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方法文章

体外胚胎植入模型的建立

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DOI：

10.3791/66873

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2024年6月21日

 ,  ,  , 
1Shanghai-MOST Key Laboratory of Health and Disease Genomics, NHC Key Lab of Reproduction Regulation, Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies (SIBPT), School of Pharmacy, Fudan University, 2Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities

本文内容

摘要

本方案描述了建立简单高效胚胎移植的方法 体外 用于评估影响胚胎着床过程相关分子的模型。

摘要

胚胎植入是成功妊娠建立的第一步。体外胚胎植入模型对于基础生物学研究、药物开发和筛选至关重要。本文介绍了一种简单、快速且高效的体外胚胎植入模型。在本实验方案中，我们首先介绍小鼠囊胚的获取以及人子宫内膜腺癌细胞（Ishikawa） 的准备，随后介绍小鼠胚胎与Ishikawa细胞的共培养方法。最后，我们基于该模型研究了不同浓度的17-β-雌二醇（E2）和孕酮（P4）对胚胎黏附率的影响。研究结果表明，高浓度E2显著降低胚胎黏附率，而添加孕酮可恢复黏附率。该模型为评估和筛选参与黏附过程的分子（如细胞因子、药物以及调控植入和子宫内膜容受性的转录因子）提供了一个简单且快速的平台。

引言

胚胎植入是成功妊娠的初始步骤，对于理解其生物学基础以及应对不孕症的挑战至关重要。然而，由于伦理限制，获取人类临床胚胎样本面临重大困难，这阻碍了对早期妊娠期间人类胚胎与子宫内膜之间复杂相互作用的研究1。深入理解这些复杂机制对于推动基础生物学研究、药物发现以及生殖健康的发展具有重要意义。

既往的体外模型采用黏附模型，将单层人子宫内膜上皮细胞（RL95-2）2 与胚胎替代物（如BeWo、JAr或Jeg-33绒毛膜癌细胞）共培养。然而，类球体大小的选择至关重要，其直径范围为70–100 µm，过大或过小的细胞聚集体均可能影响实验的准确性。值得注意的是，每次制备的类球体中仅有25%符合适宜尺寸的标准4，且与胚泡的生理条件存在显著差异。

此外，子宫内膜和胚泡的三维（3D）培养系统提供了更接近生理条件的环境5，但该系统需要较高的技术熟练度，细胞生长缓慢，资源和维护成本高，标准化困难，且可重复性较低6。

在本实验方案中，我们介绍一种经济高效且快速的体外胚胎着床模型，该模型可在大多数实验室中建立并应用。本方法的总体目标是提供一个可靠且可重复的平台，用于在受控环境中研究胚胎与子宫内膜之间的相互作用。通过模拟胚胎着床的关键事件 体外该模型旨在弥合动物模型与临床环境之间的差距，从而实现更精确和有针对性的研究。

与胚胎替代物相比，使用小鼠囊胚能够更真实地模拟体内胚胎着床过程7。此外，源自人子宫内膜腺癌的Ishikawa细胞系具有腺上皮和子宫腔上皮的混合特性1，能够表达与正常子宫内膜相似的酶、结构蛋白和功能性类固醇受体，从而为胚胎着床提供一个生理上更相关的基质。该共培养系统操作简便、快速，适用于高通量筛选和药物测试8,9,10。通过提供一个稳定且可重复的实验平台，该方法有助于深入理解胚胎着床机制及其对人类健康的影响。

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方案

小鼠操作和实验研究均依照上海生物医药与医药技术研究院动物委员会批准的方案进行。确保安全操作：在处理化学品或生物材料时，务必穿戴适当的个人防护装备（PPE）。

1. 小鼠胚胎的获取

注意：本部分描述了获取小鼠胚胎的流程。成年雌性小鼠（6–8 周龄，C57BL/6 与 DBA/2 杂交系）在标准环境条件下饲养，光照周期为 12 小时光照/12 小时黑暗，温度 20–25 °C，湿度 40–60%，并自由提供食物和饮水。 随意摄取.

  1. 向雌性小鼠腹腔注射 10 IU 孕马血清促性腺激素（PMSG），42–48 小时后，再注射 10 IU 人绒毛膜促性腺激素（HCG）。
  2. 将每只雌性小鼠与年龄相近的雄性小鼠合笼交配，并于次日早晨检查阴道栓。
    注意：阴道栓是精液在阴道口凝固后形成的淡黄色栓状物。
  3. 通过吸入 CO2 法处死带有阴道栓的雌性小鼠。
  4. 打开腹部并定位雌性生殖器官；用镊子拉伸输卵管、卵巢及脂肪垫；用剪刀剪下输卵管和卵巢；然后，再剪断输卵管与子宫（图 1）。
  5. 将获取的输卵管转移至预先加入 M2 培养基的 35 mm 培养皿中。
    注意：M2 培养基应提前在培养箱（37 °C，5% CO2）中预热 30 分钟。
  6. 用 25 G 针头刺破膨大的输卵管壶腹部，释放或挤出卵丘-受精卵复合体（图 2）。
  7. 用镊子将卵丘-受精卵复合体转移至含有 0.5 mg/mL 透明质酸酶的 M2 溶液中，孵育数分钟，直至卵丘细胞解离（图 3）。
  8. 用移卵移液器收集受精卵，并在含有 4 mg/mL BSA 的 M2 培养基中洗涤，以去除残留的透明质酸酶、卵丘细胞及其他杂质。

2. 体外 小鼠胚胎培养

注意：本节详细说明了以下过程 体外 将小鼠胚胎从受精卵培养至囊胚。KSOM培养液微滴应提前24小时准备好，以确保温度和气体平衡。

  1. 在35 mm培养皿底部制备12个微滴，每滴为20 µL的KSOM培养基。用3–5 mL矿物油覆盖微滴（图4），并将培养皿置于37 °C、5% CO2的培养箱中平衡。
  2. 使用转移移液管将小鼠胚胎从M2培养基转移至KSOM培养基中，进行充分洗涤。
    注意：此步骤需使用配备37 °C加热台的体视显微镜。尽量缩短胚胎在培养箱外的操作时间。
  3. 将洗涤后的胚胎放入已准备好的KSOM微滴中，在37 °C、5% CO2条件下培养4天。
    注意：为保证充足的营养，每20 µL微滴中培养5–10个胚胎。
  4. 根据囊胚大小（100–130 µm）、内细胞团（由多个紧密聚集的细胞组成）、滋养层细胞数量（由多个相互黏附且紧密排列的细胞组成的滋养外胚层）以及扩张程度（囊胚腔占据胚胎体积的80–100%）选择发育优势良好的囊胚。

3. 子宫内膜细胞的制备

  1. 在生物安全柜内，使用移液器吸取1 mL的2%明胶，加入12孔细胞培养板中。轻轻旋转培养板，确保明胶完全覆盖孔底。将培养板置于37 °C培养箱中孵育30分钟。随后吸除多余的明胶，并让孔底彻底干燥。
  2. 包被完成后，将人子宫内膜腺癌细胞（Ishikawa）在DMEM/F12培养基（详见材料表）中培养，培养基中添加1 mM丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺、100 µg/mL链霉素和100 IU/mL青霉素。将细胞接种至明胶包被的12孔板中（每孔2 × 105个细胞），并在37 °C培养箱中孵育24小时。

4. 胚胎附着

  1. 将5-15枚新鲜的囊胚轻轻放入已预先接种Ishikawa细胞的12孔板的每个孔中，用于共培养（图5）。
  2. 培养48小时后，在显微镜下观察胚胎，评估其贴附状态。为观察胚胎贴附情况，迅速移动培养板三次。未贴附的胚胎会在Ishikawa细胞表面呈现漂浮或滚动运动。
  3. 使用公式（1）计算胚胎着床率；以胚胎黏附率表示着床效果。
    胚胎着床率 = （贴附胚胎数 / 移植胚胎总数）× 100%    （1）

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结果

在辅助生殖技术过程中，控制性卵巢超促排卵（COH）是一个关键步骤，可使患者的雌激素水平较自然周期升高10-20倍以上11。鉴于这一背景，我们提出问题：高血清雌激素浓度是否会影响新鲜胚胎移植过程中的胚胎着床。基于该胚胎着床模型，我们研究了不同浓度的E2和P4对胚胎着床率的影响12。在饥饿处理后，Ishikawa细胞分别与E2（0、0.1、1、10和100 nM）或E2与P4的组合（0-0、100-0、100-10和100-100 nM）共同孵育48小时。随后将细胞转移至明胶包被的12孔板中，每孔加入5-15个囊胚。每个实验组设置3个重复，48小时后测定胚胎着床率。

结果表明，接近生理浓度的E2 (10 nM) 与 0 nM E 相比提高了胚胎着床率2然而，E的超高水平2 （100 nM）显著降低了胚胎着床率。添加孕酮可剂量依赖性地缓解超高水平雌激素的负面影响<...

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讨论

所提出方法的简便性与快速性 体外 用于胚胎植入研究的模型在早期药物筛选及其他科研应用中具有显著优势。Ishikawa 细胞系操作简便且通量高，使其成为大规模筛选的理想选择，尤其适用于药物发现的早期阶段。Liang13 发现TAGLN2基因敲低会降低滋养层细胞的侵袭能力。绿色14 证明胰岛素样生长因子可基于小鼠胚胎-衣原体细胞系统提高小鼠囊胚的黏附能力。该模型不仅可用于快速评估候选药物，还有助于研究其他在胚胎着床过程中发挥作用的分子，如细胞因子和转录因子15,16鉴于胚胎植入在生殖生物学中的重要意义，该模型有望推动我们对其潜在机制的理解，并为开发新型治疗手段提供可能。

尽管目前 体外 尽管该模型为研究胚胎着床提供了有价值的工具，但必须认识到其局限性。作为一种二维培养系统，它缺乏三维环境的复杂性 体内 环境

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披露

作者声明不存在经济或其他利益冲突。

致谢

本研究得到国家自然科学基金（82171603）、上海市卫生健康委员会基金（202140341）、上海市科学技术委员会（23JC1403803）以及国家卫生健康委员会与上海重点实验室创新促进计划、上海生物制品研究所（RC2023-02）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
17-β-雌二醇SIGMA3301活性最强的哺乳动物雌激素
BD FalconBD353001细菌培养用平皿，35 × 10 mm，带紧密盖，晶体级 virgin 聚苯乙烯，无菌
生物安全柜ESCOclass figure-materials-1BSC无菌操作，制备培养皿，试剂分装等
CO2 培养箱Thermo8000DH胚胎培养
培养板Corning3506细胞培养
DMEM/F12Gibco1133032DMEM/F12 (1x)，液体，1:1，含 L-谷氨酰胺和 15 mM HEPES 缓冲液
胎牛血清Gibco10099141胎牛血清，经鉴定，源自澳大利亚
明胶SIGMAG9391B型，粉末，BioReagent，适用于细胞培养
HCG南京艾贝M2520灭菌试剂，腹腔注射，50 IU/mL
透明质酸酶 SIGMAV900833试剂级，粉末 
KSOMMerckMR-020P-D(1x)，粉末，不含酚红，5 × 10 mL
L-谷氨酰胺Gibco25030081L-谷氨酰胺-200 mM (100x)，液体
M2MerckMR-015-DEmbryoMax M2 培养基 (1x)，液体，含酚红
矿物油 SIGMAM8410矿物油适用于多种分子生物学应用中作为覆盖层，以控制蒸发和交叉污染
青霉素-链霉素，液体Gibco15140122含青霉素（碱）10,000 单位和链霉素（碱）10,000 单位，使用青霉素 G（钠盐）和硫酸链霉素溶于 0.85% 生理盐水中
PMSG南京艾贝M2620灭菌试剂，腹腔注射，50 IU/mL
孕酮SIGMA5341在月经周期后半段由黄体分泌的类固醇激素
丙酮酸钠Gibco11360070丙酮酸钠通常作为除葡萄糖外的碳源添加至细胞培养基中
体视显微镜OlympusSZX7用于胚胎回收及胚胎发育观察

参考文献

  1. Hannan, N. J., Paiva, P., Dimitriadis, E., Salamonsen, L. A. Models for study of human embryo implantation: choice of cell lines. Biol Reprod. 82 (2), 235-245 (2010).
  2. Li, H. Y., et al. Establishment of an efficient method to quantify embryo attachment to endometrial epithelial cell monolayers. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 38 (9), 505-511 (2002).
  3. Hohn, H. P., Linke, M., Denker, H. W. Adhesion of trophoblast to uterine epithelium as related to the state of trophoblast differentiation: in vitro studies using cell lines. Mol Reprod Dev. 57 (2), 135-145 (2000).
  4. Ho, H., Singh, H., Aljofan, M., Nie, G. A high-throughput in vitro model of human embryo attachment. Fertil Steril. 97 (4), 974-978 (2012).
  5. Karvas, R. M., et al. Stem-cell-derived trophoblast organoids model human placental development and susceptibility to emerging pathogens. Cell Stem Cell. 29 (5), 810-825 (2022).
  6. Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
  7. Ojosnegros, S., Seriola, A., Godeau, A. L., Veiga, A. Embryo implantation in the laboratory: an update on current techniques. Hum Reprod Update. 27 (3), 501-530 (2021).
  8. Berneau, S. C., et al. Characterisation of osteopontin in an in vitro model of embryo implantation. Cells. 8 (5), 432(2019).
  9. Jiang, R., et al. Enhanced HOXA10 sumoylation inhibits embryo implantation in women with recurrent implantation failure. Cell Death Discov. 3, 17057(2017).
  10. Kang, Y. J., Forbes, K., Carver, J., Aplin, J. D. The role of the osteopontin-integrin αvβ3 interaction at implantation: functional analysis using three different in vitro models. Hum Reprod. 29 (4), 739-749 (2014).
  11. Duan, C. C., et al. Oocyte exposure to supraphysiological estradiol during ovarian stimulation increased the risk of adverse perinatal outcomes after frozen-thawed embryo transfer: a retrospective cohort study. J Dev Orig Health Dis. 11 (4), 392-402 (2020).
  12. Chen, G., et al. Integrins β1 and β3 are biomarkers of uterine condition for embryo transfer. J Transl Med. 14 (1), 303-312 (2016).
  13. Liang, X., et al. Transgelin 2 is required for embryo implantation by promoting actin polymerization. FASEB J. 33 (4), 5667-5675 (2019).
  14. Green, C. J., Fraser, S. T., Day, M. L. Insulin-like growth factor 1 increases apical fibronectin in blastocysts to increase blastocyst attachment to endometrial epithelial cells in vitro. Hum Reprod. 30 (2), 284-298 (2015).
  15. Kang, Y. J., et al. MiR-145 suppresses embryo-epithelial juxtacrine communication at implantation by modulating maternal IGF1R. J Cell Sci. 128 (4), 804-814 (2015).
  16. Berger, C., Boggavarapu, N. R., Menezes, J., Lalitkumar, P. G., Gemzell-Danielsson, K. Effects of ulipristal acetate on human embryo attachment and endometrial cell gene expression in an in vitro co-culture system. Hum Reprod. 30 (4), 800-811 (2015).
  17. Li, X., et al. Three-dimensional culture models of human endometrium for studying trophoblast-endometrium interaction during implantation. Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 120-138 (2022).
  18. Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health. Biol Reprod. 104 (2), 282-293 (2021).
  19. Ahn, J., et al. Three-dimensional microengineered vascularised endometrium-on-a-chip. Hum Reprod. 36 (10), 2720-2731 (2021).
  20. Sternberg, A. K., Buck, V. U., Classen-Linke, I., Leube, R. E. How mechanical forces change the human endometrium during the menstrual cycle in preparation for embryo implantation. Cells. 10 (8), 2008(2021).

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