本方法介绍了一种免疫荧光实验方案及定量分析流程，用于评估在具有不同核结构模式的人类T淋巴细胞中蛋白质的分布情况。该方案提供了从样品制备开始，到在Fiji中进行半自动化分析操作，最后通过Google Colab笔记本进行数据处理的逐步指导。
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摘要
摘要
多种核内过程（如转录调控）发生在被称为“焦点”（foci）的特定结构中，这些结构可通过免疫荧光技术加以识别。通过显微镜研究这些焦点在不同细胞条件下的动态变化，可深入揭示调控细胞身份与功能的分子机制。然而，在不同类型细胞中开展免疫荧光实验，并评估这些焦点在组装、扩散和分布上的改变，仍面临诸多挑战。这些挑战包括样本制备的复杂性、成像数据分析参数的确定，以及大量数据的管理。此外，现有的成像工作流程通常面向熟练用户设计，限制了更广泛研究人员的使用。
本研究介绍了一种优化的免疫荧光实验方案，专为研究不同类型人原代T细胞中的核蛋白而设计，该方案可针对任何感兴趣的蛋白和细胞类型进行定制。此外，我们还提出了一种无偏定量分析蛋白染色的方法，无论这些蛋白形成明确的焦点结构，还是呈现弥散的核内分布均可适用。
我们提出的方法提供了一套完整的操作指南，从细胞染色到数据分析，利用在Jython中开发并可在Fiji中运行的半自动化流程实现。此外，我们还提供了一个用户友好的Python脚本，用于简化数据管理，并已在Google Colab笔记本中公开共享。本方法已证明能够高效地对在不同 背景下具有多样化核内组织模式的蛋白质进行高信息量的免疫荧光分析。
引言
真核生物基因组的组织结构受多种表观遗传修饰层次的调控1，这些修饰协调着在称为核体或凝聚物的特殊区室中发生的多种核功能2。在这些结构中，发生着转录起始3、RNA 加工4,5,6、DNA 修复7,8、核糖体生物合成9,10,11以及异染色质调控12,13等过程。核体的调控随空间和时间维度动态变化，以适应细胞的需求，这一过程受相分离原理的指导14,15。因此，这些核体作为瞬时的功能“工厂”，功能性组分可在其中组装和解聚，并发生大小和空间分布的变化。因此，通过显微镜研究核蛋白的特征，包括其形成核体的倾向性以及在不同细胞条件下其空间排布方式，可为理解其功能角色提供重要线索。荧光显微镜是研究核蛋白的常用方法，可通过荧光标记抗体检测目标蛋白，或通过荧光蛋白报告系统直接表达目标蛋白进行观察16,17。
在此背景下，核体表现为明亮的焦点或点状结构，具有明显的球形特征，因而可轻易地与周围环境相区分16,18。STORM 和 PALM 等超分辨率技术通过提供更高的分辨率（可达 10 nm）19，能够更精确地表征特定凝聚体的结构与组成20。然而，由于设备成本高昂以及数据分析所需的专门技能，这些技术的普及受到限制。因此，共聚焦显微镜因其在分辨率与广泛应用性之间的良好平衡而仍广受欢迎。这种普及性得益于其固有的去除离焦光的能力，从而降低了对复杂后期处理步骤以实现准确分割的需求；此外，共聚焦显微镜在研究机构中广泛可用、图像采集效率高，且样品制备通常较为高效。然而，在不同细胞条件下利用免疫荧光检测准确测量蛋白质分布、组装或扩散仍面临挑战，因为许多现有方法缺乏针对具有不同分布模式的蛋白质选择合适参数的指导21。此外，对于数据分析经验有限的用户而言，处理由此产生的大量数据可能十分困难，进而可能影响结果的生物学意义。
为应对这些挑战，我们提出了一种详细的免疫荧光样品制备与数据分析的分步操作方案，旨在提供一种无偏倚的方法，用于量化具有不同组织模式的蛋白质染色信号（图1）。该半自动化分析流程专为在计算和成像分析方面经验有限的用户设计，整合了两个成熟的Fiji插件功能：FindFoci22 和 3D suite23。通过将FindFoci精确识别焦点的能力与3D suite在三维空间中进行目标识别和分割的功能相结合，本方法为每次采集视野中的每个通道生成两个CSV文件。这些文件包含互补信息，有助于计算适用于多种信号分布类型的量化指标，例如每细胞的焦点数量、焦点到细胞核中心的距离，以及我们为弥散性蛋白染色所引入的非均一性系数（IC）。此外，我们认识到，对于数据处理能力有限的用户而言，数据外推可能耗时费力。为简化该过程，我们提供了一个Python脚本，可自动将所有采集的测量数据汇总为每个实验的单个文件。用户无需安装任何编程语言软件即可运行该脚本。我们已在Google Colab（一种基于云的平台，支持直接在浏览器中编写Python脚本）上提供了可执行代码，确保本方法直观且易于立即投入使用。
我们通过分析和量化两种核蛋白信号分布的变化，展示了本实验方案的有效性：含溴结构域蛋白4（BRD4）和zeste-12抑制因子（SUZ12）。BRD4是中介体复合物中一种已被充分研究的共激活蛋白，已知可形成与RNA聚合酶II依赖性转录起始相关的凝聚体24,25。SUZ12是多梳抑制复合物2（PRC2）的组成蛋白，负责调控组蛋白修饰H3K27me3的沉积26,27。这两种蛋白在两种不同类型的细胞中表现出不同的分布模式：新分离的人外周血CD4+初始T细胞（处于静息状态，转录活性较低）以及体外分化的TH1型CD4+细胞（为特化的增殖性效应T细胞，转录活性增强）28。
方案
使用人类样本进行研究已获得米兰基金会科学特征医疗护理研究所（IRCCS）Cà Granda Maggiore综合医院伦理委员会的批准，并已从所有受试者获得知情同意（授权编号：708_2020）。该方案分为三个主要部分：免疫荧光实验、图像采集和图像分析。平均需要4个工作日完成（图1）。
1. 免疫荧光样品制备
注意：通过调整固定和通透条件，该免疫荧光实验方案可轻松适用于多种细胞类型和靶蛋白。免疫荧光样品制备通常可在3天内完成，其中一抗孵育时间的长短取决于抗体质量和靶蛋白的特性（图1）。
- 样品制备
- 通过密度约为1.077 g/mL的密度梯度离心介质，按照制造商说明书分离人外周血单个核细胞（PBMCs）材料表).
- 分离CD4+ 根据制造商说明书，使用磁珠从外周血单个核细胞中分离T细胞材料表).
- 用CD4、CD45RA和CD45RO抗体对细胞进行染色（材料表）并进行初始CD4的FACS分选+ CD4 T细胞+/CD45RA+/CD45RO- 细胞，如 elsewhere 所述29,30.
注意：参见 材料表 有关本实验方案所用流式细胞分选仪的规格参数。 - 诱导初始CD4的分化+ T细胞分化为辅助性T细胞1（TH1 CD4+ 细胞）如所述 29简而言之，培养 1.5 x 106 细胞/毫升 FACS 分选的初始 CD4+ T细胞在TH1 中等剂量用抗 CD3/抗 CD28 磁珠以 1:1 比例刺激。当细胞数量达到 1.5 × 10 时，进行计数并传代培养。6 每2-3天更换一次培养基，细胞密度维持在 cells/mL（参见 表1 用于 TH1 种培养基配方。
- 在分化7天后评估效应功能细胞因子的分泌，具体方法如所述 29.
- 细胞固定与透化
注意：上述所有步骤均已在 30,31 稍作修改。- 为确保细胞最佳贴附，用包被液处理玻璃盖玻片（10 mm，厚度 1.5 H）表1如下所示：
- 用蒸馏水（ddH₂O）初步清洗玻璃盖玻片以清洁表面2O），随后用70%乙醇（EtOH）冲洗，并使其风干。
- 将清洗后的盖玻片放入24孔板中，用于步骤1.2.1.3–1.3。
- 在玻璃盖玻片上滴加200 µL包被液。5分钟后，移除液滴并使其自然风干。
- 用200 µL去离子水滴加至盖玻片上进行清洗2O. 5分钟后，移除液滴并风干。
- 重复步骤 1.2.1.3–1.2.1.4，共 3 次。
- 重悬初始CD4+ T细胞和TH1 CD4+ 细胞置于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，浓度为2 × 106 细胞/mL 浓度
注意：上述所示 对于人原代T淋巴细胞等较小的细胞，建议采用特定浓度。对于贴壁细胞，无需进行玻璃表面涂层处理，可直接使用适当的细胞培养基将细胞接种于玻璃表面进行培养。 - 将200 µL细胞悬液滴加到玻璃盖玻片上。室温（RT）孵育30分钟使细胞贴壁，随后移除液滴。
- 用新鲜过滤的3%多聚甲醛（PFA溶液）固定细胞， 表1室温下孵育10分钟。
- 用 TPBS 清洗玻璃盖玻片（表1室温下每次5分钟，共3次。
- 移除 TPBS，加入通透化溶液（表1室温下孵育10分钟。
- 弃去透化溶液，将样本置于储存溶液中孵育（表1) 于 4 °C 下孵育 1 小时至过夜（ON）。
注意：在此阶段，可安全暂停实验流程，将玻璃盖玻片置于24孔板中的储存液中保存，可稳定存放3至4周。
- 为确保细胞最佳贴附，用包被液处理玻璃盖玻片（10 mm，厚度 1.5 H）表1如下所示：
- 免疫荧光
- (可选从24孔板中取出盖玻片，迅速在干冰上冷冻30秒，室温下解冻，然后用预装有储存液的孔冲洗盖玻片。
- (可选重复步骤 1.3.1 三次。
- 在通透液中于室温下洗涤5分钟。随后在TPBS中于室温下洗涤2次，每次5分钟。
- 室温下在0.1 N HCl中孵育12分钟。
- 用1×PBS快速洗涤两次。
注意：所指定的细胞通透化条件，包括冻融步骤和盐酸（HCl）处理，适用于染色具有高度浓缩染色质的细胞中的核成分。然而，当处理染色质结构较松散的细胞时，建议减少或避免这些步骤。此外，若目标为细胞质成分，应考虑减少或省略盐酸处理。 - 将细胞与一抗（BRD4，1:500，或 SUZ12，1:100）在抗体稀释缓冲液中稀释后孵育表1)（每个玻璃盖玻片200 µL），4 °C过夜。
注意：根据实验需求、二抗和检测系统的不同，免疫荧光可同时使用多种一抗进行多重标记。 - 用 PBS-T 洗涤，每次 5 分钟，共洗 3 次（表1室温下轻轻振荡。
- 将细胞与用抗体稀释液稀释的二抗（每张玻璃盖玻片200 µL）在室温下孵育1小时。
注意：根据实验需求和可用的检测系统选择最合适的二抗。确保每种二抗均能特异性识别其对应的一抗来源物种。此外，所选荧光染料应与显微镜的滤光片和光源相匹配。必须避免所选荧光染料的发射光谱与核染料的发射光谱之间发生重叠。 - 在室温下用 PBS-T 轻柔振荡洗涤，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
- 用1 ng/mL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶于1×PBS中，室温避光染色5分钟。
注意：只要不与二抗的发射光谱重叠，也可使用其他染料进行细胞核染色。 - 用1x PBS进行数次快速洗涤。
- 使用抗荧光淬灭封片剂将玻璃盖玻片封固于显微镜载玻片上。
2. 图像采集
注意：图像采集的持续时间取决于仪器和所选设置。
- 共聚焦显微镜图像采集
- 使用共聚焦显微镜采集三维图像，设置z轴步长为0.25 µm，像素大小为0.1–0.2 µm。
注意：为了在使用63倍1.4数值孔径油镜时达到最佳的光衍射极限分辨率，我们将针孔大小设为0.8 AU，进行2次线平均，帧尺寸设为1024 × 1024像素。激发激光的选择以及通道采集顺序均经过仔细设计，以避免所用荧光染料之间的干扰或串色。然而，参数的调整应根据具体的显微镜型号和样本特性进行优化。有关本实验方案所用共聚焦显微镜的详细规格，请参见材料表。 - 每份生物学重复样本采集数量一致的随机视野，以涵盖约50个细胞。
- 使用共聚焦显微镜采集三维图像，设置z轴步长为0.25 µm，像素大小为0.1–0.2 µm。
3. 图像分析
- 软件安装
- 从 Fiji 官方下载页面（https://imagej.net/software/fiji/downloads）下载并安装最新可用版本的 Fiji。
- 通过 Fiji 更新站点或按照 3D Suite 官方网站（https://mcib3d.frama.io/3d-suite-imagej/#download）上的说明手动安装 3D Suite。
- 通过 Fiji 更新站点或按照 GitHub 仓库（https://github.com/aherbert/gdsc）上的说明手动安装 GDSC（FindFoci）。
- TIFF 转换
- 下载 "convert_to_TIFF.py" 脚本（补充文件 1）。
- 将该脚本拖放到 Fiji 中并运行代码。
- 在弹出的面板中，浏览至实验数据存储的路径。转换后的 TIFF 文件将保存在同一个实验文件夹中的子文件夹内。
- 在 3D Manager 中初始化设置。
- 点击 Plugins | 3DSuite | 3D Manager Options，打开 3D Manager 选项 面板。
- 在 3D Manager 选项窗口中，选中以下测量项对应的复选框：Volume (unit)、Mean Gray Value、Bounding box (pix)、Std Dev Gray Value、Centroid (pix) 和 Centroid (unit)。
- 勾选以下选项：Exclude objects on edges XY 和 Exclude objects on edges Z，然后点击 OK。
注意：此步骤仅需执行一次，用于初始配置将被存储在空间和定量信息文件中的度量指标。所选指标对于确保流程正常运行至关重要。可选的额外指标可在本步骤中一并添加，详见讨论部分。
- 在 FindFoci 图形用户界面中设置参数。
注意：此步骤仅需执行一次，用于配置半自动化流程的最优参数，这些参数随后将被整合进脚本中。- 打开测试图像。复制蛋白通道（包括图像栈，Ctrl + Shift + D），勾选 hyperstack 复选框，并在 Channels (c) 框中指定适当的通道编号，然后相应重命名。
- 通过导航至 Plugins | Macros | Record 启动 Fiji 宏记录器。
- 打开 FindFoci 插件（点击 Plugins | GDSC | FindFoci | FindFoci GUI），然后从 "Image" 下拉菜单中选择待分析的图像。
- 按如下方式设置参数（图 2A）：Gaussian blur = 1.5；background method = SD above mean；background param = 9；search method = fraction of peak - background；search param = 0.7；peak method = relative above background；peak param = 0.2；minimum size = 5；max peaks = 1,000,000。
注意：所列参数基于我们的案例研究选定，可能不适用于其他染色方法。 - 为增强焦点识别，调整以下参数：
- Gaussian blur 定义了平滑程度，以更好地分割焦点。应将其设置为接近焦点直径（像素）的值。
- Background param 设置用于区分背景与焦点信号的阈值。增加该值可施加更严格的阈值。
- Search param 定义在信号识别中包含的峰值荧光百分比。降低该值可包含距离荧光峰值更远的区域。
- Peak param 决定两个信号峰值被视为连续或分离的程度。降低该值将导致峰值分离。
- Max peaks 指定可识别的最大焦点数量。设置较高数值以包含图像中的所有焦点。
- 运行 FindFoci，并复制记录器窗口中出现的字符串（步骤 3.4.2，图 2B），该字符串包含所选参数（不包括引号）。有关设置的更多信息，请参阅插件使用手册22。
- 核蛋白定量分析流程
- 下载脚本 "nuclear_prot_q.py"（补充文件 2）。
- 将该脚本拖放到 Fiji 中并点击运行以执行代码。
- 按照显示的对话框中的说明处理图像。
- 细胞核通道：输入 DAPI（或任何细胞核染色）对应的通道编号。
- 细胞核 Gaussian Blur：输入用于图像分割的高斯模糊 sigma 值。
注意：应使该参数接近细胞核直径（即 5–6 µm）。对于染色不均的样本，应使用较高的 sigma 值。 - 蛋白通道：输入目标染色对应的通道编号。
- FindFoci 参数： 粘贴从步骤 3.4.6 的宏记录中获得的字符串（图 2B）。
- （可选）质量控制：检查分割后的细胞核质量。这将暂停脚本，允许手动检查每个生成的细胞核感兴趣区域（ROI）。
- 选择图像目录：点击 浏览 按钮，导航至包含待分析 TIFF 文件的文件夹。
- 所有字段填写完成后，点击 OK 继续执行。
- 若某个细胞核未被正确分割或未达到质量要求，可按 图 2C 所示进行删除或修改。
- 检查 ROIManager3D 窗口中的 ROI 列表；若列表为空，选择 merge 窗口并点击 Quantify 3D 以刷新管理器，然后关闭 Quantify 3D 结果表格。选择 细胞核通道 并将 Live-ROI 设为 开启。
- 选择属于同一细胞核的 ROI，点击 合并，或对不需要的细胞核点击 删除。
- 点击 全选，然后在 Mask check 窗口中点击 OK 继续分析。
- 分析结果位于步骤 3.5.3.6 指定路径的 Quantification 文件夹 中，包含一个记录分析所用参数的 txt 文件。
- 在 Google Colab 上运行流程
- 下载 "final_nuclear_protein_metrics.ipynb" 笔记本文件（补充文件 3）。
- 在 Google Colab（https://colab.research.google.com/）中打开该笔记本。
- 将包含每个图像视野的 .csv 文件的所有文件夹上传至 Google Drive 中的任一文件夹。
- 在笔记本中指明存储结果子文件夹的路径，并运行所有单元格。代码编译完成后，最终的电子表格文件将在上传 .csv 文件的同一文件夹中生成。
结果
本方法中所述方案有助于可视化并定量分析人原代T细胞中核蛋白染色的变化，且可针对不同细胞类型和蛋白靶标进行定制。作为案例研究，我们对初始型和TH1型CD4+细胞中的BRD4和SUZ12染色进行了实验与分析。
BRD4 在静息的初始型和分化的 TH1 CD4+ 细胞中均呈现点状分布的染色模式，因此可采用相同的设计参数对两种细胞类型的焦点进行识别（图 3A）。我们的分析流程可定量多种参数，包括 BRD4 焦点的数量、体积、荧光信号强度（以平均荧光强度（MFI）表示）、覆盖范围及其在细胞核内的空间排布（图 3B-F）。此外，我们引入了自动计算方法，用于确定焦点占细胞核体积的百分比，从而便于在细胞核大小不同的细胞之间进行比较（图 3E）。
最后，我们提供了将焦点距离核中心的位置进行映射的选项，有助于理解其在细胞核内的定位（图3F）。定量分析结果凸显了T细胞中BRD4焦点在不同条件间的显著变化H1 和静息状态的 CD4+ T细胞表现出焦点数量、大小、亮度和体积的增加，以及其分布和定位的差异。这些发现与活化/增殖T细胞相较于静息状态T细胞转录活性增强的结果一致28.
相比之下，SUZ12 不参与凝聚体的形成。在本研究中，我们观察到 SUZ12 在两种细胞状态之间的染色模式存在显著差异：在初始 T 细胞中呈现点状模式，而在 TH1 CD4+ 细胞中则转变为弥散模式（图 4A）。这种蛋白质行为的显著变化使得在使用相同参数时难以对焦点特征进行有效比较，因为在 TH1 CD4+ 细胞中，点状结构的识别大多失败（图 4A）。尽管在比较不同细胞条件下免疫荧光染色时，通常建议在图像采集和分析参数上保持一致，但当目标分子发生显著变化时，相应的调整则成为必要。
在此特定情况下，如图4B所示，尽管尝试了多种参数组合，包括调整背景参数、高斯模糊和搜索参数（参见实验方案步骤3.4.5的建议），但由于该蛋白本身固有的信号分布特性，FindFoci 仍难以区分真实的信号峰与不显著的信号峰。此外，我们强调，传统的测量方法（如细胞核MFI）可能具有误导性（图4C），因其未能考虑信号分布模式的变化。
因此，为了测量此类变化，我们建议使用变异系数，即本方案中引入的用于表征蛋白质扩散的一个指标，称为 非均质性系数 (IC）。IC 能够准确捕捉 SUZ12 焦点在 T 细胞中的扩散情况H1 CD4+ 细胞，而不采用错误的分割方法强制识别（参见 图 4D）。最后，通过使用DAPI作为对照，其在两种细胞条件下均保持均匀分布，从而进一步验证了该参数的有效性（图 4E).
图 1：免疫荧光制备与数据分析的示意图。 核蛋白免疫荧光染色与分析的实验流程包括三个主要阶段：样品制备、图像采集和数据分析，总耗时约 4 个工作日。该分析流程使用两个插件：3D Suite 用于细胞核分割，FindFoci 用于处理蛋白通道。有关焦点（foci）和细胞核的空间与定量信息分别记录在不同的 csv 文件中。一个可在 Google Colab 上运行的脚本利用细胞核的边界框将焦点测量数据与对应的细胞核进行匹配，并基于所收集的数据计算衍生参数。请点击此处查看此图的放大版本。
图2核蛋白定量分析流程设置示意图 (A) 用于显示识别焦点参数的 FindFoci 弹出窗口（实验方案第 3.4.3 节）。B) 显示 FindFoci 宏记录所选参数的弹出窗口。复制的字符串将粘贴至启动窗口中（实验步骤 3.4.6–3.5.3.4）。C) 显示使用3D管理器手动删除或修改核区域兴趣区以进行细胞核分割质量控制的面板（实验步骤 3.5.5.1 - 3.5.5.3）. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图3：基于BRD4焦点分析的不同细胞条件之间的比较。（A）人原代初始CD4+ T细胞和TH1型CD4+ T细胞中BRD4（灰色）免疫荧光染色的代表性共聚焦荧光显微图像。细胞核用DAPI复染（蓝色）。原始放大倍数为63倍；比例尺 = 5 µm。底部：通过分析流程识别出的BRD4焦点以白色箭头标记，并以黄色计数（底部）。（B）初始型与TH1型CD4+ T细胞中每个细胞核内BRD4焦点数量的箱线图（n = 2名个体）。（C）初始型与TH1型CD4+ T细胞中BRD4焦点体积（µm3）的箱线图表示（n = 2名个体）。（D）初始型与TH1型CD4+ T细胞中BRD4焦点平均荧光强度（MFI）的箱线图表示（n = 2名个体）。（E）BRD4焦点所占核体积占总细胞核体积百分比的箱线图表示（n = 2名个体）。（F）BRD4焦点从核中心到核边缘距离频率分布图（n = 2名个体）。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：非均质性系数，一种用于量化SUZ12免疫荧光信号从点状向弥散模式转变的指标。 （A）人原代初始CD4+ T细胞和TH1 CD4+细胞中SUZ12（品红色）免疫荧光染色的代表性共聚焦荧光显微图像。细胞核经DAPI复染（蓝色）。原始放大倍数63倍；比例尺 = 5 µm。底部：流程识别出的SUZ12焦点以白色箭头标记，并用橙色计数（B）。在TH1 CD4+细胞中，采用两种不同参数设置时错误识别焦点的示例，以白色箭头和橙色掩膜显示。（C）初始和TH1 CD4+细胞中SUZ12核平均荧光强度（MFI）的箱线图表示（n = 2名个体）。（D）初始和TH1 CD4+细胞中SUZ12非均质性系数（IC）的箱线图表示（n = 2名个体）。（E）初始和TH1 CD4+细胞中DAPI IC的箱线图表示（n = 2名个体）。缩写：DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；MFI = 平均荧光强度；IC = 非均质性系数。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 溶液 | 成分 | 备注/说明 | |
| TH1 培养基 | 含 GlutaMAX-I 的 RPMI 培养基，10% (v/v) 胎牛血清 (FBS)，1% (v/v) 非必需氨基酸，1 mM 丙酮酸钠，50 IU/mL 青霉素，50 μg/mL 链霉素，20 IU/mL 重组 IL-2，10 ng/mL 重组 IL-12，2 mg/mL 中和型抗 IL-4 抗体 | 步骤 1.1.4. | |
| 包被溶液 | 0.1% 聚-L-赖氨酸溶于 ddH2O | 步骤 1.2.1. | |
| PBS-T | 1x PBS/0.1% TWEEN 20，pH 7.0 | 步骤 1.3. | |
| 固定用 PFA 溶液 | 3% 多聚甲醛 (PFA) 溶于 0.1% PBS-TWEEN | 步骤 1.2.4. | |
| TPBS | 0.05% Triton X-100 溶于 1x PBS | 步骤 1.2., 1.3. | |
| 透化溶液 | 0.5% TPBS 溶于 1x PBS | 步骤 1.2., 1.3. | |
| 保存溶液 | 20% 甘油/1x PBS | 步骤 1.2.7., 1.3.1. | |
| 抗体稀释缓冲液 | 0.1% PBS-TWEEN/2% 山羊血清/1% BSA | 步骤 1.3.6., 1.3.8. | |
表1：本实验方案中所用培养基与缓冲液的组成。
补充文件 1：“convert_to_TIFF.py”。该文件包含将任意图像文件（例如 ND2、LIF 等）转换为精确量化过程所需 TIFF 文件的脚本。请点击此处下载该文件。
补充文件 2：“nuclear_prot_q.py”。该文件包含可用于测量和量化至少包含两个通道（细胞核染色、核蛋白染色）的图像的脚本。请点击此处下载该文件。
补充文件 3：“final_nuclear_protein metrics.ipynb”。该文件包含一个 Jupyter 笔记本，以“nuclear_prot_q.py”的输出作为输入，提取并汇总所有相关参数，整合为单个 Excel 文件。请点击此处下载该文件。
讨论
本研究中，我们介绍了一种在人T淋巴细胞中对核蛋白进行免疫荧光实验的方法。通过在固定和透化步骤中进行微小调整，该方法可灵活适用于多种细胞类型，如先前所述30,31。
我们的成像工作流程基于文献中已建立的技术，特别是 FindFoci 和 3D Suite22,23。与以往的研究不同，我们提供了一个集成在 Fiji 中的可执行 Jython 代码，构建了一条半自动化的分析流程，能够精确追踪参数并进行可视化质量检查。值得注意的是，我们在方案第 3.5.3.5 节中引入了可选的核分割质量调控功能，并在第 3.5.5 节中实施了校正步骤。该脚本可在 Google Colab 上运行，用户可由此获取全面的测量数据，并根据其特定的生物学场景选择最合适的参数。
所提供的分析流程使用 Jython（Java + Python）编写，执行时需要安装 Fiji，以及两个独立的插件：3D Suite 和 FindFoci（图1）。该流程首先将图像转换为 TIFF 格式，并对包含细胞核的通道应用高斯模糊滤波器进行预处理，以增强细胞核的分割效果。我们调用 3D Suite 提取两类信息：i）空间信息，如细胞核体积、质心和边界框坐标（表示包围该对象的最小方框，用于将焦点正确关联到对应的细胞核）；ii）定量信息，包括信号的平均荧光强度（MFI）和标准差。随后，流程使用 FindFoci 识别焦点信号中的局部最大值，从而避免依赖全局阈值法（此类方法通常依赖用户主观判断，可能缺乏精确性），并记录与焦点相关的空间和定量信息。因此，输出文件夹中将为每个通道生成两个 CSV 文件，分别包含空间参数（“M_.csv”）和定量参数（“Q_.csv”）。
通过在 Google Colab 上运行 Python 脚本，生成包含所有采集和衍生测量数据的最终文件。该文件包括每个细胞核的焦点数、焦点平均荧光强度（MFI）、非均一性系数（IC）、细胞核平均荧光强度（MFI）、焦点到细胞核质心的距离以及细胞核体积占据百分比等指标。我们估计每张图像的处理时间约为 1 分钟，包括视觉质量控制步骤。通过优化免疫荧光设置和分析参数，可进一步缩短处理时间。
该流程可计算同时具有明显点状和弥散模式的核蛋白的参数，使用户能够选择最合适的参数。我们建议使用非均质系数来描述蛋白焦点的溶解情况。
确保正确识别信号焦点的关键步骤是设置参数，以区分真实的信号峰与背景噪声。在运行流程之前，必须对随机图像进行充分测试。尽管本研究主要关注单个通道，但该流程支持在免疫荧光实验中引入针对不同蛋白的多种染料组合。该流程不支持多通道的同步分析，必须为每个通道单独运行。此外，本方案中仅展示特定的测量指标；但在第3.3.2节中，也可将其他指标纳入流程，例如用于评估荧光信号绝对变化的积分强度，或如圆形度和紧密度等物理参数。若需加入当前未集成到该流程中的指标，则需具备Python编程能力，以便将其整合至最终的指标文件中；否则，这些指标将自动包含在空间信息（“M_.csv”）和定量信息（“Q_.csv”）文件中。
该流程的时间取决于图像大小和数量、每次分析的通道数以及显微镜设置等因素。此外，机器性能也会影响执行时间，其中可视化步骤可能会减慢整个过程。
值得注意的是，尽管共聚焦显微镜能够提供有价值的观察信息，但它仍是一种受衍射极限限制的技术，可能影响对核结构或蛋白质焦点观察的精确性。为了增强分析的稳健性，我们建议增加检测的细胞核数量和生物学样本数量。随着分析的细胞核数量增加，无论分辨率如何受限，核形态或蛋白质分布中的显著变化都将变得更加明显。
就潜在的未来应用而言，该方法对多种细胞类型和染色方案均表现出良好的通用性和适应性。例如，该方法可直接应用于放射生物学实验中，其中对电离辐射诱导焦点（IRIFs）的精确定量是DNA损伤的直接指标32。尽管我们的主要关注点在于细胞核分析，但通过引入细胞质染料并将其替换脚本中的细胞核通道，该方案可轻松实现定制化调整。此外，该分析方法还可无缝整合到其他实验技术中，如DNA和RNA荧光原位杂交（FISH）30,31，并利用默认参数进行细胞核拓扑结构分析。
披露
R.V. 与初创公司 T-One Therapeutics Srl 存在科研合作；B.B. 和 F.M. 是初创公司 T-One Therapeutics Srl 的联合创始人；E.P. 目前受雇于 T-One Therapeutics Srl；其余所有作者声明均无竞争利益。
致谢
我们感谢INGM成像平台的科学与技术协助，特别是C. Cordiglieri和A. Fasciani，以及INGM FACS分选平台特别是M.C Crosti（意大利米兰国家分子遗传学研究所“Romeo ed Enrica Invernizzi”（INGM））。我们感谢M. Giannaccari提供的信息技术支持。本研究由以下基金资助：Fondazione Cariplo（青年项目，资助编号2018-0321）和Fondazione AIRC（资助编号MFAG 29165），资助对象为F.M.；Ricerca Finalizzata（资助编号GR-2018-12365280）、Fondazione AIRC（资助编号2022 27066）、Fondazione Cariplo（资助编号2019-3416）、伦巴第生物医学研究基金会（FRRB CP2_12/2018）、国家复苏与韧性计划（PNRR）（资助编号G43C22002620007）以及国家重要项目计划（PRIN）（资助编号2022PKF9S），资助对象为B.B.。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 安全锁扣管 | Eppendord | #0030121503 | 实验方案第1节 |
| 10 mL 血清移液管 | VWR | #612-3700 | 实验方案第1节 |
| 20 µL 防污染移液器吸头 | Thermo Scientific | #2149P-HR | 实验方案第1节 |
| 50 mL 聚丙烯锥形管 | Falcon | #352070 | 实验方案第1节 |
| 200 µL 防污染移液器吸头 | Thermo Scientific | #2069-HR | 实验方案第1节 |
| 抗荧光淬灭封片剂 - ProlongGlass | Invitrogen | #P36984 | 步骤 1.3.12 |
| BSA（牛血清白蛋白） | Sigma | #A7030 | 步骤 1.3.6、1.3.8 |
| CD4+ T 细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | #130-096-533 | 步骤 1.1.2 |
| DAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚） | Invitrogen | 货号#D1306 | 步骤 1.3.10 |
| 干冰 | 步骤 1.3.1 | ||
| Dynabeads 人 T 细胞激活剂抗 CD3/抗 CD28 磁珠 | Life Technologies | #1131D | 磁珠步骤 1.1.4 |
| EtOH | Carlo Erba | #4146320 | 步骤 1.2.1.1 |
| FACSAria SORP | BD Biosciences | 步骤 1.1.3，配备 BD FACSDiva 软件 8.0.3 版本 | |
| FBS（胎牛血清） | Life Technologies | #10270106 | 步骤 1.1.4 |
| FICOLL PAQUE PLUS | Euroclone | GEH17144003F32 | 步骤 1.1.1 |
| FIJI 软件 2.14.0 版本 | - | - | 实验方案第3节 |
| 玻璃盖玻片（10 mm，厚度 1.5 H） | Electron Microscopy Sciences | #72298-13 | 步骤 1.2.1 |
| 甘油 | Sigma | #G5516 | 步骤 1.2.7–1.3.1 |
| 山羊抗兔 AF568 二抗 | Invitrogen | A11036 | 步骤 1.3.8 |
| HCl | Sigma | #320331 | 步骤 1.3.4 |
| 人源中和性抗 IL-4 抗体 | Miltenyi Biotec | 货号#130-095-753 | 步骤 1.1.4 |
| 人重组 IL-12 | Miltenyi Biotec | 货号#130-096-704 | 步骤 1.1.4 |
| 人重组 IL-2 | Miltenyi Biotec | 货号#130-097-744 | 步骤 1.1.4 |
| Leica TCS SP5 共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | - | 实验方案第2节，配备 HCX PL APO 63x、1.40 NA 油浸物镜，额外放大 3 倍。针孔大小：0.8 AU。扫描线平均 2×。图像帧尺寸 1024×1024 像素。 |
| MEM 非必需氨基酸溶液 | Life Technologies | #11140035 | 步骤 1.1.4 |
| 显微镜载玻片 | VWR | #631-1552 | 步骤 1.3.12 |
| 小鼠单克隆抗人 CD4 APC-Cy7 抗体（RPA-T4 克隆） | BD Bioscience | #557871 | 步骤 1.1.3 |
| 小鼠单克隆抗人 CD45RA PECy5 抗体（5H9 克隆） | BD Bioscience | #552888 | 步骤 1.1.3 |
| 小鼠单克隆抗人 CD45RO APC 抗体（UCHL1 克隆） | Miltenyi Biotec | #130-113-546 | 步骤 1.1.3 |
| 24 孔多孔板 | Falcon | #353047 | 实验方案第1节 |
| 正常山羊血清 | Invitrogen | PCN5000 | 步骤 1.3.6、1.3.8 |
| PBS | Life Technologies | #14190094 | 实验方案第1节 |
| 青霉素/链霉素溶液 | Life Technologies | #15070063 | 步骤 1.1.4 |
| PFA | Sigma | #P6148 | 步骤 1.2.4 |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma | #P8920 | 1.2.1 |
| 一抗 - BRD4 | Abcam | #ab128874 | 步骤 1.3.6 |
| 一抗 - SUZ12 | Cel Signalling | 单克隆抗体 #3737 | 步骤 1.3.6 |
| RPMI 1640 培养基（含 GLUTAMAX-I） | Life Technologies | #61870010 | 步骤 1.1.4 |
| 丙酮酸钠 | Life Technologies | #11360039 | 步骤 1.1.4 |
| Triton X-100 | Sigma | #T8787 | 步骤 1.2、1.3 |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | 步骤 1.3 |
| 镊子 | - | - | 实验方案第1节 |
参考文献
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