方法文章

AC-DC 电穿透法用于研究跗库蚊在人手上的探测和摄入行为

DOI：

10.3791/66877

⸱

2024年11月29日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, Kansas State University, 2Department of Pathobiology, Auburn University, 3National Bio and Agro-Defense Facility, USDA Agricultural Research Service

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

描述了使用 AC-DC 电穿透法研究 Culex tarsalis 蚊子在人手上的探测和摄入行为的程序。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

蚊子传播的病原体会对人类和动物健康产生负面影响。更深入地了解它们的血液喂养生物学以及与宿主和病原体的相互作用，可以用来开发控制蚊媒疾病的新靶点。不幸的是，人们对蚊子的探查（即叮咬）行为知之甚少，因为它们发生在宿主组织内部。这里描述了一种非侵入性程序，该程序使用 AC-DC 电穿透 （EPG） 通过记录探测和摄入人手时产生的电信号的变化来间接可视化和量化蚊子的叮食行为。使用导电银胶将细金线连接到蚊子上，并连接到 EPG 仪器。人类主机手里拿着一个衬底电压探头。有线蚊子对宿主的探测完成了电路，电信号作为"波形"记录在计算机上，然后可以对其进行测量和列举以进行分析。该方法已被用于表征埃及伊蚊和睑库蚊的探测和吞食行为，并可应用于其他蚊子种类。EPG 可用于研究病原体、杀虫剂和其他因素对蚊子摄食行为的影响。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

蚊子由于充当病媒和滋扰害虫而在世界范围内造成痛苦和经济损失1.按蚊传播疟疾，每年导致全球约 2.19 亿例病例，超过 400,000 人死亡2，以及 120 亿美元的直接成本3。伊蚊是具有公共卫生重要性的最显著媒介，因为它们几乎遍布全球，并传播基孔肯雅热、登革热、淋巴丝虫病、裂谷热、黄热病和寨卡病毒，这些病毒夺走了生命，使卫生系统不堪重负，并导致慢性痛苦、终生发病和残疾4，5。此外，库蚊还传播马脑炎、日本脑炎、淋巴丝虫病、圣路易斯脑炎和西尼罗河热的病原体，从而影响人类和动物健康3，4。

使用基于杀虫剂的方法进行病媒控制是全球控制病媒传播疾病的领先方法6，7.然而，可用于蚊虫控制的杀虫剂数量有限。此外，许多物种的杀虫剂耐药性正在演变，尤其是伊蚊，这影响了我们对抗病媒传播疾病的能力，并推动了对新控制策略的需求6，8。更好地了解蚊子生物学、蚊子-宿主-病原体相互作用以及调节病原体传播的过程可以促进开发新的病媒控制工具6。

宿主组织中的探测和摄入行为会影响病原体传播和疾病病理学9，10，11，12。例如，当埃及伊蚊直接从毛细血管喂养而不是在破裂血管外聚集血液时，摄入了更多的微丝蚴13。因此，关于该主题的基础和应用研究有助于制定、完善和评估蚊子控制策略和其他病原体传播的对策。然而，在宿主皮肤表面下发生的隐晦的取血行为的细节中存在很大的知识空白，因为这些行为通常需要对活体动物模型进行侵入性作或采用透明的人工基质或流质饮食9，11，14，15.非侵入性电穿透法 （EPG;也称为电穿透图） 技术已被用于研究与植物病原体传播、寄主植物抗药性和杀虫剂作用模式相关的植物取食昆虫的摄食行为，因为它们允许研究人员间接观察、记录和量化宿主组织内部发生的口器运动和行为10，12。

自 1950 年代以来，电子渗透监测技术已应用于吸血节肢动物，包括蚊子16，17，18，19，20。然而，EPG 从未被广泛用于吸血节肢动物，因为与波形相对应的生物活性从未得到验证21。此外，早期仪器的设计和电子元件导致某些电信号过分强调、高噪声信号比、低分辨率和波形失真以及对脊椎动物宿主的刺激12，22。一种较新的仪器，AC-DC EPG 监测器23，具有可变设置和改进的信号处理能力，使其更适合记录吸血节肢动物并破译实验相关性研究中波形的生物学起源10，12。

对于 EPG，通过衬底电压探头（即参比电极）向主机施加电信号。节肢动物连接到记录电极并放置在宿主上。当节肢动物将其口器（即探针）插入宿主时，电信号被传送到 AC-DC EPG 监视器进行信号处理。然后，电信号在计算机上显示为与特定行为相对应的"波形"，例如口器运动、摄入、流涎和病原体获取/接种10，12。然后，可以根据波形的频率和持续时间和持续时间计算与不同层次结构级别（科、类型和亚型）的波形24，25 相关的顺序和非顺序响应变量，以深入了解物种内部和物种之间发生的摄食行为，以及对生物和非生物因素的响应。 如宿主、病原体、杀虫剂和环境条件10，12。

到目前为止，AC-DC EPG监测器已被用于表征以牛犊为食的埃及Ae. aegypti26和跗<库蚊class="xref">27蚊子以人手为食，以及以牛犊为食的Dermacentor variabilis和Amblyomma americanum蜱28。此外，最近开发了 EPG29 的小鼠模型，以促进使用该仪器进行病原体研究。人手非常适合进行初始蚊子波形表征，因为人类宿主可以报告何时感觉到蚊子的探测以及其他行为，从而更容易将波形与行为相关联（表 1）。此外，更好地了解不同人类种群蚊子摄食行为的可塑性可能有助于针对蚊子及其传播的病原体制定更专业的管理干预措施。

表 1：用于对使用 AC-DC EPG 从人手上的跗库蚊记录的电信号进行分类的波形系列描述。 对应于每个波形系列的探测相位和生物活性。有关详细信息，请参见 Cooper et al.27。缩写：AC = 交流电，DC = 直流电，EPG = 电穿透仪。请点击此处下载此表格。

为了便于使用 EPG 研究蚊子生物学和宿主-媒介相互作用，本文介绍了使用 AC-DC EPG 监测仪量化 Cx. tarsalis 蚊子在人手上的摄食行为的方法。这些协议建立在在线资源中描述的基本 AC-DC EPG 程序之上30，并假定用户具有 AC-DC EPG 和相关软件的基本工作知识31。概述的程序可以针对其他蚊子和宿主物种进行修改，并为促进蚊子摄食行为的假设驱动研究奠定基础。

表 2：常见 AC-DC EPG 术语的定义。 定义基于在线资源30，31 和科学文献32 中给出的定义。缩写：AC = 交流电，DC = 直流电，EPG = 电穿透仪。请点击这里下载此表格。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议 （IRB-10729） 已获得堪萨斯州立大学人类研究机构审查委员会 （IRB） 的批准27，仅适用于无病原体的蚊子。人类志愿者在知情的情况下同意参与研究并发布他们的数据。在开始任何涉及动物、人类或生物危害的工作之前，请确保所有程序都已由适当的机构监管委员会或监督人员审查和批准。有关本协议中使用的所有设备和材料的详细信息，请参阅材料表。

1. 初步准备和设置

  1. 使用下述修改（步骤 1.1.1-1.1.5），如前所述设置 AC-DC EPG 监视器（图 1A）、法拉第笼（图 1B，C）和软件30，31。有关设置和使用设备和软件的分步教程，请参阅在线资源30。将所需的设置保存为硬件管理和波形查看软件中的默认设置。有关常见 AC-DC EPG 术语及其定义的列表，请参阅 表 2。
    1. 将头级放大器（头放大器）和衬底电压探头连接到控制箱的通道 1。
      注意：即使 AC-DC 监测仪可以同时容纳四只昆虫和宿主，也会显示来自单个通道的记录。
    2. 确保控制箱的 Channel 1 已打开，并且 Switch 接口箱上对应的 Pre-1 和 Post-1 通道已打开><。 注意： 未使用的通道必须保持关闭状态。
    3. 使用硬件管理软件启用 DI-710 A/D 板上的通道 1 和 3（但不是其他通道）来录制前后整流信号。
    4. 格式化硬件管理软件以查看/重叠整流前和后整流波形（例如，1 = 1 表示前信号，2 = 3 表示后信号）。
    5. 在硬件管理软件上将采样率设置为每通道每秒 100 个样本（即 S/s/CHAN：100）。
  2. 构造昆虫存根26，27，29，30：
    1. 将烙铁预热至特定松香芯焊料的推荐温度。
    2. 使用剪线钳-剥线工具从 6 AWG 铜线卷末端 ~20 cm 处剥离塑料涂层，但避免切断或标记内部的铜线束（图 2A）。然后，剪断裸露的铜线束并解开成单独的股线（图 2B）。
    3. 使用尖嘴钳将一根铜线缠绕在头部下方合适的锁眼罩销轴上（即平顶），以便大部分铜线伸出销头。将电线的尾部折叠到引脚的头部以将电线固定到位（图 2C）.
      注意： 拟合测试锁眼罩引脚，以识别紧贴头部放大器端口的引脚（当它关闭、拔下并设置为 106 欧姆 （Ω） 时）。
    4. 将锁眼罩针的轴扣在辅助焊接辅助工具中，使铜线向上。然后，将一小块（~0.2 cm 球）水溶性助焊剂涂在孔罩针和铜线的交界处（图 2D）。
      注意：助焊剂有毒，必须小心处理。
    5. 展开 ~10 cm 的焊料并将其拉直。将热烙铁靠在针头上几秒钟，直到助焊剂熔化并且金属变热。然后，将焊料尖端压到烙铁旁边的引脚头，直到焊料熔化并完全覆盖接合点，将引脚和电线熔合成昆虫短线。
    6. 当昆虫存根冷却时，用钢丝绒和湿海绵清洁烙铁的尖端。
    7. 冷却后，从帮助手上取下昆虫存根。用 70% 乙醇冲洗昆虫存根，然后用水以去除残留的助焊剂。将铜线修剪到所需的长度（~3 cm，图 2E）。
    8. 重复步骤 1.2.3-1.2.7，直到构建 20-30 个昆虫存根。
  3. 组装一个昆虫吸气器26，27：
    1. 将玻璃巴斯德移液管的尖端穿过火焰，轻轻旋转移液管。重复直到移液器的末端大小合适，可以紧贴昆虫的腹部。
    2. 用蚊帐盖住改良巴斯德移液器的大端，然后将其直接插入连接到实验室吸食器的硅胶管中，并用电工胶带固定液络部以形成昆虫吸食器（图 2H）
      注意：巴斯德移液管和网可以插入一小段装有快速断开连接器的塑料管中，以便在不同尺寸之间轻松切换（图 2H）。

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图 1：用于人手记录的 AC-DC EPG 监控设备设置。（A） EPG 的组件，包括 （1） 控制箱、（2） 开关接口盒、（3） 电源、（4） DI-710 A/D 板、（5） 计算机、（6） 电源调节器和 （B） 包含 （C 的法拉第笼）） 数字显微镜 （7） 在鹅颈支架上，（8） 气泡膜和气枕，（9） 基板电压探头，以及 （10） 实验室支架上的头部级放大器。缩写：AC = 交流电，DC = 直流电，EPG = 电穿透仪。请点击这里查看此图的较大版本。

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图 2：用于为蚊子布线的记录电极和在布线过程中纵蚊子的吸虫器。（A） 去除 6 cm 塑料涂层的 20 AWG 铜线，露出内部的铜线束。（B） 铜线束的单股。（C） 一根铜线缠绕在黄铜锁眼罩销的头部，电线的尾部折叠在销钉的头部。（D） 在黄铜锁眼罩引脚和铜线的交界处涂上少许助焊剂，由辅助焊接工具固定，为焊接做准备。（E） 由焊接到铜线上的黄铜钉制成的成品昆虫存根。（F） 由金线制成的记录电极，金线缠绕在昆虫短根的铜线尖端，并用银胶固定到位。（G） 记录电极尖端的金环特写。（H） 由改性巴斯德移液器、蚊帐、塑料管、电工胶带和公快速切断器制成的组装（顶部）和拆卸（底部）昆虫吸引器，旁边是装有女性快速断开器的实验室吸引管（右上）。比例尺 = 1 厘米 （A-F），200 微米 （G）。请点击这里查看此图的较大版本。

2. 蚊子的布线

  1. 准备蚊子和银胶（EPG 前的下午/晚上）：
    1. 如前所述，后方和维护 Cx. tarsalis KNWR 菌株蚊子27。
    2. 快速成年雌性蚊子，羽化后 5-17 天，持续 8-12 小时，以提高探测率，但允许获得水以避免死亡。
    3. 准备新的银胶26，27，28，29，30：
      1. 将 510 mg 4-8 μm 银片添加到 20 mL 烧杯中。去皮天平，在银片顶部的烧杯中加入 1,100 毫克无毒的学校胶。
      2. 去皮天平，将 510 mg 8-10 μm 银片添加到胶水顶部的烧杯中，然后使用移液管加入 1,000 μL 水。
      3. 轻轻地将搅拌棒加入烧杯中，然后将其放在搅拌板上。开始缓慢搅拌，逐渐调至"快速"设置，搅拌 4 分钟。确保所有内容都已合并。
      4. 使用移液管（吸头被切断）将银胶转移到 1.5 mL 微量离心管中。
      5. 用 Parafilm 包裹银胶管的顶部并存放在工作台上直至使用><。 注意：银胶的稠度最长可达 2 天，但建议在使用前一晚制作新胶水30。
  2. 准备记录电极26，27，29，30：
    1. 使用前用力涡旋银胶。
    2. 用新鲜的保鲜膜包裹泡沫块，以容纳准备好的昆虫残根和有线蚊子。
      注意：泡沫必须足够大，以便有线蚊子可以站在表面上而不会相互接触，但又要足够小，以便放入储物箱中。注意：采血后释放的排泄液滴可能含有病原体。使用后适当丢弃保鲜膜/泡沫块。
    3. 用剃须刀片刮擦铜线顶部 1 厘米，直到四面都有光泽，从而去除铜线尖端的锈迹（如果重复使用昆虫存根，则去除旧银胶）。为每只蚊子准备一个昆虫存根，外加一些额外的昆虫。
    4. 将直径为 0.025 毫米的金线切成 4-5 厘米长的块。始终将电线固定在用胶带遮住的自闭合镊子中，以避免使电线凹陷。
      注意：在黑色背景下，金线更容易看到。
    5. 将金线的一端沿着昆虫短截线的铜线干净的尖端放置，然后将金线轻轻地绕铜线 3 次。
    6. 使用解剖探针涂抹银胶以将金线固定到位。确保没有尾巴或松散的末端。将昆虫存根放入泡沫中，直到胶水干燥。
    7. 轻轻抚摸连接到昆虫存根上的金线，使其平滑并塑造成一个长而柔和的弧线（图 2F）。将电线修剪到所需的长度 （~2.5-3 cm）。
    8. 在解剖显微镜下工作，用细尖镊子在金线的尖端做一个金环，并如下所述将金环弯曲成 90° 角（步骤 2.2.8.1-2.2.8.4;图 2E，F）。确保金环完全闭合。将昆虫存根放回泡沫块。
      1. 用非惯用手，用黄铜钉握住昆虫存根，金丝尖端接触显微镜载物台。用惯用手，用细尖镊子抓住金线的最末端。
      2. 使用细尖镊子，将金线的尖端穿过靠近金线粘合位置的昆虫短根的铜线上。将细尖镊子和金线的末端向下触摸显微镜载物台。
      3. 轻轻拉动昆虫短头，直到金线在细尖镊子的尖端形成一个小金环（不要拉得太紧）。松开金线并小心地取下镊子。
      4. 在非惯用手仍然握住昆虫存根的同时，用细尖镊子抓住金环，使镊子与金属丝的颈部成垂直角度，镊子的尖端跨越金环的中间，从而抓住环的两侧。轻轻拉动昆虫存根，同时轻轻旋转镊子远离昆虫存根，直到环与金属丝颈部成 90° 角弯曲（图 2G）。
  3. 将记录电极连接到蚊子26，27，29，30（EPG 的早晨）：
    1. 用 CO2 气体麻醉禁食的蚊子，直到所有运动停止。将蚊子仰卧在麻醉垫上，腹部面向研究人员。
    2. 将一条 ~2 cm 的实验室胶带放在解剖显微镜下，粘性面朝下。将 0.5 cm （~ 10 μL） 的银胶滴在胶带上。
      3. 使用
    3. 仅足以使腹部就位的时间，将麻醉蚊子的腹部吸入改良的巴斯德移液器中。使用吸气器将蚊子放在银胶上方的解剖镜下。
      注意：翅膀可以位于改良的巴斯德移液器尖端的内部或外部，但将它们放在内部将有助于防止蚊子脱落。避免弯曲或损坏机翼。
    4. 快速工作，将细针浸入银胶中，然后在蚊子的鼻部（即胸部的背表面）上涂上一层薄薄的一层。如果可能，请立即进行下一步（或在需要时重新麻醉蚊子）。
      注意：建议通过来回摩擦销钉来去除前缘上的鳞屑，以帮助确保胶水渗透到角质层中的孔中。避免在蚊子的任何其他部分沾上胶水。
    5. 将记录电极尖端的金环快速浸入银胶中，然后将其放在蚊子前鼻上的银胶点上。来回摇动环，确保它与前鼻部齐平。握住电线直到胶水干燥（~20-25 秒）。
    6. 以一定角度更换泡沫中的昆虫短桩，以便有线蚊子在醒来时能够舒适地站立。继续为下一个 mosquito.
      接线 注意： 建议记下每项布线工作的质量。
    7. 将所需数量的蚊子接线后，将泡沫块放入储物盒中。将蚊子保持在正常的饲养条件下，直到使用。

3. EPG 设置和准备（EPG 前一天早上）

  1. 记录前至少 30 分钟打开 AC-DC EPG 监视器（通过拨动电源上的开关），以便进行仪器平衡和任何故障排除。
    注意： 控制箱和开关接口盒上使用的通道可以保持打开状态。
  2. 打开计算机并打开硬件管理软件。
    注意：如果信号没有显示为平坦的细线，则需要进行故障排除（请参阅讨论部分）。
  3. 执行触摸 test27，30 以验证设备功能：
    1. 接地时（即裸露皮肤接触法拉第笼），将头部放大器上的拨盘转到 106 Ω并将昆虫短管的轴插入端口。
      注意：在较高的输入电阻 （Ri） 级别进行触摸测试可能会损坏头放大器。
    2. 接地后，打开头放大器，用食指和拇指牢牢抓住昆虫短截线的铜线 3 次。如果 EPG 工作正常，屏幕上的 pre- 和 post-signals 中将出现三个大峰值。如果不是这种情况，则需要进行故障排除（请参阅讨论部分）。
  4. 将仪器设置调整为 150 mV 交流电 （AC），Ri 为 107 Ω，硬件增益为 20-40 倍，负偏移，本机基线，软件增益为 8-16 倍27，30，如下所述（步骤 3.4.1-3.4.3）。
    1. 使用控制箱通道 1 上的开关和拨盘设置电压、电流类型、硬件增益（范围、增益和乘数）、偏移和基线（零><）。 注意： 适当的硬件增益设置取决于布线作业和银胶的质量，因此最佳增益设置因蚊子和日常而异。如果信号达到峰值（在表 2 中定义，如 图 3A，C）所示）或太小而无法可视化，则可能需要在录制过程中调整硬件增益。任何硬件增益变化都会永久影响录音（如 图 3A，C） 所示）。
    2. 使用头放大器上的拨盘设置 Ri 电平。
    3. 使用硬件管理软件设置和调整软件增益（例如，选择 pre 或 post 信号，然后左键单击以提高软件增益，或右键单击降低软件增益><）。 注意： 在软件中所做的任何增益更改都不会永久影响录音。
  5. 在硬件管理软件中设置新的录制，但在下一部分的步骤 4.3 之前不要开始录制。

4. 人手上的 EPG26，27 ：

  1. 获得知情同意后（由母校的 IRB 指定），让主机坐在法拉第笼旁边，一只手臂在里面，同时抓住衬底电压探针并将其保持在头部下方amp.
    注意：手臂必须舒适地放在气泡膜或类似的非导电基材上。记录时，指针和子状态电压探头不得接触法拉第笼或头放大器。为避免损坏，志愿者在头放大器打开后不得触摸它。如果意外触摸了头部放大器，请执行上述触摸测试以评估其功能。
  2. 主机就位后，将头放大器转向一侧。从储物盒中取出一只有线蚊子，然后将昆虫短管的黄铜针插入头放大器的端口，将其连接到仪器上。让蚊子悬空。
    注意： 在附近放置一个装有 70% 乙醇的喷雾瓶，以控制任何从电线上脱落的蚊子。
  3. 使用硬件管理软件开始录制。将头部放大器放在手上方，以便蚊子可以舒适地站立和探测。
  4. 接地时打开头放大器。启动 10 分钟计时器。根据需要调整主机手的位置以帮助探测成功。
    注意： 当使用倾向于立即探测的蚊子时，请先打开头部放大器，然后再将蚊子放在手上。可以使用细木销或非导电画笔手柄弯曲昆虫短根的铜线，以进一步调整蚊子的位置。鹅颈架上的放大镜或数码显微镜可以帮助在 EPG 期间观察蚊子，尤其是用于行为相关性研究。
  5. 在录制期间，使用硬件管理软件对宿主响应、蚊子行为、增益变化等进行带时间戳的观察（例如，事件标记）。根据需要调整信号在屏幕上的位置和软件增益，以使这两个信号在屏幕上清晰可见。如果信号达到峰值（图 3A、C 和表 2），或者在软件增益达到最大时波显得太小，请调整硬件增益。如果观察到整流器折叠，请调整偏移量（图 3C，C' 和表 2）。有关如何进行这些调整的详细说明，请参阅软件手册31 和在线资源 30。
    1. 要调整信号在屏幕上的位置，请选择 pre 或 post 信号（例如，单击
      1 = 1       或 2 = 3），然后将信号拖动到屏幕上的所需位置（最好靠近屏幕中间，但不能重叠）。
    2. 要调整软件增益，请使用步骤 3.4.3 中描述的硬件管理软件。
    3. 要调整硬件增益，请先向右或向左转动通道 1 的增益旋钮，以分别提高或降低增益。如果该调整不足以消除峰值（增益过高;图 3A，C）或让信号的细节清晰可见（增益太低），翻转通道 1 范围和乘法器开关以进一步调整增益。
      注意：建议使用事件标记来记录硬件增益的调整时间，以帮助解释波形数据。
    4. 要调整偏移量，请将控制箱上的通道 1 偏移开关拨到负值，然后转动通道 1 偏移拨盘，直到前信号和后信号的峰值在计算机屏幕上以相同的方向出现。如果 Offset Dial 调得太远，后信号将再次翻转。
  6. 如果蚊子在 10 分钟（或其他定义的时间点）内没有探测，请关闭头部放大器。如果蚊子在时间标记处位于探头中间，请在关闭头部放大器之前让它完成探测。让宿主小心地移开他们的手，然后用附着的昆虫存根清除蚊子。更换储物盒中的蚊子。
  7. 使用硬件管理软件停止/关闭录制。对下一个蚊子进行 EPG（步骤 4.2）.
    注意：请记住在每只蚊子之后更改文件名。
  8. 在会话结束时关闭 head amp 和电源并关闭软件。
  9. 按照批准的 IRB 中的规定，与志愿者一起审查参与者汇报声明或类似内容。
  10. 按照协议要求处理蚊子。从泡沫块上取下保鲜膜并适当丢弃。
  11. 完成所有数据收集后，查看和测量波形并如前所述分析数据24，25，26，27，29，30。有关使用波形查看软件、制作描绘波形的图表、测量波形、导出数据进行分析、进行统计分析以及常见波形响应变量的详细说明的分步教程，请参阅在线资源30。

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图 3：由于峰值输出、控制箱增益变化、劣质布线导致的电压变化不明确、整流器折叠和噪声导致的次优记录示例。 库蚊叮咬人手的波形，被 （A） 峰值输出（蓝色水平箭头）和随后的控制箱增益变化从 100 倍到 80 倍到 40 倍到 60 倍到 40 倍到 20 倍（橙色垂直箭头），（B） 电压变化不清楚，以及 （C） 整流器在后（黑色）信号中与前（红色）信号相比折叠（参见波形 J， 图 C' 中的特写）、线路噪声（仅在预整流（红色）信号中可见的 11 Hz 正弦波，图 C' 中的特写图）、峰值输出（蓝色水平箭头）以及控制箱增益从 500 倍变为 200 倍（橙色垂直箭头）。波形名称显示在每个面板的顶部。面板 C 右下角的紫色箭头表示探头完成后头部放大器何时关闭，并提供了另一个整流器折叠示例。面板 C 中与前整改信号相关的红色水平线表示何时使用事件标记来录制带时间戳的音符。Ri 电平、外加信号、时间刻度和软件增益为 （A） 107 Ω，150 mV DC，13.2 s/div，8x;（B） 107 Ω，150 mV DC，4.4 s/div，128x;（C） 107 Ω，150 mV AC，7.4 s/div，2x;（C'） 0.2 s/div，8 倍。缩写：AC = 交流电，DC = 直流电，Ri = 输入电阻，mV = 毫伏，Ω = 欧姆，s/div = 每格秒数。此图是根据 Cooper 等人的数据准备的27。请单击此处查看此图的较大版本。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AC-DC EPG记录了跗节蚊子在人手上吸食的血液（图4）生成了适合分析和发布的可解释波形27.在波形查看软件中调整压缩（定义在表 2 中定义）和软件增益时，可解释波形包含不同、可区分的重复模式，这些模式可以分为波形系列（表 1 和图 4）、类型和子类型27，31。之前在 Ae. aegypti 以人手为食26 中描述的所有波形族（J、K、L、M、N）和类型（L1、L2、M1、M2）都在 Cx. tarsalis 以人手为食产生的波形中被识别出来，验证了此处描述的方法的有效性。此外，还确定了三种新的波形类型（M3、N1、N2）和 L1、L2、M1 和 M2 的众多子类型27。此外，当口器从主机中取出时，电压下降回基线被命名为波形族 W27。

系统地改变仪器设置（电流类型和 Ri 水平），同时遵循此处概述的程序，可以确定记录跗骨跗虫吃人手的最佳设置、每个波形的电来源、每只蚊子完整和不完整探针的平均持续时间（以秒为单位），以及每只昆虫波形持续时间（以秒为单位）的统计比较 （WDI）， settings27 中每个昆虫的波形事件数 （NWEI） 和每个昆虫每个事件的波形持续时间（以秒为单位） （WDEI）。蚊子也在不同的波形中被中断并解剖以确定哪个波形与血液摄入相关27。使用类似的方法对埃及 Ae. aegypti 进行了类似的调查26。

由于 EPG 的敏感性和复杂性，并非所有录音都像 图 4 所示的那样原始。峰值过高（图 3A，C）、硬件增益变化（图 3A，C）、较差的布线作业（图 3B）、波形 J 中的整流器折叠（图 3C，C'）和电气噪声（图 3C，C'） 偶尔会扭曲和掩盖波形，使其不适合用于出版质量数据，并使评分和分析变得困难。因此，建议前端努力完善布线技能、优化增益和电压设置、调整偏移和控制电气噪声。有趣的是，整流器折叠仅在 Cx. tarsalis 的波形家族 J 中观察到（图 3C，C'），并且在最初调整偏移量后不会再次出现，即使使用其他种类的蚊子（Ae. aegypti 和 Culex quinquefasciatus）（数据未显示）。此外，故障排除显示，图 3（图 C 和 C'）中显示的不受控制的电噪声是由法拉第笼故障引起的。在有故障的法拉第笼中录制的录音仍然可用，但在建造改进的法拉第笼时，噪音问题得到了解决（图 1B）。

即使采取了所有预防措施和前端优化，蚊子电极附着质量的细微变化和其他未知因素会使信号失真并定期改变信噪比，因此有必要在录制过程中调整硬件增益，以确保信号在可见范围内，并且每个波形中峰值的分辨率足以进行波形识别和表征。 遗憾的是，在记录过程中调整硬件增益可能会导致突然的电压偏移（图 3A、C），使波形不适合发布，但仍可用于（全部或部分）测量和分析。

figure-results-1
图 4：使用 250 mV AC 的外加信号，以 107 Ω Ri 记录的跗库蚊探头的代表性波形。 系列级（NP、J、K、L、M、W）波形名称显示在每个面板的顶部。下面的面板显示了面板 A 中选定区域的放大。插入的面板显示指示区域的放大。时间尺度和软件增益为 （A） 7.0 s/div，16x;（B） 1.0 s/div，64 倍;（B'） 0.2 s/div，64 倍;（C） 1.0 s/div，64 倍;（C'） 0.2 s/div，32 倍;（D） 1.0 秒/格，64 倍;（D'） 0.2 s/div，64 倍。缩写：AC = 交流电，Ri = 输入电阻，mV = 毫伏，Ω = 欧姆，s/div = 每格秒数。此图是根据 Cooper 等人27 中的数据制备的。请点击这里查看此图的较大版本。

讨论

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使用AC-DC EPG时，对硬件和软件作30 有基本的了解并仔细遵循本文所述的协议以避免损坏设备至关重要。最值得注意的是，除非在法拉第笼上接地，否则避免在打开时触摸头放大器。建议在法拉第笼中尽可能远地记录30.笼门不一定需要关闭才能获得可解释的波形，除非在环境电噪声过大的环境中进行记录。法拉第笼中不能有任何机动的东西。需要注意的是，法拉第笼本身必须仅通过头放大器进行电气接地才能正常工作。这是通过将头放大器连接到金属实验室支架来实现的，并将油漆从支架的一英尺上打磨掉，以允许法拉第笼捕获的电流流向实验室支架，进入头放大器的金属外壳，沿着电源线到达控制箱， 通过电源进入正确接地的墙壁插座，并通过建筑物地面30 进入地球。万用表可用于通过测量各点之间的电阻率（电导率的倒数）来检查笼内组件之间的连接质量。无线 AM 收音机也可以放置在法拉第笼内，以验证门关闭时声音是否显着降低（或理想情况下消除），确认法拉第笼充分捕获了空气电信号（E. Backus per. Comm.）。

正确和标准化地制备银胶以及将记录电极连接到昆虫上对于获得可用的记录至关重要。昆虫角质层是一种绝缘体，如果银胶不能充分渗透角质层的孔隙，从而形成一条通道，使电流从昆虫内部传播到前胸板表面的金线30，则充当电容器。在每次 EPG 会话前同时准备银胶，使用管中的新鲜银胶，并在接线过程中经常更换为剧烈涡旋的银胶。确保金环靠在胸部，使整个环与角质层接触，不要向一侧倾斜或被一层厚厚的银胶和鳞片隔开，以帮助形成牢固的电气连接，并防止蚊子从电线上脱落和逃逸。

在处理不同的蚊子种类时，必须优化此处描述的协议。必须通过实验确定在给定节肢动物上记录的最佳EPG设置（Ri电平，电压，电流类型和硬件增益）12,30。但是，一旦调整了偏移量，在处理类似的蚊子时就不需要重新调整。已经确定了具有 Ae. aegypti26 和 Cx. tarsalis27 的 AC-DC EPG 的最佳设置。其他物种的波形库（定义见表 2）将有助于蚊子采用 EPG。还需要优化感兴趣蚊子的麻醉，因为吸血行为会根据蚊子种类和麻醉选择受到不同的影响。例如，跗根跗骨在用 CO2 麻醉 15 分钟后需要 4 小时的恢复期，而对于埃及跗跗，在用冰麻醉 15 分钟后，15 分钟的恢复期就足够了。然而，库蚊跗骨很难在寒冷暴露下击倒，因此尽管恢复期很长，但仍主要使用 CO2。

虽然在查看在线资源30,31或与有经验的用户进行培训后，AC-DC EPG监视器很容易使用，但需要进行一些故障排除。最初，作者对蚊子探针的 EPG 记录在预信号中出现了意想不到的 11 Hz 符号波，而 Wayadande 及其同事26 没有观察到或报告。与 E. Backus 的协商表明，法拉第笼可能是问题所在，因为地面回路会干扰。一种新的法拉第笼由高导电铜屏制成，连接到铝制框架，铝制框架用螺栓固定在由橡胶脚支撑的大铝制底板上，以将其与下表隔离（图1B），解决了11 Hz噪声信号（图3C，C'）。此外，偶尔，当 EPG 电源首次打开时，整流前和整流后信号会显示为粗而模糊的线，而不是笔直、光滑、细的线。这通常通过关闭仪器并检查所有电源线连接来解决。如果失败，拔下仪器插头 1-3 分钟通常会有所帮助。极少数情况下，前置和后置信号在作过程中会变得粗而模糊，这可以通过关闭仪器并将其插入不同的插座或使用电压调节器和电源调节器在将 EPG 连接到墙壁之前插入来解决。理想情况下，EPG 监听器的专用线路将消除与 EPG30 插入同一电路的冰箱和其他设备产生的线路噪声。

目前，使用 EPG 研究蚊子有两个主要局限性。首先，很少进行相关性研究来验证哪些探测行为与波形相对应。虽然对每个波形族（表 1）和某些波形类型（M1 和 M2）中发生的情况有很强的假设，但除了血液摄入与波形族 M26,27 相关外，这些假设中很少有得到实验证实。最重要的是，必须识别与唾液分泌事件相对应的波形，因为许多病原体在唾液中传播。需要将 EPG 波形与蚊子的生物活动相关联，以有意义地解释治疗组之间波形持续时间和计数的显着差异。其次，EPG 期间的探测和摄取率可能远低于预期27。将蚊子单独拴在短线上并将它们直接放在宿主身上可以防止远距离寻找宿主和社交进食行为，从而影响探查和摄入行为。正确接线的昆虫可以正常行走和飞行。尽管如此，蚊子还是经常拉扯电线，有时会缠结或以不自然的角度保持自己，这表明被电线连接会在某种程度上影响它们的行为。作者测试了许多策略来提高 EPG 期间的探查率，让蚊子禁食过夜，使用老年人，在将它们放在手上之前立即将它们暴露在人类呼吸中，并将人类唾液涂抹在手上是最有效的，以及使用宿主不断对手的位置进行精细调整，以确保蚊子处于探测的理想位置27。

尽管存在这些限制，但与其他研究探测和摄入行为的方法相比，AC-DC EPG 具有许多优势。BiteOScope11、flyPAD15 和自动化生物材料平台14 等系统旨在量化喂血过程中的探测和摄入行为以及唾液分泌物，利用缺乏正常宿主组织系统和宿主线索的透明人工底物和流质饮食。虽然这些合成平台可用于许多实验目的，但 AC-DC EPG 的一个明显优势是能够研究自然宿主系统中这些节肢动物行为和感兴趣的变量。此外，与其他EPG仪器22,33和类似EPG的电子监测设备16,21相比，AC-DC EPG系统的用户定义适应性提供了额外的优势，后者没有可调节的Ri电平、电流类型和电压电平，这些电平是获得具有最大信息量的波形并最大限度地减少对广泛的宿主和节肢动物的不利影响22所必需的，23.肌电图 （EMG） 技术也用于研究血液喂养。然而，电路通常只包括节肢动物，并且只记录最靠近记录电极的肌肉电位，因此波形不提供有关宿主-昆虫界面发生的详细活动的信息，如细胞破裂、管心针位置和活动以及通过口器的流电位28,34.活体显微镜技术可用于直接可视化活宿主组织中详细的口器运动和活动，但这些技术涉及活体动物模型的侵入性程序9。只有 AC-DC EPG 监测仪才能实时提供有关活体不透明宿主组织中发生的探测、摄入和流涎行为的高度详细信息，而无需侵入性程序，并且适用于各种节肢动物10,12。

这是第一个为蚊子接线、构建昆虫吸虫器和对人类宿主进行 EPG 的详细分步程序。这些协议有望促进对以人类宿主为食的蚊子采用 AC-DC EPG。未来使用 AC-DC EPG 的研究工作的例子可能包括对血液喂养和宿主组织损伤的基本机制的研究10，包括识别采血前探查行为的刻板序列，研究通过口器的血流，以及节肢动物物种/发育阶段内和之间的摄食可塑性的比较26.EPG 还可用于量化杀虫剂、抗饲喂剂和驱虫剂的影响12。这里介绍的使用 AC-DC EPG 研究人手上的蚊子的程序将加速这些研究，并为蚊子采血者生物学提供新的见解。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有需要披露的利益冲突。本出版物中提及商品名称或商业产品仅用于提供特定信息，并不意味着美国农业部的推荐或认可。本报告中的结论是作者的结论，并不一定代表美国农业部的观点。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢俄克拉荷马州立大学的 Astri Wayadande 教授开创了蚊子布线程序，感谢加利福尼亚州帕利尔 USDA-ARS 的 Elaine Backus 博士和佛罗里达州盖恩斯维尔 EPG Technologies Inc. 的 Andrew Dowell 先生在排除 EPG 设备故障方面的帮助。我们还感谢堪萨斯州曼哈顿 USDA-ARS 昆虫馆的 Dustin Swanson 博士和 William Yarnell 先生提供蚊子，以及堪萨斯州曼哈顿堪萨斯州立大学的 Miriam Ruhinda 小姐协助拍摄程序视频。这项工作是通过访问堪萨斯州立大学的综合分子昆虫学核心 （IEMC） 实现的。这项研究得到了美国农业部研究、教育和经济劳动力发展协议 （#58-3022-0-002） 和哈奇多州项目 （NE1943） 的支持。这份手稿是来自美国堪萨斯州曼哈顿堪萨斯州立大学堪萨斯农业实验站的第 24-194-J 号投稿。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Instrumentation
AC-DC 4 通道电穿孔仪EPG Technologies， Inc.对于 EPG，包括电源、控制箱、开关接口盒、四个头级放大器、四个衬底电压探头和相关电线
供人类主机在 EPG 期间将手/手臂放在Amazon.com
DI-710 数据采集硬件（AD 板）DATAQ Instruments Inc.用于数字化模拟 EPG 信号，以便它们可以在计算机上可视化
可调光 LED 放大灯、大型 5 倍免提放大镜带灯和阅读支架 爱好 工艺品 缝纫工作台Amazon.com用于在 EPG 期间进行行为观察;仅在 EPG 期间拔下电源使用，否则可能会产生噪音
Dino-Lite Edge 数码显微镜（250 倍放大倍率）Dino-LiteAF4915ZT用于 EPG 期间的行为观察
Dino-Lite Flex-arm 桌面支架Dino-LiteMS22B用于固定和作相机
Eisco 钢制蒸馏器底座和杆套件Fisher ScientificS41740用于固定头级放大器和将法拉第笼接地（必须由金属制成）
EPG 在线研讨会UF IFAS 扩展https://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022又名，用于学习 EPG 的"在线资源"（仪器设置、数据收集和分析、法拉第构建、银胶制备、昆虫存根构建等）
Furman P-1800 AR 功率调节器/功率调节Amazon.com用于降低线路噪声
小型气泡缓冲包装Amazon.com用作主机和法拉第笼之间的屏障
Troemner Talboys Labjaws 常规夹具支架Fisher Scientific02-217-121用于固定头级放大器和将法拉第笼接地（必须由金属制成，不得涂有塑料涂层）
Windows 电脑EPG 和统计分析百思买
软件
Backus 2.0 数据分析 SAS 程序 UF IFAS 扩展https://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/用于波形数据的统计分析
Ebert 1.0 文件纵器和错误检查器 SAS 程序UF IFAS 扩展https://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/用于准备波形数据统计分析的文件
SAS 版本 9.4SAS Institute Inc.用于波形数据的统计分析
WinDaq Lite DATAQ 仪器公司用于记录和查看 EPG 数据。 包括 WinDaq 硬件管理器软件（又名"硬件管理软件"）和 WinDaq 波形浏览器软件（又名"波形查看软件"）。仅适用于 Windows 计算机。 
法拉第笼
铝屏幕框架家得宝MSCF5167用于法拉第笼的墙壁
铝板，0.125 （1/8）厚 3003-H14仓库用于法拉第笼的底座
角撑，1" 家得宝339547法拉第笼的墙壁
平头菲利普斯机械螺丝，#6-32 x 1"家得宝法拉第笼构造
垫圈，#6 用于法拉第笼结构Home Depot638977
用于电气应用的 Fluke 15B+ 数字万用表，可测量高达 1000V 和 10A 的 AC/DC 电压和电流测量，以及用于测试法拉第笼
便携式收音机AM FM，Goodes晶体管收音机带大喇叭，耳机插孔，2AA电池供电的收音机，用于远程接收，用于室内、室外和紧急使用的袖珍收音机Amazon.com测试法拉第笼
纯铜屏幕，16 x 16网格，0.11线径，36" x 12'地铁屏幕适用于法拉第笼的墙壁
圆头组合机器螺丝， #6-32 x 3/4"家得宝528466用于法拉第笼建设
砂纸，1/2" x 1"，150家得宝19036-20-CC用于从实验室支架底部去除油漆
屏幕框架角落，5/16" 家得宝WCORN516法拉第笼
屏幕花键的墙壁，0.14" 家得宝3034719法拉第笼
的墙壁昆虫存根
黄铜挡板销家得宝801294用于构建昆虫存根的  
铜线，20 AWGAmazon.com用于构建昆虫短根  
哈里斯水溶性流感 家得宝355398用于帮助焊锡涂覆昆虫短丝并形成牢固连接
尖嘴钳家得宝，用于在构建昆虫短丝时弯曲金属丝
Pro's Kit 900-015 助焊辅助 Amazon.com，用于在焊接过程中固定锁眼罩针
焊料（带松香芯）家得宝296497用于构建昆虫存根  
剪线钳剥线工具得宝，用于在构建昆虫存根时剥线和切割铜线
艺华 928D-III 烙铁，110W 大功率，全数字显示烙铁Amazon.com用于构建昆虫存根;配有支架、海绵和用于清洁的钢丝绒
昆虫吸气器
Accuris ASPIRE实验室吸液器Accuris仪器V0020，用于对昆虫吸液器进行抽吸;包括手持式真空控制器、细尖（40 mm）不锈钢适配器和移液器吸头适配器
Chemglass Life Sciences 巴斯德移液器，5 3/4英寸长Fisher ScientificNC0230004，用作蚊子布线时的昆虫吸液器
商用电动彩色乙烯基电工胶带家得宝，用于将改良的巴斯德吸管连接到真空管
上 蚊帐实用织物，10 x 10 厘米见方乔安织物防止蚊子被吸入真空泵的
16651622 圣戈班高性能塑料管 Tygon 1/4 x 7/16Fisher Scientific50-206-8914用于在不同改良型巴斯德移液器之间快速轻松地切换
Thermo Scientific Nalgene HDPE 快速插拔接头（3/8 至 7/16 英寸）。同上。Fisher Scientific15-315B可在不同的改性巴斯德移液器之间快速轻松地切换
Silver Glue 
Elmer's Glue-All多功能白胶Amazon.com用于银胶制备
银片99.9%纯度，  4-8 µmThermoFisher786.09用于银胶制备
片 99.95% 纯度，8-10 和微量;mInframat Advanced Materials47MR-12F用于银胶制备
昆虫麻醉
CO2 起泡器套件，1000 mL，#9 橡胶塞FlyStuff59-181用于防止使用Flypad Flypad时昆虫干燥
 框架，标准尺寸FlyStuff59-118用于防止蚊子从 Flypad 上掉下来
Flystation 刷 FlyStuff59-205用于减少在飞行垫上工作时的静电
Flystuff 飞垫 标准尺寸的FlyStuff59-114又名"麻醉垫"，用于麻醉蚊子
漏斗（直径 4 英寸）Amazon.com用于在转移到 Flypad 之前给蚊子杯充气
Plexi 玻璃或扁平塑料盖（按尺寸切割）Home DepotMC-27用于在蚊子开始醒来
时覆盖 Flypad关闭塑料管软管夹 单位置和可调开 （1/8" 至 1/2"）Amazon.com用于在 Flypad 和漏斗之间转移气体
单级 CO2 调节器FlyStuff59-142用于调节来自 CO2 罐的气体流量
"T”用于 1/8 英寸内径管道的接头FlyStuff59-123用于将 Flypad 和漏斗连接到 CO2 罐
管道，透明 FlyStuff59-124C用于将漏斗和 Flypad 连接到 CO2 tank
Insect Wiring
Black 卡纸，（65 磅，176 克/米<>2） 8.5 英寸 x 11 英寸Michael's Stores Inc.327826使金线更容易可视化
黑色建筑纸方块 3.5 英寸 x 4.0 英寸书钉956221使金线更容易可视化
禁食蚊棉球Amazon.com
工艺泡沫 #12 块（3.1 厘米 x 17.2 厘米 x 30.2 厘米）乔安织物和工艺品店1941079用于固定有线蚊
Deflecto 丝带分配器，用于存放金线Amazon.com
羽量级昆虫学镊子Fisher ScientificS72110用于昆虫作
细镊子（FST by Dumont：#5 91150-20，Inox-Electronic）精细科学工具91150-20，用于在给蚊子布线时制作金环
细点油漆刷Amazon.com用于在布线和 EPG 期间纵蚊子;如果用于 EPG，必须有塑料或木制手柄
细头标准移液管，窄，5.8 mLThomas Scientific7761D21，用于银胶制备
金丝，纯度 99.99%，厚度 0.025 mm古德费罗AU005121用于给蚊子布线
细针，尖端 0.2 mm，1 cmFisher ScientificNC9681411，用于将胶水涂在蚊子上
纸杯 硬纸管   
销虎Fisher Scientific50-996-811，用于在昆虫布线过程中固定小针
带盖塑料储物盒（7 英寸 x 9 英寸 x 14 英寸）Amazon.com用于运输有线蚊
有机玻璃或扁平塑料盖（按尺寸切割）家得宝MC-27用于在蚊子开始醒来时覆盖飞垫
Fisher Scientific关闭镊子08-906用于固定和作金丝
压缩气体
CO2 气罐Matheson Gas用于用飞垫麻醉蚊
常见实验室物品
生物危害一次性高压灭菌袋，8 1/2 英寸 x 11 英寸Fisher Scientific03-410-591用于处理吸血蚊子
改造巴斯德移液器本生灯或丙烷火炬Amazon.com
彩色实验室胶带Daigger 用品EF9763R用于贴标、制备银胶和遮蔽镊子
一次性移液器吸头，1000 和微量;LFisher Scientific 用于在制作银胶时分装水
解剖显微镜为蚊子布线的显微系统
解剖探针Fisher ScientificNC9109673用于搅拌  和涂抹银胶
锥形瓶，1000 mLFisher Scientific 防止使用Flypad Ethanol时昆虫干燥
，70% Fisher Scientific04-355-122用于回收逃逸的蚊
玻璃培养皿Fisher Scientific08-747B用于用冰麻醉蚊
子 手套Fisher Scientific用于个人防护
Kimwipes KimTech Science 品牌精密任务擦拭器 Fisher Scientific06-666用于粉碎蚊子
实验室外套Fisher Scientific用于个人防护
LiBa 喷雾瓶，可再填充的空喷雾瓶（外用酒精安全）Amazon.com用于回收逃逸的蚊
磁力搅拌棒，2 厘米长Fisher Scientific 用于混合银胶
单通道移液器，1000 &LFisher Scientific 13-690-032用于在制备银胶时分装水
离心管，1.5 mLFisher Scientific 780420用于存放银胶
Parafilm M Fisher Scientific50-998-944用于密封银胶管
覆盖泡沫块保鲜膜Amazon.com
Pyrex 20 mL 烧杯Fisher Scientific 07-250-051用于混合银胶
半微量平衡Fisher Scientific 10-919-370用于称量胶水和银片
标记细尖Amazon.com
单刃剃须刀片电子显微镜科学71980用于清洁昆虫存根
标准一次性移液管Fisher Scientific 133-711-7mL用于将银胶转移到储存管中 
搅拌板Fisher Scientific 用于混合银胶
计时器/秒表Fisher Scientific用于计时宿主暴露于每种昆虫
超纯 （18 MΩ） 水Fisher Scientific 用于银胶制备
实用剪刀Fisher Scientific08-945用于切割金线
Vortex mixerFisher Scientific 用于混合银胶
研究生物
Culex tarsalis美国农业部 ARS 位于堪萨斯州用作研究对象
上面 气枕器 金属用于459999平的 的电阻、连续性、二极管和电容 Amazon.com 功能 用于粒度 适用于适用于，家银， 订 用于子的子 的透明 ，用于禁食蚊子的钳 子 自动子用于的 徕卡用于子 子 机械微量用于的用于的的时间 蚊子 曼哈顿的谷物和动物健康研究中心，

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