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有限垫料和筑巢作为小鼠早期生活逆境的模型

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DOI：

10.3791/66879

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2024年7月12日

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1Neuroscience Institute, Georgia State University

本文内容

摘要

本方案描述了一种动物模型，用于研究生命早期逆境（由贫瘠的环境和出生后早期阶段不可预测的母体照料所引发）对大脑发育及未来精神障碍风险的影响。

摘要

生命早期逆境（ELA），例如虐待、忽视、资源匮乏以及不稳定的家庭环境，是导致抑郁症等神经精神疾病已知的风险因素。研究者常使用动物模型来探究慢性应激对大脑发育的影响，其中通常通过操控母体照料的质量和/或数量来模拟ELA，因为母体照料是包括人类在内的哺乳动物生命早期经历的主要来源。本文提供了一种在小鼠中应用“有限垫料与筑巢材料”（LBN）模型的详细实验方案。该模型通过限制母鼠可用于为其幼鼠筑巢的垫料量，并在笼内使用网状平台将小鼠与垫料分离，从而模拟资源匮乏的环境，导致在关键发育期（出生后第2至9天）母体照料呈现碎片化和不可预测的模式。文中提供了代表性数据，用以展示LBN模型所引起的母体行为改变、幼鼠体重减轻以及基础皮质酮水平的长期变化。成年后，LBN环境中抚育的后代 表现出异常的应激反应、认知缺陷以及类似快感缺失的行为。因此，该模型是研究ELA如何改变应激敏感脑环路成熟过程，并导致长期行为改变从而增加精神疾病易感性的重要工具。

引言

出生后的早期是一个关键的发育窗口期，在此期间，环境因素可能改变发育轨迹。例如，生命早期逆境（ELA）可改变大脑发育，从而引发认知和情绪功能的长期变化。ELA 的实例包括儿童期或青春期发生的身体或情感虐待、忽视、资源匮乏以及不可预测的家庭环境1。已知 ELA 是导致抑郁症、物质使用障碍、创伤后应激障碍（PTSD）和焦虑症等疾病的风险因素2,3,4,5。这一点尤为重要，因为美国儿童贫困率最近已超过翻倍，从2021年的5.2%上升至2022年的12.4%6；尽管贫困本身不一定属于 ELA，但它确实增加了遭遇各类 ELA 的可能性7。

动物模型长期以来对于理解生命早期应激对大脑发育及成年期结局的影响至关重要。近年来用于解析这一现象的两种主要动物模型是母体分离（maternal separation, MS）和通过限制垫料与筑巢材料诱导的贫瘠环境（limited bedding and nesting materials, LBN）。MS模型最初被设计用于模拟亲代剥夺8，其操作方式通常是在断奶前每天将啮齿类幼崽与其母体分离数小时8。研究表明，MS范式可导致成年期出现类似抑郁和焦虑的行为9，以及对慢性应激产生异常反应10,11。另一方面，LBN模型最初由Baram实验室建立12，该模型并不将母体与幼崽分离，而是通过改变幼崽的养育环境来模拟资源匮乏的条件12,13。在该模型中，减少筑巢材料的数量并限制幼崽直接接触垫料，会导致母体照护行为紊乱3。由于稳定且可预测的母体照护对于认知与情绪相关脑环路的正常发育至关重要14，因此LBN引起的碎片化母体照护可能导致一系列后果，包括下丘脑-垂体-肾上腺（Hypothalamic-Pituitary-Adrenal, HPA）轴过度活跃、多个脑区兴奋-抑制平衡偏移、促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin-releasing hormone, CRH）水平升高，以及子代出现类抑郁行为13,15,16,17,18,19。

早期生活逆境（ELA）导致神经精神障碍风险增加的确切机制尚未完全阐明。目前认为这与下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴神经回路的改变有关19,20，最近的证据表明，这可能是由于小胶质细胞突触修剪功能发生变化所致19。限制垫料与筑巢（LBN）模型已被证明是理解围产期环境对大脑发育及长期行为结局影响的关键工具。尽管该模型最初是为大鼠建立的，但现已成功应用于小鼠，以便利用现有的转基因技术工具12,13。值得注意的是，该模型在两种物种中表现极为相似，并引发高度一致的结果，如下丘脑-垂体-肾上腺轴功能改变、认知缺陷 以及类似抑郁的行为，从而凸显了其跨物种的适用性和转化研究潜力。本文将详细描述如何在小鼠中应用限制垫料与筑巢模型，包括母代行为及子代结局的采集与分析，以验证模型的有效性及预期结果。

方案

所有涉及动物的操作均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的规定，并经佐治亚州立大学机构动物护理和使用委员会批准（批准编号 A24011）。小鼠在佐治亚州立大学动物实验中心内繁育并饲养。实验使用 C57BL/6J 品系小鼠，在围产期（出生后第 [P] 2–10 天）进行，包括雄性和雌性个体。本研究中所用试剂和设备列于材料表中。

1. 材料准备

  1. 根据笼具尺寸裁剪网状隔板，较长的两边各留出 3 cm 的余量。
    注意：材料表中提供的网状材料由制造商预先裁剪。
  2. 将边缘（包括多余部分）折叠，形成一个与笼具边缘完全贴合、且高出笼底约 2.5 cm 的平台。这样可使尿液和粪便穿过网状隔板，同时防止动物取回玉米芯垫料。最后，确保所有锋利边缘均向下折叠，以避免对动物造成伤害。
    注意：网状隔板可重复使用，每次使用后应使用热水和肥皂彻底清洗，并用 70% 乙醇喷洒消毒。
  3. 将摄像头安装在三脚架上，并设置好录像系统。
    注意：建议使用视频管理软件。录像将生成自动分割为 1 小时一段的 .mp4 文件。
  4. 将录制模式设置为连续录制。
    注意：建议的其他设置包括 1920 x 1080 分辨率和 30 帧/秒。
  5. 如果视频管理软件未自动分段，应将生成的 .mp4 文件手动设置为每 1 小时分割一段。
  6. 若需分析关灯时段的行为，请使用红外照明。
    注意：为减少笼具侧面的录像反光，建议关闭摄像头自带的红外功能，而在黑暗期录像时使用房间内的红外泛光灯。

2. 有限垫料和筑巢材料（LBN）范式

  1. 将1至4只雌鼠与一只单独饲养的雄性种鼠配对。
    注意：实验雌鼠首次配对的推荐时间为出生后第75天（P75）。使用未产仔的雌鼠最为理想；但在某些不可行的情况下（例如珍贵的转基因小鼠品系），经产雌鼠仍可持续繁殖约四个月。建议（非强制）每天检查阴道栓以确认交配日期（胚胎发育第0天[E0]）。
    1. 一旦雌鼠怀孕，应尽量减少干扰。
      注意：经产雌鼠通常可在生育力下降前重复使用以生产最多五窝仔鼠。若在实验中重复使用母鼠，应优先每次用于相同实验条件，或仅允许从对照组转为LBN组，但绝不可反向转换，以避免LBN对母鼠产生任何残留的长期影响。
  2. 在E17（或若未检查阴道栓，则在雌鼠明显怀孕时），将雌鼠单独移入标准的聚碳酸酯笼中，并提供一个棉质筑巢垫料（5 × 5 cm），供其筑巢。
    注意：为设置对照组和LBN组，最佳做法是将分离后的雌鼠转移至远离主饲养室的安静小房间，保持12小时光照/12小时黑暗循环，并尽量减少人员干扰。
  3. 记录出生日期（约E19）。
  4. 在出生后第2天（P2），统计仔鼠数量并鉴定性别。将窝随机分配至LBN组或对照组（若为母鼠的第一窝）。该操作应在光照开启后1至4小时内完成。
    1. 小心地将仔鼠放入一个新的清洁笼中进行性别分类。雄性仔鼠的肛门与生殖器之间的距离大于雌性，可据此进行辨别。
    2. 按性别分组并计数。
    3. 剔除超过8只仔鼠的窝，丢弃少于4只仔鼠的窝。理想的窝大小为4–8只仔鼠，超出此范围可能干扰实验期间母鼠照料行为的正常分布。
      注意：窝大小可能影响仔鼠体重、摄食机会以及母仔互动等变量，从而干扰实验结果。理想情况下不应进行交叉哺育，因为小鼠在此类操作下的存活率低于大鼠。
  5. 按照图1所示设置对照组和LBN组条件。
    1. 对照组：使用标准尺寸的小鼠鞋盒式笼具（19.4 cm × 13.0 cm × 38.1 cm），铺约220 g玉米芯垫料（根据笼具尺寸调整，目标厚度约为1 cm），并放置一个标准方形棉质筑巢垫料（5 × 5 cm）。
      1. 为帮助小鼠适应这一陌生环境，从原笼中取粪便颗粒各置于新笼的四个角落。此外，在新的筑巢垫料上覆盖少量旧笼中使用过的棉质材料（约硬币大小）。
    2. LBN组：在标准鞋盒式笼具中放入预先准备好的金属网隔板，并铺设约110 g玉米芯垫料（目标厚度约为0.5 cm）。金属网应防止小鼠直接接触玉米芯垫料。
      1. 最后，添加半个棉质筑巢垫料（2.5 × 5 cm）。重复上述所有步骤以促进适应。
        注意：建议将鞋盒式笼具置于标准非通风笼架上，已有研究表明该设置较为安静，且不会导致LBN组仔鼠出现低体温21。然而，在通风笼具中气流增强的情况下可能不适用；因此，若使用通风笼具，研究人员应在自身系统中测量噪音水平及仔鼠核心体温。
  6. 将仔鼠放入指定的笼具中，并放置于筑巢垫料上方。随后将母鼠放入笼内，使其面向仔鼠，有助于其更快察觉仔鼠的存在。确保提供足够的食物和饮水，至少维持8天，以避免在实验结束前（P10）再次干扰笼具。
  7. 在笼具前方架设摄像机于三脚架上，以获得母鼠及其仔鼠的清晰侧视图像。可选择在笼具周围放置镜子，以更好地捕捉各个角度的画面。尽管每天仅需分析1小时的视频记录，但摄像机应设置为在整个实验期间持续24/7录制，以便监测任何干扰事件。
    注意：也可由人员现场观察并手动记录母性行为，但推荐采用视频录制方式，以避免实验人员在场造成干扰。若使用通风笼架，可能需要采用不同于本文所述的方法来布置摄像设备以记录母性照料行为。
  8. 在P10早晨，将所有动物恢复至标准饲养条件（理想情况下与上述对照组条件一致），并对仔鼠称重。
  9. 对所有仔鼠进行相同处理，并在P21断奶，按性别将同窝仔鼠分为每组2–5只。
    注意：应尽可能将同性别同窝仔鼠合笼饲养；若必要，可将不同窝但同性别且处于相同实验条件的后代合笼。建议避免将对照组与LBN组的后代合笼饲养（参见Yang等关于笼伴组成对行为表型影响的研究22）。

静态平衡、实验装置、谷物样品比较、分析托盘、实验室研究。
图1：笼具装置示例。 图像左侧的笼具显示的是标准对照（CTL）组，其中包含足量垫料和完整的一块筑巢材料。右侧的笼具则为限制垫料和筑巢材料（LBN）组，仅含一半量的垫料、半块筑巢材料，并配有网状隔板，用于将动物与垫料隔开。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 母代行为评分

  1. 尽管在此实验设置中持续采集记录，但仅分析 P3 至 P6 期间的 1 小时数据。建议分析在光照条件改变后至少 1 小时开始录制的视频，以允许动物适应环境，并确保每天在一致的时间段进行分析。
    注意：P3 至 P6 期间通常因低丰度育幼（LBN）而表现出最显著的母性照料差异，因此仅需分析这些天的数据。建议的观察/记录时间可捕捉从活跃期转为非活跃期或反之的活动变化。然而，母鼠最可能在非活跃期进行母性照料，且先前研究已表明该阶段母性行为的组间差异最为显著3。
    注意：P2 的录像应比其他天更晚开始，因为小鼠至少需要 1 小时来适应笼具更换。除非笼具更换本身是研究关注的变量，否则应将这一天的数据从分析中剔除。
  2. 根据表 1中列出的行为类型，对所有行为进行评分。通常，在数据采集开始后的前 50 分钟内对行为进行评分。
    注意：该过程可通过手工完成，也可使用行为观察研究交互式软件（Behavioral Observation Research Interactive Software, BORIS，一款开源软件）或其他类似软件进行电子评分。以下说明基于手工评分，但可根据所选软件进行相应调整。
  3. 在打印的表格中，使用行为缩写记录所观察到的行为、行为发作的起始时间与持续时间，以及任何描述性备注。例如，若母鼠正在主动哺乳，随后离开巢穴但幼崽仍附着在其身上，应记录为 AN，后接 O。关于仍附着在母鼠身上的幼崽（及其数量）的描述应作为侧边备注保留，以备后续需要。
    注意：持续时间少于 3 秒的行为不予分析。此规则有助于滤除由外界干扰（如环境噪音）引起的瞬时行为。但若在 AN 行为过程中出现明显中断（如因大幅度移动或伸展），且行为迅速恢复，则例外处理。此时应记录为 AN，后接 N-AN，具体参见表 1中的说明。
  4. 当多个行为同时发生时，记录最显著的那个行为。例如，若母鼠最初处于低哺乳状态，随后开始舔舐和理毛，则应记录低哺乳行为结束，下一个行为标记为 LG，并备注该行为发生在 LN 期间。
行为类型缩写描述
舔舐/理毛LG母鼠正在舔舐或理毛其幼崽。
主动哺乳AN母鼠以站立姿势哺乳幼崽，背部呈弓形。
新主动哺乳N-AN该行为特指母鼠中断哺乳后迅速恢复哺乳的情况。此为3秒规则的例外。
低体位哺乳LN母鼠正在主动哺乳幼崽，但其背部较低或几乎呈平直状态。该行为通常在主动哺乳持续一段时间后出现。
侧卧哺乳SN母鼠侧卧哺乳幼崽（也称为被动哺乳）。
离巢O母鼠不在巢中，且未进食或饮水。可观察到其在笼内走动或探索。
进食/饮水E母鼠离开巢穴进行进食或饮水。
自我理毛SG母鼠正在理毛自身。
搬运幼崽C母鼠搬运幼崽，通常是为了将其重新放回巢中。
筑巢NB母鼠正在积极构建或调整巢穴。
在巢上移动M母鼠在巢上移动。表现为母鼠以不同于舔舐/理毛或任何哺乳方式的行为与幼崽互动，例如嗅闻、直立或踩踏幼崽。

表1：母性照料行为的描述。

4. 母代行为数据的分析

  1. 将评分结果整理到电子表格中。
  2. 如果视频是通过电子方式分析的，则删除持续时间短于3秒的行为片段，具体操作如步骤3所述。
  3. 计算每次观察日内舔舐和理毛行为的平均持续时间、平均频率以及总持续时间。
    注意：可对任何已评分的行为进行描述性统计分析，但舔舐和理毛行为通常在LBN作用下表现出最明显的片段化特征（即持续时间更短、频率更高）。这些变量可计算P3至P6日的平均值进行分析，也可按天数作为重复测量数据，以考察随时间变化的趋势（如有需要）。

5. 熵的计算

注意：母体护理行为的熵（即不可预测性）是根据 Vegetabile 等人提出的方法计算的23。该方法基于母体护理行为构成马尔可夫链的假设，可用于估计行为序列的熵率。每只母鼠的行为序列通过条件概率从一种行为（i）转换为另一种行为（j）的经验转移矩阵ij> i,j = 1…7进行表征，熵率则如前所述3,23并按以下公式计算：
熵公式；Σ 和 log 符号；信息论；数学方程；研究分析
其中 pij 表示在观察到母鼠执行行为 i 后紧接着观察到行为 j 的条件概率，πi 表示行为 i 被观察到的频率，M（=7）为不同行为的总数。有关该方程理论基础的讨论，请参阅 Vegetabile 等人的研究23；此处重点介绍如何在 LBN 模型中应用该方法。

  1. 为进行此项计算，需先整理分析所需的数据格式。
    1. 将 AN、LN、SN 和 N-AN 四项行为的时间相加，合并为一个名为 N 的变量，因为这些行为均属于育幼行为。
      注：母体护理行为的详细说明请参见表 1。
    2. 将不涉及自身或幼崽指向行为的行为（M 和 O）合并至 O。
    3. 将 LG、E、SG、C 和 NB 分别单独输入，最终共得到 7 种行为。
  2. 创建一个电子表格，其列按以下顺序排列：小鼠编号（Mouse ID）、窝编号（Litter ID）、产仔次数（Litter #）、处理方式（Treatment）、天数（Day）、时间（Time）、行为（Behavior）和状态（Status）。
    1. 在小鼠编号（Mouse ID）中，添加母鼠的品系/基因型信息。
    2. 在窝编号（Litter ID）中，使用母鼠的标识符后接产仔序号。
    3. 在产仔次数（Litter #）中，标明该母鼠的产仔顺序次数。
    4. 根据动物所处的实验条件，确保处理方式（Treatment）标注为 LBN 或对照组（Control）。
    5. 天数（Day）应填写对应分析的出生后天数。
    6. 时间（Time）应填写行为在视频中开始和结束的时间戳（相对于录像开始的时间）。
    7. 从前述七种行为（N、O、LG、E、SG、C 和 NB）中选择相应行为（参见表 1）。
    8. 标记两种状态：START（开始）和 STOP（结束）。因此，每种行为将出现两次，第一次表示行为开始，第二次表示行为结束。
  3. 按照此格式，汇总所有分析天数的数据信息。
  4. 在 R 环境中导入已按上述格式整理好的数据集。
  5. 安装位于 https://github.com/bvegetabile/entropyRate 的软件包。
    注：运行该代码将生成一个名为 LBN 的文件夹；无论实验条件如何，该文件夹均包含计算所得的熵值。此外，可将每个个体在 P3–P6 各天的熵值进行平均，并在不同条件下进行比较。

结果

代表性结果展示了在LBN笼具所营造的贫瘠环境中施加的早期生活应激（ELA）如何影响母鼠的育幼行为及其子代的生理结局。在出生后第3至6天（P3-P6），LBN组母鼠育幼行为的日熵值显著高于对照组（F1,58 = 7.21，p = 0.0094；图2A），该时间段内每只母鼠的平均熵值也更高（t15 = 3.03，p = 0.0085；图2B）。值得注意的是，同一母鼠所产的不同窝仔鼠在相同处理组内其平均熵率之间无显著差异（F1.699,4.247 = 0.57，p = 0.58；图2C），提示熵率可能是每只母鼠相对稳定的特征。在所有育幼行为中，理毛与舔舐行为被证实是受LBN干扰最为显著的行为3。LBN组母鼠对幼崽进行舔舐和理毛（LG）的频率更高（t16 = 4.04，p = 0.0010；图2D），但每次行为持续时间更短（t16 = 3.25，p = 0.0050；图2E）。然而，对照组与LBN组母鼠在LG行为的总持续时间上无显著差异（t16 = 1.52，p = 0.15；图2F）。

Postnatal behavior analysis graphs: entropy rates, LG frequency, and duration in CTL vs. LBN groups.
图2母体行为分析 (ALBN组母鼠的日均熵率较高 与对照（CTL）通过混合效应模型分析（F1,58 = 7.21, p = 0.0094). (BLBN 母猪的平均熵率较高 与. CTL（细胞毒性T淋巴细胞，t15 = 3.03, p = 0.0085). (C) 在相同处理组内，同一母体所产的多个窝仔在平均熵率（P3-P6）上无显著差异（F1.699,4.247 = 0.57, p = 0.58）。每条线代表一只母鼠。D高舔舐与理毛（LG）行为母鼠的舔舐与理毛（LG）事件累积频率更高 与. CTL（细胞毒性T淋巴细胞，t16 = 4.04, p = 0.0010). (ELG母鼠的平均哺乳持续时间较短 对比. CTL（细胞毒性T淋巴细胞，t16 = 3.25, p = 0.0050). (FLBN对LG所花费的累积时间无显著影响（t16 = 1.52, p = 0.15）。数据以均值 ± 标准误表示，* p < 0.05. 请点击此处以查看此图的放大版本。

在LBN条件下饲养的幼鼠在P10时体型显著较小（t61 = 6.30，p < 0.0001；图3A）。这种差异通常在断奶期仍然存在（t62 = 6.29，p = <0.0001；图3B），但在成年期已不再显著（t38 = 1.08，p = 0.29；图3C）。然而，成年期基础状态下的皮质酮水平升高（t18.79 = 2.23，p = 0.038；图3D），提示LBN具有持续性的生理影响。这些差异是成功实验设置下预期的结果。若实验设置不理想，则理毛行为持续时间、熵值及幼鼠体重等指标可能未见差异，这很可能是由于“对照组”也处于应激状态所致。在本文中，分析子代结果时未区分性别，因为此处描述的生理学结果通常不表现出性别差异；然而，在该模型中，其他类型的结果（如认知和情绪行为）常报告存在性别差异，值得进一步研究4。

比较P10、P21体重、成年体重和基础皮质酮水平的柱状图，含显著性标记。
图3：子代结果。（A）筑巢垫料受限（LBN）导致幼鼠在P10时体重降低，即在恢复至标准饲养笼之前（t61 = 6.30，p < 0.0001）。（B）LBN在断奶期仍导致体重下降（t62 = 6.29，p < 0.0001）。（C）成年期体重在LBN组间不再存在差异（t38 = 1.08，p = 0.29）。（D）成年期基础皮质酮浓度因LBN而升高，经Welch's t检验分析（t18.79 = 2.23，p = 0.038）。所有图表中，雌性以圆形表示，雄性以三角形表示。数据表示为均值 ± 标准误（SEM），*p < 0.05。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文提供了一种在小鼠中应用LBN模型的详细实验方案。该模型是研究生命早期一种具有生态学和转化相关性的慢性应激形式如何影响子代神经精神疾病发生的重要工具13。它也适用于从分子、神经内分泌或神经环路角度研究母体行为及其大脑的任何变化24。对于此类问题，经产次数可能是更需考虑的重要变量。我们观察到，同一母鼠在多次分娩中其母体行为熵值评分保持一致（图2C），提示熵值可能是每只母鼠相对稳定的特征。这一发现可能为使用经产雌性小鼠提供了依据，尤其是在仅使用初产雌性小鼠不可行的情况下，例如使用昂贵或稀有的转基因小鼠时。然而，由于经产可能对其他变量（如宫内环境）产生非预期影响，建议实验人员在数据分析过程中对经产雌性小鼠的使用进行统计学控制。

需要注意的是，该模型对环境干扰极为敏感。多种因素可能干扰动物，导致问题和次优结果，例如笼具进水或附近施工产生的巨大噪音。通常情况下，这些干扰会导致对照组动物产生应激，从而使得对照组与LBN条件之间无显著差异。此类问题的一个指标是P10时对照组和LBN幼崽体重相似，以及母体照料行为的熵值相近。因此，理想的设置是使用专用于此目的的母体照料房间，保持安静，并远离动物饲养区和其他实验室人员。干扰还可能导致幼崽被同类相食，尤其是在分娩母鼠年龄小于P75时更为常见。母鼠在P75之后以及产过第一胎之后，幼崽被同类相食的风险会降低。该方法的另一种变体将实验操作的时间调整至P4-P11，以进一步降低同类相食的风险25,26；尽管在当前实验室条件下并非必需。另一种LBN模型版本不使用网状隔板，但仍在整个断奶前的出生后阶段限制垫料和筑巢材料的用量27。需要注意的是，改变实验时间线可能导致不同的结果，例如母体虐待行为，进而导致子代出现不同的表型，如类似焦虑的行为25,28。其他常见问题包括由于摄像角度和巢穴过大而丢失母体行为数据；为缓解此问题，建议在笼具后方放置一面镜子，并确保在对照条件下仅提供一个巢垫，以防止巢穴过大而遮挡幼崽，影响摄像观察。最后，必须确保网状隔板正确安装于笼具内，以防止幼崽卡住或受伤。

LBN 模型的一个优势在于其易于定制，并可与其他实验因素相结合。可添加到本方案中的变量示例包括饮食29,30、免疫刺激30,31、不同的转基因品系32,33以及化学遗传学技术19。此外，该模型的某些版本采用出生后第10至17天（P10-P17）的时间框架，并结合母体分离（MS）处理34,35,36。该范式还被改造用于模拟产前应激，即从妊娠第14天（E14）到第19天（E19）将孕鼠饲养于LBN环境中37,38，但幼鼠本身从未直接暴露于应激刺激。最后，一些研究采用“二次打击”模型，即早期生活应激（ELA）与子代成年后接受的不同应激测试相结合19,39。

该方法的一个局限性在于通量不高。其产生的数据量受限于同时可用的相机数量和空间，尽管可以在不同时间分批进行实验。母性行为的手动评分尤其耗时，且可能引入观察者偏差，但得益于基于机器学习的方法的出现，自动化评分目前正在开发中40。如果采用人工评分，建议由同一个人完成同一实验中所有视频的评分，以减少观察者间的差异。另一个局限性是，该模型主要针对依赖母体照护的啮齿类动物设计，因此难以用于研究双亲照护行为。然而，已有研究团队在加州小鼠等具有双亲照护特性的物种中，采用父系剥夺作为母婴分离（MS）的替代方案41,42，因此可以设想，LBN模型也有可能被调整适用于这些物种。

除了LBN模型外，母婴分离（maternal separation, MS）是研究早期生活应激（ELA）的另一种最主要模型，因为成年动物中常用的其他应激方式（例如束缚应激）在生态学上不具相关性，且对幼崽的影响不同。LBN与MS的区别在于，LBN是一种导致母体行为碎片化且不可预测的慢性应激形式，而MS中的剥夺则是间歇性的，通常每天在可预测的时间发生43。有趣的是，这两种模型均可引起啮齿类动物HPA轴的改变以及类似抑郁的行为表现，尽管LBN可能是一种可重复性更高、实验人员干预更少且在不同实验室之间结果更一致的实验方案1,11,13,16。尽管该方案有助于减少某些变异来源（如实验者相关因素），但其他因素，如动物设施条件、动物来源或品系差异，仍可能影响实验结果。例如，已知BALB/c小鼠对慢性束缚应激的反应更为显著，其对ELA的敏感性也可能与C57BL/6J小鼠存在差异27,44。

总之，LBN 模型采用资源受限的环境并伴随不可预测的母体照料，是研究生命早期应激如何影响多种生理过程（如应激的生理适应、母体行为及大脑发育）的有效方法。值得注意的是，该模型已被用于探讨早期生活逆境（ELA）为何会成为神经精神疾病风险因素的机制1,5,9,12。未来，LBN 模型的应用将加深我们对精神和躯体疾病生物学基础的理解，并有助于阐明治疗围产期敏感阶段应激影响的新型治疗靶点。

致谢

本工作获得了美国国家心理健康研究所（NIMH）K99/R00 独立之路奖 #MH120327、Whitehall 基金会资助项目 #2022-08-051，以及脑与行为研究基金会（Brain & Behavior Research Foundation）和约翰与波莉·斯帕克斯基金会（The John and Polly Sparks Foundation）颁发的 NARSAD 青年研究者奖 #31308 的支持。作者谨此感谢佐治亚州立大学动物资源中心为实验动物提供的卓越照护，以及瑞安·斯利思（Ryan Sleeth）在建立和维护视频管理系统过程中提供的出色技术支持。博尔顿博士（Dr. Bolton）还特别感谢塔莉·Z·巴拉姆博士（Dr. Tallie Z. Baram），她创建了LBN模型并将其分享给本人。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
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玉米芯垫料The Andersons4B
棉质巢材AncareNES3600
网状隔板McNICHOLS4700313244标准，铝，合金 3003-H14，3/16" No. .032 标准（凸起型），70% 开放面积
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