳定性和操作便利性。此外，功率参数的可调控性使得对组织损伤程度的评估更为量化和客观。

理想的实验方案应能持续产生大小和深度均一的尿道损伤。本研究选用单极混合切割模式诱导尿道损伤。与主要导致液体成分汽化、组织干燥凝固以及血管封闭而无组织破裂的电凝模式（易导致组织快速炭化和粘连）不同，切割模式可对阴茎组织进行精确的逐层切开。尽管电凝模式在兔尿道狭窄模型中应用较为普遍，但需额外步骤，例如将阴茎与阴茎骨分离，并使用其他手术器械进行切开26，这会增加动物的创伤和并发症风险；而单极混合切割模式可直接切开包皮以暴露尿道，从而提高操作效率，并最大限度减少对实验动物的创伤。

先前的研究未详细说明功率设置，因为该参数通常取决于实验动物的体重以及电刀与组织之间的接触面积。本研究中的实验对象为6月龄、体重在400 g至500 g之间的SD大鼠。针对这些条件，确定的最佳功率范围为4-7 W，此功率可精确控制切口的大小和深度。我们建议操作者在首次使用高频电刀建立超声大鼠模型时，从较低的功率开始，根据需要进行调整，以找到不同条件下最合适的功率值。

此外，手术前对大鼠尿道进行插管是关键步骤之一。当导管正确置入膀胱时，表明插管成功。尽管导管仅作为临时支架，但它必须维持尿道的位置，并有助于识别手术部位。雄性大鼠的尿道直径相对较小，包皮与阴茎组织之间的空间有限，因此容易误将导管插入错误的开口，可能使后续操作复杂化。当有尿液流出时，可确认导管已正确放置，表明其已牢固地置于膀胱内。此外，插管后的阴茎应保持45°角，以增强导管在尿道内的稳定性，并便于手术操作。

综上所述，本研究展示了一种在大鼠中建立尿道狭窄模型的新型、高效且经济的方法。该方法具有操作简便、成功率高和稳定性好的特点，为研究多种尿道狭窄创新疗法提供了有价值的工具。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由广东省自然科学基金（编号：2019A1515012116 和 2022A1515012559）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
可吸收缝合线（6-0）KERONG COMPANYKR2230814
动物手术垫广东省生物医学成像重点实验室提供NA
CaseViewer 2.43DHISTECH Ltd.
卡洛芬Sigma-AldrichMFCD00079028
CoraLite488 标记山羊抗兔 IgG(H+L)ProteintechSA00013-2
H&E 染色试剂盒Abcamab150669
 高频电外科设备北京泰科诺尔科技有限公司ES-100v
Masson 染色试剂盒MerckHT15
持针钳RWD 生命科学S15001-11
石蜡油NANA
平头镊RWD 生命科学F13019-12
戊巴比妥钠广东省生物医学成像重点实验室NA
Sprague–Dawley 大鼠广东省医学实验动物中心GDMLAC-035
缝合剪RWD 生命科学S15001-11
特氟龙涂层导管（0.6 mm × 1 mm）DGZF 新材料公司NA
TGF Beta 1 多克隆抗体Proteintech21898-1-AP
组织剪RWD 生命科学S13029-14

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