利用微流控电喷雾技术制备含不同金属离子的交联海藻酸钠微球

摘要

本方案描述了利用微流控装置制备由不同金属离子交联的海藻酸钠微球，用于药物载体设计。同时研究了这些微球的抗菌性能和缓释药物特性。

摘要

微球是微米级颗粒，可通过物理包埋或在聚合物表面及内部吸附的方式负载药物，并实现药物的缓慢释放。在生物医学领域，由于水凝胶微球能够减少给药频率、降低副作用并提高患者的依从性，其作为药物载体的应用已得到广泛研究。海藻酸钠（ALG）是一种天然线性多糖，具有三种主链糖苷键结构。该聚合物的每个单元上均含有两个辅助羟基，具备醇羟基的化学特性。合成的ALG单元可与金属离子发生化学交联反应，形成聚合物堆叠的交联网络结构，最终生成水凝胶。利用ALG的离子交联特性，可通过简单工艺制备水凝胶微球。本研究采用微流控电沉积策略制备了基于ALG的水凝胶微球（ALGMS）。由于对微流控电喷雾流的精确控制，所制备的水凝胶微球尺寸均匀、分散性良好。通过结合微流控技术与高电场的微流控电喷雾方法，制备了由不同金属离子交联的ALGMS，并对其抗菌性能、缓释药物能力及生物相容性进行了研究。该技术在先进药物研发与生产中具有良好的应用前景。

引言

药物递送系统是生物组织工程领域的一个研究热点，旨在提高药物递送的效率和疗效，同时减少不良反应和副作用¹。在众多递送系统中，水凝胶微球因其良好的生物相容性、可调控的机械性能以及功能可塑性，成为最常用的药物负载与递送载体之一²。水凝胶微球可用于药物的缓释和控释，对药物具有良好的保护作用，能够避免或最小化药物在其他组织中的非特异性效应，并实现向特定组织结构的靶向递送³。因此，水凝胶微球已成为一种新型高效的药物递送系统，相关研究正逐步兴起⁴。

水凝胶微球通常由可生物降解的材料合成，包括多糖、蛋白质和天然聚合物⁵。其中，海藻酸钠（ALG）是一种从海洋褐藻中提取的生物相容性好、可生物降解的多糖⁶。其分子链上含有游离的羟基和羧基，可与大多数二价或多价阳离子交联，形成具有三维网络结构的不溶于水的水凝胶⁵。ALG形成的水凝胶微球在中性和碱性溶液中可转变为带负电荷的聚电解质。负电荷之间的排斥作用导致微球溶胀，从而释放出包封的活性成分或药物。这些特性使得ALG微球被视为有前景的药物载体，广泛应用于药物负载与可控释放⁷。

制备水凝胶微球的方法有多种。传统的海藻酸盐微球（ALGMS）制备方法通常包括溶胶-凝胶法或乳液-溶胶法。这些方法通过沉淀、共沉淀以及凝胶化反应等步骤，获得目标微球⁸。近年来，随着微流控技术的不断发展，微流控电喷雾法逐渐成为一种高效且精确的微球制备方法⁹。该方法利用微流控技术将聚合物溶液通过微细喷嘴进行电喷雾，在后续的固化或交联过程中形成微米级液滴和微球¹⁰。与传统方法相比，微流控电喷雾可通过调节溶液流速、电压和喷嘴尺寸等参数，精确控制微球的粒径和形貌¹¹。同时，该方法可实现微球的高速连续制备，提高制备效率，并保持温和的反应条件。此外，ALGMS还可被设计为具有多种功能，例如负载控释药物或催化剂，从而便于其在多个领域的应用。

本文介绍了一种利用微流控电喷雾法制备海藻酸盐（ALG）微球的实验方案。该过程包括将ALG溶液通过微流控装置并施加电喷雾，生成的液滴被收集于含有不同金属离子（Ca²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺和Fe³⁺）的溶液中，以引发交联反应。该反应可提高微球的稳定性和黏附性，并赋予其不同的功能特性。该方法操作简便，所合成的微球在形态上表现出良好的粒径均一性。此外，我们还研究了其抗菌性能、缓释药物能力以及生物相容性。本方案将有助于后续的药物开发与生产。

方案

实验所用血液取自体重为20-25 g、约7周龄的SPF级雌性BALB/c小鼠。所有动物护理和实验程序均经浙江树人学院动物实验伦理委员会批准。

1. 溶液配制

1. 称取海藻酸钠（ALG），加入超纯水中，在50 °C水浴中搅拌溶解，配制成2%的ALG溶液。
2. 分别用超纯水配制质量分数为5%（或摩尔浓度为0.3 M）的CaCl₂、FeCl₃、ZnSO₄和CuSO₄溶液。将每种溶液分别倒入收集皿中。

2. 微流控电喷雾装置

1. 取一根玻璃毛细管，将其置于本生灯火焰上加热软化，然后拉伸至不同直径（50 µm–500 µm）。使用玻璃切割器切下细端，并用高质量碳化硅砂纸轻轻打磨尖端开口。清洗后，将毛细管较粗的一端连接至一段长导管，导管另一端连接分配针头和一个5 mL注射器（补充图1）。
   注意：玻璃管切割处的锐边难以插入软管；因此，应将切口在火焰边缘加热使其边缘圆滑。
2. 将注射器固定在微流控注射泵上，并将毛细管一端固定于夹持器中。将高压电源的红色高压输出夹连接至注射器的分配针头，并将银色夹子置于收集液中。此装置构成一个简单的微流控电喷雾装置（图1A）。
   注意：应使毛细管垂直于实验台放置。

3. ALG 微球的制备

1. 将含有不同金属离子的独立收集皿直接置于毛细管下方。打开微流控注射泵，选择快速前进以用海藻酸钠（ALG）预润管路，然后设定合适的流速（2 mL/h）。
2. 打开高压电源开关，旋转旋钮调节至合适的电压（5–7 kV）。
3. 向每个90 mm的培养皿中加入20 mL溶液，用于收集海藻酸钠微球，从而形成与不同金属离子交联的ALGMS（图1B）。
4. 在电场和重力作用下，海藻酸钠在不同离子收集溶液中数秒内形成微球。用无菌移液器吸取微球，转移至各自的1.5 mL离心管中，得到Zn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺和Fe³⁺交联的海藻酸钠水凝胶微球（图1C）。标记Zn-ALGMS、Ca-ALGMS、Cu-ALGMS和Fe-ALGMS离心管。
   注意：通过调节电压、针尖直径、流速和溶液浓度等参数，可获得不同直径的微球。
5. 取少量制备好的微球，尽可能均匀地分散于PBS中，置于显微镜下观察成像。
6. 在同一组微球中随机选取10个观察视野，将待测图像导入ImageJ软件，将图像转换为适当的灰度模式，利用阈值分割技术准确定义目标颗粒的区域，并启动颗粒分析功能，使ImageJ能够识别并测量目标颗粒。获取微球数据后，将数据导入Origin软件进行分析和粒径分布绘图。

4. 抗微生物性能测试

1. 使用液体LB（Luria-Bertani）培养基，制备初始细菌浊度为0.2 mcF的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）各5 mL的菌悬液。
2. 将每种细菌溶液各10 mL分别加入4个独立的15 mL无菌离心管中。然后，向每个离心管中分别加入0.5 mL的Zn-ALGMS、Ca-ALGMS、Cu-ALGMS和Fe-ALGMS ALG，置于37 °C、200 rpm的恒温摇床中振荡培养12小时。对照组加入等量生理盐水。
3. 用无菌水将每种细菌溶液稀释10⁵倍。取200 µL菌液，用无菌玻璃涂布棒均匀涂布于LB固体培养基表面。
4. 迅速而均匀地将菌液涂布于平板表面，避免在同一区域来回涂布。随后将平板置于37 °C培养箱中培养12小时，观察各组菌落生长情况。
   注意：所有无菌操作均应在酒精灯附近进行。微生物培养容器、接种工具及培养基均需灭菌处理。

5. 药物释放测试

1. 为评估不同微球的药物释放能力，采用牛血清白蛋白（BSA）作为负载的模型药物。将每种微球（Ca-ALGMS、Cu-ALGMS、Zn-ALGMS 和 Fe-ALGMS）各 500 µL 加入 1 mg/mL 的 BSA 悬液中，孵育 24 小时。
2. 进行药物释放实验时，将每种饱和样品加入 5.0 M 磷酸盐缓冲液（PBS；pH 7.4）中，在 37 °C 下以 80 rpm 持续振荡 15 分钟。
3. 在 1、3、6、12、24、36 和 48 小时时间点，取 100 µL 溶液，并更换等体积的新鲜缓冲液。
4. 按照试剂盒说明书，使用 BCA 试剂盒在特定时间点测定上清液中的蛋白质浓度。通过酶标仪定量检测释放的药物，获得相应的吸光度值，并根据标准曲线将测定值转换为实际药物浓度。使用以下公式计算药物释放率：
   药物释放百分比 = （特定时间点释放的药物浓度 / 初始药物浓度）× 100%
5. 在规定时间间隔，从每个孔中移除等体积的 PBS，并补充等体积的新鲜培养基。

6. 溶血试验

1. 将制备好的Ca-ALGMS、Cu-ALGMS、Zn-ALGMS和Fe-ALGMS置于PBS中，于37 °C孵育24小时，制备孵育溶液。
2. 通过眼球取血法采集健康 BALB/c 小鼠的全血，收集至含有柠檬酸钠的抗凝管中。充分涡旋混匀后，于 1509 x g 离心 g 15分钟，以获得红细胞。
3. 用 PBS 洗涤红细胞 2 至 3 次，并用 PBS 配制 10% 的红细胞悬液。
4. 不同ALGMS的制备：取实验组各500 µL微球，加入1 mL超纯水（ddH₂O）₂O）作为阳性对照组，1 mL PBS 溶液作为阴性对照组，每组分别与 20 µL 血细胞溶液混合。
5. 在37 °C下孵育样品4小时，然后以1509 x g离心 g，15 分钟。将上清液保留备用，并在溶血后拍摄各组红细胞的照片。
6. 以阳性对照组溶血率为100%，阴性对照组溶血率为0%，测定各组上清液的吸光度值，并按以下公式计算溶血率：
   溶血率 (%) =（各组上清液的吸光度值 -
   （蒸馏水单独的吸光度值）/（阳性对照组吸光度值－蒸馏水单独的吸光度值）× 100

7. 细胞生物相容性测试

1. 用 PBS 将不同的 ALGMS 清洗 2 次，置于 5 mL 培养皿中静置 15 分钟，弃去上清液。
2. 将不同的 ALGMS 分别加入含有 10% FBS 的完全培养基（DMEM）中，每份 0.2 mL，于 37 °C 培养 24 小时，过滤溶液以获得浸提液。
3. 在 24 孔板中将 NIH3T3 细胞培养至约 70% 的细胞密度，用微球浸提液处理 NIH3T3 细胞，再继续用完全培养基培养 24 小时。
4. 移除细胞培养基，并用 PBS 洗涤细胞。
5. 使用 Calcein-AM/PI 检测法评估细胞活力。取 2.5 µL Calcein-AM 溶液（4 mM）和 12.5 µL PI 溶液（2 mM），加入 5 mL 的 1× PBS 中，充分混匀，配制成含 2 µM Calcein-AM 和 5 µM PI 的工作液。
6. 将工作液以每孔 500 µL 加入已接种细胞的培养板中，于 37 °C 避光孵育 15 分钟，随后在倒置荧光显微镜下观察并拍照。每组设置三个重复。
7. 根据以下公式计算细胞活力：
   细胞活力（%）= 活细胞数 /（活细胞数 + 死细胞数）

结果

不同金属离子交联的ALGMS的表征
Ca-ALGMS、Cu-ALGMS、Zn-ALGMS和Fe-ALGMS的光学形貌如图2所示，表现出良好的球形度、光滑的表面、均匀的粒径分布（补充图2）以及优异的单分散性。我们进一步采用扫描电子显微镜（SEM）和能谱分析（EDS）进行微观表征。如图3所示，微球整体呈球形，具有明确的圆整度。Zn-ALGMS的表面分布不均，显得更粗糙，并伴有大量褶皱。我们通过能谱分析测定凝胶中参与交联反应的金属离子含量分布。值得注意的是，通过调节收集距离、凝胶浓度和电场电压等参数，可调控微球的尺寸¹²。在本方案中，通过调整微流控装置的参数和液体浓度，可根据具体需求轻松获得不同尺寸的微粒。

抗菌性能的评估
我们采用平板法评估了不同微球的抗菌能力，如...

讨论

在本实验方案中，我们介绍了一种基于微流控电喷雾技术制备海藻酸盐微球（ALGMS）的方法。该方法操作简便，可制备出大量形态均匀、圆整度高且直径可控的微球。该技术为研究人员提供了便利，有助于推动水凝胶微球的研究与应用。此外，通过与不同金属离子交联，提高了ALGMS的稳定性和生物活性。在抗菌实验中，Cu-ALGMS和Zn-ALGMS均表现出显著的抑菌效果。

水凝胶微球是一类具有优异可塑性的柔性微结构，通过特定的材料选择和结构设计可实现有效的药物递送。海藻酸盐是一种在温和条件下即可发生凝胶化的天然多糖，具有良好的生物相容性、可生物降解性且无毒。微米级海藻酸钠微球已广泛应用于生物化学与生物医学领域，包括药物研究、药物递送及组织工程。在药物递送应用中，海藻酸钠微球的一个关键优势在于其能够实现药物的持续释放，从而在较长时间内维持活性药物成分的高浓度¹⁴。我们的持续释药实验表明，具有不同离子交联方式的海藻酸钠微球（ALGMS）均具备持续释药能力，可用于药物递送应用。

水凝胶微球的常见制备方法包括...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
120目筛网	Solarbio,中国	YA0946
酒精灯	Solarbio,中国	YA2320
BALB/c小鼠	吴康生物科技,中国
双辛可宁酸检测试剂	迈伦生物,中国	MA0082
牛血清白蛋白	乐邦,中国	9048-46-8
CaCl2 粉末	阿拉丁,中国	10043-52-4
Calcein-AM/PI	百奥锐,中国	BL130A
离心管	康宁,美国	430290
CuSO4 粉末	金鑫越化工,中国	7758-99-8
DMEM	吉百利,中国	C11995500BT
FeCl3 粉末	阿拉丁,中国	7705-08-0
胎牛血清	哈卡塔,中国	HN-FBS
玻璃试管	赛多利斯,德国	CC0028
光学显微镜	Evidentscientific,日本	BX53(LED)
微流控注射泵	龙泵,英国	LSP01-3A
NIH3T3	海吉科,中国	TCM-C752
培养皿	赛默飞,美国	150464
磷酸盐缓冲液	赛默飞,美国	3002
扫描电子显微镜	赛默飞,美国	Axia ChemiSEM
海藻酸钠粉末	北化百灵,中国	Y13095
ZnSO4粉末	金鑫越化工,中国	7733-02-0