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利用干细胞递送开发脊髓损伤的联合治疗策略

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DOI：

10.3791/66872

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2024年6月7日

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

本文内容

摘要

本研究开发并表征了可模拟神经功能的复合水凝胶，可用于研究并利用脂肪来源干细胞在脊髓损伤修复中的促再生行为。

摘要

创伤性脊髓损伤（SCI）会导致损伤部位以下出现永久性的感觉运动功能缺损。该疾病影响了美国约25万人，构成了难以估量的公共卫生问题。尽管已有研究致力于开发有效的治疗方法，但由于损伤部位的复杂性，脊髓损伤目前仍被认为无法治愈。研究人员正在探索多种策略，包括药物递送、细胞移植和可注射生物材料，但单一策略在促进再生方面的疗效有限。因此，近年来组合疗法受到关注，因其能够针对损伤的多方面特征进行干预。已有研究表明，细胞外基质（ECM）可提高细胞移植治疗SCI的效果。基于此，本研究开发了由脱细胞脊髓（dSCs）和脱细胞坐骨神经（dSNs）以不同比例组成的三维水凝胶，并对其进行了表征。对dSCs和dSNs的组织学分析证实，脱细胞过程有效去除了细胞和核成分，同时保留了天然组织的结构架构。随后，制备了不同体积比的复合水凝胶，并对其浊度、凝胶动力学、力学性能以及包埋的人脂肪源性干细胞（hASC）的存活率进行了分析。不同比例的水凝胶与脱细胞脊髓基质在力学性能上未见显著差异。包埋于水凝胶中的人ASCs在14天的培养期间保持良好存活状态。本研究提供了一种构建组织工程化组合型水凝胶的方法，该水凝胶可呈现神经特异性的细胞外基质及具有促再生能力的间充质干细胞。该平台有望为未来脊髓损伤后的神经再生策略研究提供新的见解。

引言

约有29.6万人遭受创伤性脊髓损伤（SCI）的困扰，美国每年新增约18,000例SCI病例 1。创伤性SCI通常由跌倒、枪伤、交通事故和体育活动引起，常导致损伤部位以下感觉运动功能的永久性丧失。每位患者的SCI治疗终身费用估计在100万至500万美元之间，且预期寿命显著缩短1。然而，由于损伤后复杂的病理生理变化，SCI仍未能被充分理解，且基本无法治愈2。已有多种治疗策略被研究，包括细胞移植和基于生物材料的支架。尽管细胞和生物材料移植已显示出一定潜力，但SCI的多因素特性提示联合治疗策略可能更具优势3。因此，许多联合策略已被探索，并显示出优于单一组分的治疗效果。然而，仍需进一步研究以开发可用于递送细胞和药物的新型生物材料3。

构建天然水凝胶的一种有前景的方法是组织脱细胞化。脱细胞化过程利用离子型、非离子型、物理以及组合方法，去除全部或大部分细胞和核酸物质，同时保留细胞外基质（ECM）成分。通过去除全部或大部分细胞成分，ECM来源的水凝胶在植入或注射后对宿主的免疫原性更低4。为评估脱细胞组织的质量，需测量多个参数：细胞/核酸成分的去除程度、机械性能以及ECM的保留情况。为避免不良免疫反应，已确立以下标准：1）每毫克ECM干重残留双链DNA（dsDNA）少于50 ng；2）DNA片段长度小于200 bp；3）使用4'6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色后几乎或完全不可见细胞核物质5。机械性能可通过拉伸、压缩和/或流变学测试进行量化，其数值应与原始组织相近6。此外，可通过蛋白质组学或针对脱细胞组织主要成分的定量检测来评估蛋白质的保留情况，例如脊髓组织中的层粘连蛋白（laminin）、糖胺聚糖（GAG）和硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPG）7,8。经验证的ECM来源水凝胶可重新接种不同类型的细胞，以促进基于细胞的治疗9。

多种细胞类型已被用于脊髓损伤（SCI）修复研究，例如施万细胞、嗅鞘细胞、骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）以及神经干细胞/祖细胞10,11,12。然而，这些细胞的临床应用受到诸多限制，包括伦理问题、与邻近细胞/组织整合能力差、缺乏高产量的组织来源、无法自我更新和/或增殖能力有限13,14,15。与这些细胞类型不同，人脂肪来源的间充质干细胞（hASCs）是一种颇具吸引力的候选细胞，因其可通过抽脂术以微创方式轻松分离，并能获得大量细胞16。此外，hASCs 能够分泌具有神经保护、促血管生成、伤口愈合、组织再生以及免疫抑制潜能的生长因子和细胞因子17,18,19,20,21。

如前所述，已有大量研究22,23,24开展，从中获得了许多认识，但脊髓损伤（SCI）的异质性特征限制了这些研究在促进功能恢复方面的疗效。因此，研究人员提出了联合治疗策略，以提高脊髓损伤的治疗效果。本研究通过结合脱细胞脊髓和坐骨神经，开发了用于人脂肪源性干细胞（hASC）三维（3D）培养的复合水凝胶。通过组织学和DNA分析证实了脱细胞过程的成功，并通过凝胶动力学和压缩测试对不同比例的神经复合水凝胶进行了表征。研究了hASCs在神经复合水凝胶中的存活率，以证明该水凝胶可作为三维细胞培养平台使用。

方案

猪组织为商业途径获得，因此无需动物伦理委员会批准。

1. 猪脊髓的脱细胞处理（预计时间：5 天）

注意：采用先前已建立的方案并加以修改进行脱细胞化处理25,26。除非另有说明，所有操作均应在室温下的无菌生物安全柜中进行。所有溶液均应使用瓶顶过滤器（0.2 µm 孔径）无菌过滤至已灭菌的瓶子中。需在 37 °C 下进行的步骤可在设定为 37 °C 的培养箱或洁净烘箱中完成。

  1. 脱细胞溶液的制备
    注意：所有溶液均按1 L计算。用户可根据实验需求调整最终所需体积。
    1. 将500 mL的0.05%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）与500 mL磷酸盐缓冲液（PBS）混合，配制成0.025%胰蛋白酶/EDTA溶液。
    2. 将300 mL的10% Triton X-100与700 mL PBS混合，配制成3% Triton X-100溶液。将0.56 g NaCl、1.31 g NaH2PO4H2O和10.85 g HNa2O4P·7H2O溶于1 L去离子水中，配制成100 mM Na/50 mM磷酸盐缓冲液。
    3. 将32.4 g蔗糖溶于1 L去离子水中，配制成1 M蔗糖溶液。将40 g脱氧胆酸钠（SD）溶于1 L去离子水中，配制成4% SD溶液。将6.7 mL的15%过氧乙酸与993.3 mL的4%乙醇混合。
  2. 猪脊髓的制备
    注意：脊髓以冷冻状态无溶液运输，并在-80 °C保存至使用。
    1. 在4 °C冰箱中解冻脊髓18–24小时，然后使用无菌剪刀小心去除硬脊膜。
    2. 将脊髓切成小段（约1 cm长）。每15 mL离心管中放入一段，或每50 mL离心管中最多放入三段。
  3. 脊髓脱细胞处理
    注意：每一步完成后，将脱细胞溶液手动倾倒至大烧杯中弃去。可使用小型可高压灭菌的不锈钢滤网辅助弃去脱细胞溶液，以避免丢失后续步骤所需的组织。除非另有说明，脊髓均在83 rpm条件下震荡处理。
    1. 在4 °C、60 rpm条件下，用去离子水冲洗脊髓18–24小时。
    2. 在37 °C、40 rpm条件下，用0.025%胰蛋白酶/EDTA冲洗脊髓1小时。然后用PBS冲洗15分钟，重复2次。
    3. 用3% Triton X-100冲洗脊髓2小时。然后用100 mM Na/50 mM磷酸盐缓冲液冲洗15分钟，重复2次。
    4. 用1 M蔗糖冲洗脊髓1小时。然后用去离子水冲洗1小时。
    5. 用4% SD冲洗脊髓2小时。然后用100 mM Na/50 mM磷酸盐缓冲液冲洗15分钟，重复2次。
    6. 用含0.1%过氧乙酸的4%乙醇溶液冲洗脊髓4小时。然后用PBS冲洗1小时。
    7. 用去离子水冲洗脊髓1小时，重复2次。然后用PBS冲洗1小时。
    8. 在0.01 mbar、-56 °C条件下冻干脊髓3天，干燥保存至使用。

2. 猪坐骨神经的脱细胞处理（预计时间：5 天）

注意：使用先前已建立的方案进行脱细胞化处理27。除非另有说明，所有操作均应在室温下的无菌生物安全柜中进行。所有溶液均应使用瓶顶过滤器（0.2 µm 孔径）无菌过滤至已灭菌的瓶子中。需在 37 °C 下进行的步骤可在设定为 37 °C 的培养箱或洁净烘箱中完成。

  1. 脱细胞溶液的制备
    注意：所有溶液均按1 L计算。用户可根据实验需求调整最终所需体积。
    1. 在1 L去离子水中加入1.86 g NaCl、0.262 g d NaH2PO4H2O和2.17 g HNa2O4P·7H2O，配制50 mM Na/10 mM磷酸盐缓冲液。
    2. 将38.4 g SB-10溶于1 L的50 mM Na/10 mM磷酸盐缓冲液中，配制125 mM磺基甜菜碱-10（SB-10）溶液。
    3. 将30 g SD和0.24 g SB-16溶于1 L的50 mM Na/10 mM磷酸盐缓冲液中，配制3% SD/0.6 mM磺基甜菜碱-16（SB-16）溶液。
  2. 猪坐骨神经的准备
    注意：坐骨神经以PBS保存并冷冻运输，使用前应存放于-80 °C。
    1. 在4 °C冰箱中解冻坐骨神经18–24小时，以备脱细胞处理。
    2. 将坐骨神经切成小段（约1 cm长）。每15 mL离心管中放入一段，或每50 mL离心管中最多放入三段。
  3. 坐骨神经的脱细胞处理
    注意：每一步完成后，手动将脱细胞溶液倒入大烧杯中弃去，可使用小型可高压灭菌的不锈钢滤网辅助弃液，避免丢失后续步骤所需的组织。除非另有说明，坐骨神经均在15 rpm条件下震荡处理。
    1. 用去离子水冲洗坐骨神经7小时。然后用含125 mM磺基甜菜碱-10（SB-10）的50 mM Na/10 mM磷酸盐缓冲液冲洗18小时。
    2. 用100 mM Na/50 mM磷酸盐缓冲液冲洗坐骨神经15分钟。然后用含3% SD/0.6 mM磺基甜菜碱-16（SB-16）的50 mM Na/10 mM磷酸盐缓冲液冲洗2小时。
    3. 用100 mM Na/50 mM磷酸盐缓冲液冲洗坐骨神经15分钟，重复3次。然后用含125 mM SB-10的50 mM Na/10 mM磷酸盐缓冲液冲洗7小时。
    4. 用100 mM Na/50 mM磷酸盐缓冲液冲洗坐骨神经15分钟。然后用含3% SD/0.6 mM SB-16的50 mM Na/10 mM磷酸盐缓冲液冲洗1.5小时。
    5. 用50 mM Na/10 mM磷酸盐缓冲液冲洗坐骨神经15分钟，重复3次。然后用75 U/mL脱氧核糖核酸酶（DNase）在无震荡条件下处理3小时。
    6. 用50 mM Na/10 mM磷酸盐缓冲液冲洗坐骨神经1小时，重复3次。然后在37 °C无震荡条件下，用0.2 U/mL ABC型软骨素酶处理16小时。
    7. 用PBS冲洗坐骨神经3小时，重复3次。在0.01 mbar和-56 °C条件下冷冻干燥3天，干燥保存至使用。

3. 脱细胞组织的消化及复合水凝胶的制备（预计时间：4天）

  1. 使用剪刀或匀浆器将脱细胞组织切碎或研磨成粉末。将用于切碎或研磨组织的工具在121 °C条件下高压灭菌45分钟进行消毒。也可采用环氧乙烷法进行灭菌。
  2. 分别在含有1 mg/mL胃蛋白酶的0.01 N盐酸（HCl）溶液中消化组织，组织浓度为15 mg/mL。每片脱细胞脊髓和坐骨神经的估计重量分别为50–100 mg和100–150 mg。
  3. 放入磁力搅拌子，在4 °C条件下以500 rpm转速持续搅拌至少4天，以制备预凝胶溶液。
  4. 按以下体积比混合坐骨神经和脊髓预凝胶：2:1、1:1和1:2。使用1 N氢氧化钠（NaOH）和HCl调节pH至7.4，并用M199培养基和1× PBS稀释至所需浓度。在37 °C孵育30分钟。
    注意：每次加入NaOH时应逐滴添加（每次1 µL）。M199培养基可作为pH指示剂，当pH达到7.4时溶液呈淡粉色，但仍应使用pH试纸确认pH值。

4. 脱细胞化的验证

  1. 苏木精-伊红染色（H&E；预计时间：8天）
    注意：每次漂洗步骤后，将溶液手动倒入大烧杯中以弃去。
    1. 将新鲜及脱细胞的脊髓和坐骨神经置于3.7%甲醛中，4 °C固定18小时。将一块组织放入15 mL离心管中。
    2. 去除甲醛，将组织置于10%蔗糖溶液中1天。去除10%蔗糖溶液，再将组织置于30%蔗糖溶液中6天。
    3. 取一个合适大小的冷冻模具，加入约一半体积的包埋剂（OCT）。将脱细胞组织放入模具中，用OCT完全覆盖，并使其在4 °C吸收OCT 1天。
    4. 1天后，将组织在-80 °C过夜冷冻。使用冷冻切片机将组织切成10 µm厚度的切片。
    5. 用1×PBS漂洗5分钟，重复2次。然后用自来水漂洗5分钟。
    6. 用苏木精溶液染色1分钟。用自来水漂洗1分钟，重复3次。
    7. 用伊红溶液染色1分钟。用95%乙醇漂洗1分钟，重复2次；再用100%乙醇漂洗1分钟，重复3次。
    8. 用二甲苯漂洗1分钟、2分钟和1分钟。让载玻片干燥5分钟。
    9. 用棉签滴加3–4滴二丁基邻苯二甲酸酯聚苯乙烯二甲苯（DPX）封片剂至载玻片上。将盖玻片覆盖在含DPX的载玻片上。让载玻片过夜干燥。
  2. DNA分析（预计时间：1小时）
    1. 称量脱细胞并冻干的组织。根据制造商说明书，使用市售试剂盒提取并定量DNA。

5. 复合水凝胶的表征

  1. 凝胶化浊度试验（预计时间：1 h）
    1. 将100 µL预凝胶溶液加入冰上的96孔板各孔中。使用酶标仪每2分钟读取一次405 nm处的吸光度，持续45分钟。
    2. 使用以下公式计算归一化吸光度：
      （吸光度 - 吸光度初始）/（吸光度最大值 吸光度初始)
    3. 计算曲线的斜率以及达到 50% 和 95% 凝胶化所需的时间，t1/2 和 t95分别。
  2. 压缩测试（预计时间：每个水凝胶1分钟）
    1. 制备浓度为12 mg/mL、直径为8 mm、高度为2 mm的复合水凝胶。
    2. 使用流变仪在不锈钢平行板之间以250 N的载荷、10%样品高度/分钟的应变速率对样品进行压缩。流变仪配套软件将通过施加力并测量应变，直至水凝胶断裂，从而生成应力-应变曲线。
    3. 根据应力-应变曲线线性区域的斜率计算杨氏模量。

6. 人脂肪干细胞在神经复合水凝胶中的三维培养

  1. 三维（3D）平台的制备（预计时间：3 小时）
    1. 使用 SU-8 光刻胶对硅片进行蚀刻，形成深度为 200 µm、直径为 4 mm 的圆形图案。
    2. 按 10:1 的比例混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）基质与固化剂。将混合物倒入硅片上，静置 20 分钟，以去除混合过程中产生的所有气泡。
    3. 将样品放入烘箱中，在 70 °C 下固化 2 小时。脱模后，使用直径为 8 mm 的活检打孔器打孔，制备 PDMS 微孔阵列。
    4. 将微孔阵列置于 96 孔板中，并将整块板放入空气等离子体清洗机中，对 PDMS 微孔进行灭菌处理。
    5. 分别使用 1% 聚乙烯亚胺（PEI）和 0.1% 戊二醛（GA）对 PDMS 微孔进行功能化处理，处理时间分别为 10 分钟和 20 分钟。随后用蒸馏水洗涤微孔两次。
  2. 人脂肪源性间充质干细胞（hASCs）的制备（预计时间：7 天）
    1. 在 hASCs 生长培养基（基础培养基中添加胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素（Pen-strep））中培养细胞，传代 2–5 代，直至细胞融合。传代后使用血细胞计数板或细胞计数仪计算细胞数量。
  3. 含 ASC 的神经复合水凝胶的制备（预计时间：2 小时）
    1. 按体积比 2:1、1:1、1:2 混合坐骨神经与脊髓预凝胶，并制备仅含脊髓预凝胶、不添加任何坐骨神经预凝胶的对照组水凝胶。
    2. 加入 M199 培养基，并使用 1 N NaOH 和 HCl 调节 pH 至 7.4。将 hASCs 以 1 × 106 个细胞/mL 的密度重悬于生长培养基中，并加入预凝胶中。
      注意：M199 培养基和细胞悬液的总体积应为预凝胶体积的 10%。
    3. 使用 1× PBS 将预凝胶稀释至 12 mg/mL。将预凝胶加入微孔阵列中，37 °C 孵育 30 分钟。随后在 hASCs 生长培养基中培养含 ASC 的水凝胶。
  4. 细胞活力检测（每天预计耗时：4 小时）
    1. 根据制造商说明书，使用市售试剂配制细胞活力检测试剂溶液。
    2. 在第 1、4、7 和 14 天吸除培养基，向各孔中加入检测试剂，按照制造商说明书在 37 °C 下孵育 3 小时。
    3. 使用酶标仪在激发/发射波长 560/590 nm 处读取荧光值，并按以下公式计算百分比差异：
      [(荧光样品 - 荧光空白) / 荧光空白] × 100

结果

脱细胞组织采用既往建立的方案并稍作修改制备而成26,27。在完成脱细胞、冻干及消化处理后，制备了坐骨神经与脊髓来源成分比例分别为 SN:SC = 2:1、1:1、1:2 的神经复合水凝胶，以及仅含脊髓成分的水凝胶（图1）。通过苏木精-伊红（H&E）染色确认细胞核成分的去除情况（图2A）。为定量评估脱细胞效果，检测了细胞外基质（ECM）中的残留DNA含量。新鲜硬脑膜中双链DNA（dsDNA）含量为132.6 ± 21.3 ng dsDNA/mg干组织，而新鲜脊髓实质和脱细胞后脊髓实质中的dsDNA含量分别为22.6 ± 8.3 ng dsDNA/mg干组织和23.74 ± 6.69 ng dsDNA/mg干组织（图2B）。结果表明，硬脑膜应在脱细胞前予以去除。新鲜与脱细胞后坐骨神经的dsDNA含量分别为222.5 ± 42.65 ng dsDNA/mg干组织和0.63 ng dsDNA/mg干组织（图2C）。

通过评估神经复合水凝胶的凝胶动力学，确定其凝胶速度（S）以及达到最终浊度50%和95%所需的时间（t1/2 和 t95）。所有水凝胶组别的凝胶动力学均呈现典型的S形曲线（图3A）。各水凝胶组别的凝胶速度（S）之间无显著差异。达到最终浊度一半所需的时间（t1/2）分别为：坐骨神经与脊髓比例（SN:SC）为2:1时，11.32 ± 0.57 分钟；1:1时，13.33 ± 0.6 分钟；1:2时，15.7 ± 0.92 分钟；仅含脊髓水凝胶时，17.23 ± 1.13 分钟。达到最终浊度95%所需的时间（t95）分别为：SN:SC = 2:1时，13.8 ± 0.83 分钟；1:1时，15.53 ± 0.83 分钟；1:2时，18.38 ± 0.79 分钟；仅含脊髓水凝胶时，19.62 ± 1.27 分钟。这些结果表明，含有较多坐骨神经成分的水凝胶更快达到稳定状态，提示坐骨神经细胞外基质可能促进水凝胶的组装。压缩测试结果显示，含有较多脊髓成分的水凝胶具有更高的刚度趋势；然而，在所有不同配比的复合水凝胶之间，该差异并未达到统计学显著性（图3B）。

最后，为了测定所有水凝胶组中hASCs的细胞活力，使用微加工的PDMS微孔建立了3D培养体系，如图4所示。在14天的培养过程中，采用一种 commercially available 基于细胞培养基的比色和荧光代谢检测法来评估ASC的活力，并在四个不同时间点（第1天、第4天、第7天和第14天）计算读数的百分比差异（图5）。随着培养时间的延长，百分比差异的数值逐渐增加，而在第1、第4和第14天，仅含脊髓成分的水凝胶组的数值低于其他各组。综上所述，这些数据表明，由于细胞增殖和细胞代谢活性的增强，hASC的细胞活力在培养期间逐渐提高。

猪神经水凝胶制备过程：从脱细胞化到预凝胶形成的神经组织工程示意图。
图1：神经复合水凝胶的制备。 将猪脊髓和坐骨神经进行脱细胞化、冻干和消化处理，以获得预凝胶溶液。将坐骨神经和脊髓预凝胶溶液按2:1、1:1和1:2的比例混合，并单独制备仅含脊髓的预凝胶。所有预凝胶溶液均在37 °C孵育，以形成神经复合水凝胶。 请点击此处查看该图的放大版本。

脱细胞组织学和DNA含量；脊髓和坐骨神经的显微图像及柱状图
图2：脱细胞效果的验证。（A）新鲜及脱细胞猪脊髓和坐骨神经的H&E染色。箭头指示组织中细胞的存在。比例尺 = 宏观图像1 mm，放大图像500 µm（仅脱细胞坐骨神经放大图像为200 µm）。（B）新鲜硬脑膜、实质组织及脱细胞脊髓的DNA分析（n=10、16和6）。（C）新鲜与脱细胞坐骨神经的DNA分析（n=8和3）。误差线表示标准差。统计分析采用单因素方差分析（One-way ANOVA），B组进行Tukey事后检验，C组进行t检验。缩写：ns = 无显著性差异。请点击此处查看该图的放大版本。

比较脊髓脱细胞处理的吸光度图和杨氏模量图。
图 3：神经复合水凝胶的表征。 （A）神经复合水凝胶的归一化吸光度（n = 5）。（B）脱细胞脊髓及神经复合水凝胶的杨氏模量（脱细胞脊髓组 n = 4，各复合水凝胶组 n = 3）。误差线表示标准差。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合 Tukey 事后检验。缩写：ns = 无显著性差异。 请点击此处查看该图的放大版本。

PDMS 微孔制备和 hASC 水凝胶制备示意图；神经预凝胶混合；孵育步骤。
图 4：三维培养示意图。 （A）在涂有 SU-8 的硅片上制备 PDMS 微孔。使用 8 mm 活检打孔器将每个微孔 punched out。 （B）以不同比例混合去细胞化脊髓和坐骨神经，调节 pH 至 7.4，用 hASCs 重悬，将预凝胶置于微孔上，并在 37°C 下孵育 30 分钟。 请点击此处查看该图的放大版本。

柱状图显示14天内与对照组相比的百分比差异，标有统计学显著性。
图5：细胞活力检测。 人脂肪源性干细胞（hASCs）在神经复合水凝胶中培养第1、4、7和14天的活力百分比差异（n = 3）。误差线表示标准差。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey事后检验。* p<0.05；** p<0.01；*** p<0.005；**** p<0.001；ns：无显著性差异。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

人们普遍认为，脊髓损伤（SCI）的病理生理机制复杂且具有多面性。尽管细胞移植、药物递送和生物材料等单一疗法各自为SCI研究提供了宝贵的见解，但SCI的复杂性可能限制了这些疗法的单独疗效28,29,30,31。因此，开发有效的联合治疗策略的努力日益增加。本研究中描述的神经复合水凝胶可作为细胞或药物的有效递送载体。在细胞方面，脂肪来源的干细胞（ASCs）是细胞移植的潜在候选之一。ASCs可分泌免疫调节因子，如白细胞介素-10（IL-10）和转化生长因子β（TGF-β），以及神经营养因子，如神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和神经营养素-3（NT-3），这些因子可促进体外背根神经节神经突的生长以及体内功能恢复in vitro和功能恢复in vivo17,19,32,33,34。以水溶液形式递送的ASCs已在大鼠和人类中促进SCI后的功能恢复；然而，ASCs在迁移、分化、存活等方面的调控仍面临挑战35,36,37。此外，关于移植ASCs的致瘤潜能存在相互矛盾的报道；一些研究表明ASCs可能促进多种癌症的增殖和转移，而其他研究则显示其具有抗肿瘤潜能38,39,40,41。因此，ASCs在神经复合水凝胶中的长期安全性需在未来进一步研究。本研究中，脱细胞脊髓和坐骨神经已被分别用于SCI修复的研究。

脱细胞脊髓被注入脊髓损伤（SCI）大鼠模型后，可刺激轴突长入病灶区域，并提高功能恢复；然而，由于降解过快，治疗4-8周后形成了囊腔，导致恢复效果减弱4, 42。在SCI大鼠中注射脱细胞坐骨神经水凝胶可促进神经再生，但其疗效因水凝胶快速降解而受限24。因此，近年来联合使用脱细胞组织的方法受到关注。已有报道称，脱细胞脊髓水凝胶能够促进神经干细胞/前体细胞的增殖、迁移，并分化为神经元4。该水凝胶还可促进N1E-115神经母细胞瘤细胞的三维神经突生长，表明脱细胞脊髓水凝胶可能是一种有前景的支架材料，可用于促进轴突再生26。脱细胞坐骨神经与施万细胞包封联合应用的研究显示其在SCI后作为神经移植物具有潜在价值43。综上所述，联合使用脱细胞脊髓和脱细胞坐骨神经有望同时促进轴突再生和组织修复。目前的研究尚未评估负载ASC的神经水凝胶的治疗效果。因此，有必要通过体外（in vitro）和体内（in vivo）实验评估该平台的再生潜力，例如促血管生成和神经营养作用。此外，神经复合水凝胶可方便地用于包封其他类型的细胞，如施万细胞、嗅鞘干细胞和神经干细胞，以提高细胞移植的治疗效果。研究不同SCI阶段下多种细胞类型在神经复合水凝胶中的安全性和有效性将具有重要意义。

制备复合水凝胶的关键步骤之一是准备足量的组织，尤其是脊髓组织。去细胞化脊髓的产率显著偏低，如本方案所述（50–100 mg 脊髓组织块和 100–150 mg 坐骨神经组织块），因此不建议从小型动物（如小鼠和大鼠）获取脊髓。建议至少使用中等体型动物（如兔子），以获得足够量的脊髓基质。此外，在消化去细胞化组织时需注意 pH 值，因为加入组织可能导致 pH 偏离胃蛋白酶激活所需的范围（约 1.5–2）。本方案中脊髓去细胞化的振荡时间比先前建立的方法26更长，原因是当前方案的振荡速度较慢。本方案使用的旋转仪最高转速为 83 rpm，而先前方法中最高使用 200 rpm。因此，振荡时间延长了一倍，以彻底清洗所有细胞碎片。为确保所有去细胞化溶液能够充分渗透组织并清除全部细胞和核内容物，用户需通过组织学或 DNA 分析自行优化振荡时间和速度。建议组织与去细胞化溶液的比例至少为 1:15 [w/v]。先前建立的方案26中，去细胞化组织在室温下进行消化/搅拌；但在本方案中，组织在 4 °C、500 rpm 条件下使用磁力搅拌器搅拌消化 4 天。搅拌器电机可能产生热量并传递至预凝胶溶液，因此建议在低温条件下消化，或使用可控温的搅拌装置。

如DNA分析中所述（图2B），必须去除脊髓的硬脊膜，因为硬脊膜内含有大量DNA。硬脊膜与脊髓实质不同，主要由纤维组织构成；因此，应采用不同的脱细胞方法，正如先前文献所记载的那样44,45H&E 染色和脱细胞组织的 DNA 分析已被用于验证脱细胞过程的有效性。为实现成功的脱细胞，需满足以下标准：1. 每毫克 ECM 干重的双链 DNA 含量低于 50 ng；2. DNA 片段长度小于 200 bp；3. 组织切片中无细胞核物质或 H&E5. H的定性分析&脱细胞后#38;E染色显示无细胞核着色，表明细胞成分被成功去除。此外，细胞外基质（ECM）成分如胶原蛋白及其他基质蛋白得以保留，且脱细胞后染色强度降低，反映出细胞物质的清除。脱细胞处理后，每毫克ECM干重的DNA含量在坐骨神经中为0.63 ng，在脊髓中为23.74 ± 6.69 ng，低于可接受阈值 体内 应用

复合水凝胶的流变学测量需要精心设计，因为具有高压力或拉伸力的流变仪或拉伸测试仪无法用于分析本研究中制备的神经复合水凝胶等软质材料的力学性能。当样品被夹持在拉伸测试仪上时会被撕裂或拉断，而高压强下的压缩测试也无法提供足够灵敏的数据用于分析。本研究采用了一台最大压力为250 N的流变仪，建议使用者根据自身需求选择具有相似或合适压力范围的设备。作为替代方案，可采用其他流变学测量方法，例如振荡剪切测量，以测定储能模量和损耗模量。脱细胞化后力学性能降低是本研究的一个局限性。尽管所有水凝胶组的杨氏模量与脱细胞化脊髓组织相近，但与新鲜脊髓组织相比存在显著差异（数据未显示）。已有研究表明，在相对较软的材料上培养的神经干细胞和间充质干细胞分别表现出更高的神经元分化程度和β-III微管蛋白表达水平46,47。然而，可通过与其他材料（如海藻酸盐、聚乙二醇、京尼平和戊二醛）复合或交联来增强脱细胞化材料的力学性能48,49,50,51。未来仍需优化这些策略，以确保在增强水凝胶力学性能的同时，不会影响细胞行为或细胞活力。

神经复合水凝胶在不同批次之间可能出现变异性，部分原因在于动物的年龄、性别、体重和物种存在差异。使用相同类型的动物并保持操作的一致性和可控性，有助于减轻这种变异性。将来自不同动物的组织样本进行合并，也有助于降低批次间的差异52。将本研究转化为临床应用时可能面临的潜在挑战之一是可扩展性。脊髓脱细胞的产量较低，会限制大量脱细胞组织的制备。需要开发或优化新的方法以获得更多组织，或者可尝试同时对硬脑膜进行脱细胞处理，以提高脱细胞后的产量。另一个潜在挑战是监管审批。在美国，食品药品监督管理局（FDA）负责细胞治疗产品的监管审批53。韩国监管机构曾批准CARTISTEM上市，该产品是一种基于间充质干细胞（MSC）的治疗产品，包含同种异体脐血来源的MSCs以及4%透明质酸盐水凝胶，用于膝关节软骨缺损的治疗54。此类先例可为安全性与有效性提供数据支持，有助于简化监管审评流程。

披露

作者无任何披露事项。

致谢

本工作由PhRMA基金会和美国国立卫生研究院（NIH）通过授予YS的资助编号P20GM139768和R15NS121884 提供支持。我们感谢阿肯色大学生物医学工程系的Kartik Balachandran博士和Raj Rao博士允许我们使用他们的设备。同时，我们感谢阿肯色大学生物与农业工程系的Jin-Woo Kim博士和Patrick Kuczwara先生为我们提供流变仪操作培训。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3-(癸基二甲基铵基)丙烷磺酸内盐Sigma-AldrichD4266坐骨神经脱细胞过程中使用 SB-10
3-(N,N-二甲基棕榈酰氨基)丙烷磺酸盐Sigma-AldrichH6883坐骨神经脱细胞过程中使用的 SB-16
AlamarBlue 试剂Fisher ScientificDAL1100AlamaBlue细胞活力检测中使用
硫酸软骨素酶ABCSigma-AldrichC3667坐骨神经脱细胞过程中使用
冷冻切片机LeicaCM1860
脱氧核糖核酸酶Sigma-AldrichD4263坐骨神经脱细胞过程中使用
七水合磷酸氢二钠VWRBDH9296100 mM Na/50 mM 磷酸盐及 50 mM Na/10 mM 磷酸盐缓冲液的化学试剂
DNeasy 血液 & 组织试剂盒Qiagen69506DNA分析过程中使用
组织学用 Dpx 封片剂，载玻片封固介质Sigma-Aldrich6522用于H期间&E 染色
伊红Sigma-AldrichHT110216用于H&E 染色
乙醇VWR89125-172
甲醛Sigma-Aldrich252549用于H&E 染色
戊二醛（GA）Sigma-AldrichG6257用于PDMS表面功能化
hASC 生长培养基LonzaPT-4505用于培养人脂肪源性干细胞（hASCs），含有胎牛血清及青霉素/链霉素
苏木精VWR26041-06用于 H 期间&E 染色
人脂肪源性干细胞LonzaPT-5006
盐酸（HCl）Sigma-Aldrich320331用于消化脱细胞组织并调节预凝胶溶液
M199 培养基Sigma-AldrichM0650用于将预凝胶稀释至所需浓度
最佳切割温度化合物Tissue-Tek4583
胃蛋白酶Sigma-AldrichP7000用于消化脱细胞组织
过氧乙酸Lab AlleyPAA1001用于脊髓脱细胞过程
磷酸盐缓冲液（PBS）VWR97062-948
酶标仪BioTek InstrumentsSynergy Mx
聚乙烯亚胺（PEI）Sigma-Aldrich181978用于PDMS表面功能化
猪坐骨神经组织来源有限责任公司活猪，无身份识别信息且无溯源信息
猪脊髓组织来源有限责任公司活体猪，无任何可识别信息及可追溯性细节
QuantiFluor dsDNA 系统PromegaE2670用于分析DNA含量
流变仪TA InstrumentsDHR 2
耐用型旋转仪Glas-co099A RD4512用于脊髓脱细胞过程
氯化钠（NaCl）VWRBDH9286100 mM Na/50 mM 磷酸盐和 50 mM Na/10 mM 磷酸盐缓冲液的化学试剂
脱氧胆酸钠Sigma-AldrichD6750
磷酸二氢钠一水合物VWRBDH9298100 mM Na/50 mM 磷酸盐和 50 mM Na/10 mM 磷酸盐缓冲液用化学品
氢氧化钠溶液（NaOH）Sigma-Aldrich415443用于调节预凝胶溶液
SU-8Kayaku 高级材料SU8-100用于涂覆硅晶圆
蔗糖Sigma-AldrichS8501用于脊髓脱细胞过程
Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒DOW1317318聚二甲基硅氧烷（PDMS）基础剂与固化剂
Triton X-100Sigma-AldrichX100用于脊髓脱细胞过程
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红赛默飞世尔科技25300062用于hASC实验及脊髓脱细胞过程
试管旋转混匀仪赛默飞世尔科技88881001坐骨神经脱细胞过程中使用
二甲苯VWRMK866816用于H&E 染色

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