本文介绍一种经济且可重复的方法，用于演示组氨酸在山羊肠道中的膜转运过程。该过程通过肠上皮细胞膜两侧的钠离子梯度驱动，实现组氨酸与钠离子的共转运。本方法采用体验式学习教学法，以增进对溶质在生物膜间转运机制的理解。
本文内容
摘要
摘要
组氨酸是一种必需氨基酸，同时也是参与免疫系统、肺通气和血管循环代谢物的前体。膳食中组氨酸的吸收主要依赖于小肠上皮细胞顶膜上的广谱中性氨基酸转运蛋白（B0AT）介导的钠离子偶联中性氨基酸转运。本文通过山羊空肠倒置囊模型，演示了小肠绒毛上皮细胞从肠腔吸收组氨酸的过程。将暴露于不同浓度钠离子和组氨酸条件下的空肠囊进行孵育，并测定随时间变化囊内组氨酸的浓度。结果表明组氨酸存在主动吸收现象。增加盐浓度可提高组氨酸的吸收水平，提示在山羊肠道倒置囊中组氨酸的吸收与钠离子以同向转运方式协同进行。本方案经适当修改后，可用于观察氨基酸或其他代谢物在肠道中的转运行为。我们建议将该实验作为一种体验式教学工具，帮助本科生理解膜转运的概念。
引言
生物细胞被一层膜脂双层所包围，该双层膜将细胞内胞质溶胶与细胞外环境分隔开来。细胞膜作为一种半透性屏障，调控溶质的跨膜移动1。溶质跨生物膜的运输受其通透系数影响，而通透系数取决于多种因素，包括溶质的浓度和电荷。通常情况下，溶质通过三种机制穿过细胞膜（图1）：被动扩散、协助扩散和主动运输2。简单扩散是指可溶性、不带电且非极性的溶质顺其浓度梯度穿过半透膜的过程（图1A）。该过程无需膜蛋白参与，因其仅涉及溶质从高浓度区域向低浓度区域的移动。扩散速率遵循菲克定律（Fick's Law）3。另一方面，协助扩散是一种依赖蛋白质的运输方式，细胞膜仅允许特定溶质在不消耗能量的情况下沿浓度梯度通过（图1B）。此类运输具有特异性，并表现出饱和动力学特征，与简单扩散不同。
主动运输是一种依赖蛋白质的分子跨膜运输过程，可逆浓度梯度进行，即利用ATP或离子梯度将分子从低浓度区域转运至高浓度区域（图1C）。当转运蛋白水解ATP时，该过程称为主动运输的初级主动运输形式（图1C；左图）。另一种主动运输形式为次级主动运输（图1C；右图）。在次级主动运输中，溶质的转运依赖于电化学梯度。当转运蛋白将某种离子（通常为Na+）顺其浓度梯度的移动与另一分子或离子逆其浓度梯度的移动相偶联时，即发生此类运输。这种溶质的转运方式可以是共转运（同向转运，Symport），即溶质与离子朝同一方向移动；也可以是交换转运（反向转运，Antiport），即溶质与离子朝相反方向移动。
食物来源的膳食氨基酸和单糖在小肠中被吸收。小肠在功能上可分为三个节段：十二指肠、空肠和回肠（图2）。溶质的吸收在整个小肠中进行，其中以空肠和回肠近端的吸收最为显著。肠上皮细胞为极性细胞，相邻细胞之间由紧密连接连接，形成两个不同的膜区域——基底外侧膜和顶膜区域（图2）。由消化产生的管腔溶质的吸收发生在顶膜区域4。
组氨酸在肠上皮细胞顶膜的转运是依赖钠离子的继发性主动同向转运的一个实例。在基底外侧端，进入肠上皮细胞的组氨酸顺浓度梯度进入肝门静脉循环。由于位于基底外侧膜上的Na+K+ATP酶主动将钠离子泵出细胞，肠上皮细胞内的钠离子浓度维持在12 mmol/L1，低于细胞外/管腔内的浓度（图3）。在肠上皮细胞的顶膜上，B0AT和钠依赖性中性氨基酸转运蛋白（SNAT）5是主要的转运体，不仅转运组氨酸，还以钠依赖性共转运方式转运天冬酰胺和谷氨酰胺等氨基酸5,6。另一种称为大中性氨基酸转运体（LAT）1的转运蛋白存在于肠上皮细胞的基底外侧膜，可介导亮氨酸、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等大中性氨基酸跨膜转运7。
为了通过体验式教学法讲授与分光光度法和常规生化检测技术相结合的膜转运概念，亟需开发出不仅能够以通俗易懂的方式演示该概念，还能促进本科生参与式学习的教学方法。目前，学生缺乏可用于动手实践以学习此类生物化学概念的资源。本文报道了一种简单易行的实验方案，用于演示组氨酸通过山羊肠膜的转运过程，该方案易于在本科生实验室中重复实施，并可进一步改进用于评估其他代谢物的转运。更重要的是，该方法使用本科生实验室中常见的低成本材料，因此即使在最基础的实验条件下也能实现体验式学习。
方案
包含所有步骤的完整方案以示意图形式展示于图4中。本方法改编自先前使用大鼠肠道的研究8。实验过程遵循机构指导原则。本研究中所使用的样本购自商业供应商。
注意：本实验过程中需佩戴手套。
1. 倒置空肠囊的制备
- 预处理并清洗山羊空肠。
- 从持有许可证的供应商处获取一只 freshly sacrificed 健康山羊的内脏。
- 将内脏置于足量的1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，确保完全浸没，以进行清洗。
- 将小肠与大肠分离，并使用剪刀去除外部的结缔组织。
- 使用10 mL注射器以1×PBS轻轻冲洗小肠，确保清除未消化的食物残渣，以获得中空的小肠组织袋。重复此步骤至少三次，以实现有效清洗。
注意：冲洗时避免使用过大的力量或针头。用力过猛可能导致肠壁穿孔，从而损伤肠上皮细胞。 - 使用直尺测量小肠的全长，将其分为三部分：十二指肠（1/4）th 小肠）的其余部分平均分为空肠和回肠。
- 使用空肠部分继续实验。
- 制备回肠倒置样本。
- 使用刀片去除所有结缔组织，清洗空肠部分。
- 将空肠切成12–15 cm长的节段，用1×PBS冲洗，置于含有PBS的培养皿中。
- 使用玻璃棒将空肠部分翻转，使绒毛部分暴露在外部。
注意：避免使用带有锋利边缘的玻璃棒。此外，玻璃棒的直径不应大于囊袋的直径。
注意：此时可在光学显微镜下观察绒毛图4). - 用1×PBS轻轻冲洗倒置的空肠部分。
- 检查倒置的空肠两侧是否有泄漏。
- 将倒置的空肠部分切成5厘米长的肠段。
- 用细绳绑紧一端，并通过向囊内注入PBS来目视检查绑扎端是否存在泄漏。
- 将另一端打结，形成一个外表面带有绒毛的空置倒置囊袋。
- 通过将倒置的囊袋轻拍在滤纸上，重新检查是否存在外部泄漏。
- 将倒置的囊泡在1x PBS中平衡。
- 同一天继续进行实验，或在4 °C条件下将囊泡保存在1x PBS中过夜。
组氨酸转运的实验设置
- 根据表1中所示的不同氯化钠浓度，准备两组各三个50 mL试管。
- 将制备好的肠囊分别浸入各组试管中，每组分别作用30分钟和60分钟。
- 在指定时间后，将肠囊内的溶液排入单独的1.5 mL微量离心管中，并测定其体积。
- 使用2 mL注射器抽吸肠囊内的液体。或者，解开肠囊一端，将内容物收集至新的1.5 mL离心管中。
- 取0.1 mL收集的样品进行组氨酸含量测定，并利用标准曲线计算其浓度。
3. 使用Pauly反应估计组氨酸
- 制备组氨酸的标准曲线。
- 使用组氨酸储备液（5 mM）和水，配制不同浓度的组氨酸溶液，具体浓度如表2所示。
- 向每支试管中加入磺基水杨酸（0.5 mL）和硝酸钠（0.5 mL）。
- 室温孵育5分钟，然后向每支试管中各加入碳酸钠（1 mL）和乙醇（1 mL）。
- 在室温（约20 °C）下孵育20分钟，测定490 nm波长处的吸光度。
- 绘制吸光度与组氨酸浓度的标准曲线。
注意：该组氨酸检测方法基于组氨酸可形成偶氮化合物的特性（图5）。
结果
通过肠绒毛吸收组氨酸进入倒置肠囊腔内的实验流程，用以证明组氨酸在肠道中的移动性，如图4、表1和表2所示。共进行了三次独立的实验，代表性数据见图6。
在给定的实验条件下，使用Pauly反应测定组氨酸时，其浓度在300 µM范围内符合朗伯-比尔定律（图6A）。该组氨酸检测方法基于氨基酸与试剂中重氮离子的偶联反应。Pauly试剂中含有溶解于浓盐酸的磺基苯甲酸。该酸在硝酸钠和盐酸存在下发生重氮化反应。生成的重氮盐对苯基重氮磺酸盐在碱性条件下与组氨酸分子反应，形成由深红色/橙色至黄色的有色复合物，可在490 nm处通过分光光度法测定（图5）9。需要注意的是，组氨酸和酪氨酸均可产生该反应阳性结果。本研究中所采用的方法是对原始反应的轻微改进，即直接在室温（约20 °C）下使用硝酸钠，而非在低温条件下使用亚硝酸钠9。
从倒置肠囊内回收的样品呈现阳性的保利反应，表明组氨酸被肠绒毛吸收。图6B显示了空肠肠上皮细胞中组氨酸摄取与钠离子浓度之间的相关性。随着孵育时间从30分钟延长至60分钟，组氨酸吸收增加，提示存在继发性主动转运。
图1：不同类型的膜运输。 示意图展示各种膜运输系统。（A）被动扩散。（B）协助扩散。（C）初级主动运输（左）和次级主动运输（右）。请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：肠上皮细胞在肠绒毛中的排列结构。 本图聚焦于小肠，展示了三个不同的部分，即十二指肠、空肠和回肠。小肠表面具有指状突起，称为绒毛，可增加对摄入食物的吸收表面积。微绒毛上含有称为肠上皮细胞的细胞，其内具有特异性转运蛋白，用于氨基酸的吸收。紧密连接可防止溶质在细胞间隙间移动。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：具有氨基酸转运蛋白的肠上皮细胞。 图示为一个肠上皮细胞，显示其顶膜端和基底外侧膜端。顶膜端含有B0AT和SNAT5等转运蛋白，而基底外侧膜则含有LAT1转运蛋白。这些蛋白共同介导组氨酸从肠腔吸收进入门脉循环。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：利用山羊肠道倒置囊法演示组氨酸膜转运的实验流程示意图。山羊肠道按前述方法获取、预处理并清洗。简言之，切除空肠段并制备倒置肠囊。这些肠囊用于建立实验体系，以测定不同盐浓度下组氨酸的摄取量。使用光学显微镜在400倍放大下观察绒毛结构。详细操作步骤见正文描述。请点击此处查看该图的高清版本。
图5：Pauly法反应示意图。 Pauly试验涉及在含有磺基水杨酸的浓盐酸试剂中生成重氮离子。在碱性条件下，组氨酸与重氮盐反应，生成一种红色化合物，其吸光度可在490 nm处使用分光光度计测定。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 6：采用 Pauly 法测定组氨酸含量。（A）组氨酸的标准曲线。将浓度范围为 0–300 μM 的组氨酸进行 Pauly 反应，测定所形成复合物在 490 nm 波长处的吸光度。（B）在含有 150 mM（实心黑色）和 200 mM NaCl（实心灰色）的盐溶液中，监测肠囊对组氨酸的转运情况，持续时间为 30 分钟和 60 分钟。利用标准曲线（图 6A）估算倒置肠囊内的组氨酸浓度。数据以对照组（0 mM NaCl）为参照进行报告。实验进行了三次技术重复，图中展示为代表性数据。请点击此处查看该图的放大版本。
表1：组氨酸肠道移动性的实验设置。 本表格显示了肠段在两种不同时间点下于不同浓度氯化钠溶液中的孵育情况。请点击此处下载该表格。
表2：组氨酸标准曲线的制备。 本表列出了使用已知浓度范围为0-300 μM的组氨酸进行Pauly反应的不同步骤和组分。请点击此处下载该表格。
讨论
膜转运是所有主要生物科学学科（无论是基础还是应用）本科生教学中最基本的概念之一。传统上，人们使用放射性同位素标记的代谢物来可视化膜跨膜运输过程。然而，这些方法具有极高的危险性，不适合教学或学习使用。尽管体验式学习是理解此类复杂概念的最佳教学方法，但这一挑战因缺乏基础设施、荧光染料/代谢物成本高昂，以及最重要的是动物解剖实验被禁止而进一步加剧。因此，亟需开发出既安全又廉价、且适合本科生实验环境的工具和替代方法。本文为本科生开发了一种全新的膜转运教学方法。所报道的实验方案改编自 Agar 等人 1954 年的研究8，用于演示组氨酸通过山羊肠细胞的单向主动膜转运过程。本研究旨在展示如何利用基于比色法的检测手段，可视化组氨酸在肠膜上的吸收过程。该方法操作简单、可重复性强，易于学生理解，可在任何实验室条件下开展。
翻转肠囊模型最初由 Wilson 和 Wiseman10 建立，随后经过改进以提高组织的存活性。利用肠道翻转囊已阐明药物吸收的机制与动力学特征11。该模型的优点包括具有较大的吸收面积；然而，组织存活性是其中一个限制性参数。据报道，肠组织在生理条件下可保持存活且具有代谢活性约 2 小时11。该方法另一个需要考虑的潜在局限性在于无法从翻转肠囊制备物中去除黏膜下肌层和浆膜层。某些化合物与肌层的结合可能会限制或低估这些化合物的转运。尽管翻转肠囊模型具有较高的敏感性和特异性，但多种因素可能影响实验结果。这些因素包括动物的年龄、性别、物种、饮食和疾病状态，以及用于分析的肠段（回肠、空肠、十二指肠和结肠）。环境因素如 pH、通气状况和温度也会影响实验结果12。
研究表明，肠道取材的延迟以及动物状态（活体/死亡）会影响大鼠肠道十二指肠段的主动转运。从麻醉动物体内取材可确保最短的延迟时间，避免转运蛋白功能下降13。然而，鉴于大学中已禁止动物解剖，本实验采用 freshly sacrificed 动物的肠道组织。尽管该方案可用于建立代谢物在肠上皮细胞中的定性吸收模型，但在涉及膜转运动力学的研究中应用受限。本方案最关键的步骤是成功制备无泄漏的倒置肠囊，且其中的肠上皮细胞需保持活性。绒毛及肠上皮细胞的脆弱性与活性维持构成挑战，但通过练习可逐步克服。此外，由于起始材料并非来自任何近交系或同基因型动物群体，不同实验间结果的变异性是一个显著缺点。这一问题可通过使用同一只动物的多个重复样本加以缓解。鉴于上述因素，本研究所述方法应严格作为本科生实验教学中的教学工具使用。
所概述的方案已成功用于证明组氨酸的转运。钠离子与组氨酸在倒置肠囊中的单向摄取表明，该过程属于共转运类型的继发性主动运输。中性氨基酸在肠道中的吸收遵循矢量动力学，其依赖于由Na⁺-K⁺-ATP酶建立的浓度梯度。类似的机制维持了细胞内负的膜电位以及细胞外150 mM的钠离子浓度。这两个因素共同驱动中性氨基酸通过B的主动转运。0在较高盐浓度（200 mM）下，吸收率随时间的变化无显著差异。有趣的是，此时我们尚无法解释该现象的原因；然而，可通过扩展相同的实验设计，纳入多种钠离子浓度、不同时间点，并以150 mM氯化胆碱作为对照，以展示钠依赖性转运及可能存在的饱和效应贡献。
原则上，可使用山羊/猪/大鼠/小鼠的翻转空肠囊来演示多种膳食代谢物的肠道吸收，前提是具备相应的生化检测方法。此外，还可分析其他可能干扰肠道吸收的组分或膜转运抑制剂的影响。翻转囊技术已被高效地应用于药物研究领域，用于研究药物的体外吸收、药物在肠道中的代谢以及转运体在药物吸收中的作用。最后，该技术是膜转运过程的一种离体演示方法，其依赖的是组织样本而非无细胞提取物（体外）。然而，这一优势受到无感染的山羊/猪/大鼠肠道来源的限制，后者可能成为该方法应用的制约因素。
在教师可用的众多教学工具中，体验式学习或“在实践中学习”是一种教学理念与方法，它是最先进且最有效的教学方式，能够为学生提供全面理解课堂主题的机会。体验式学习确保学生积极参与实践，同时教师在此主动学习过程中提供支持与指导14。这种方法是对传统理论课堂教学的极佳替代，尤其适用于学生通常难以想象的复杂且综合性强的概念，例如膜转运。此类教学活动还能促进学生与同龄人及导师之间的互动与协作式学习。本项教学举措旨在创造并实现一种不仅具有知识性，而且令人难忘并可能对学生带来深远影响的学习体验，从而显著提升整体学习效果。
披露
作者不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。
致谢
本研究得到了德里大学斯里文卡特斯瓦拉学院生物化学系的支持。作者感谢实验室工作人员提供的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量离心管 | TARSONS | 500020 | |
| 10 mL 试管 | BOROSIL | 9800U04 | |
| 50 mL 无菌 Falcon 管 | TARSONS | 546041 | |
| 500 mL 烧杯 | BOROSIL | 10044977 | |
| 500 mL 锥形瓶 | BOROSIL | 691467 | |
| D-葡萄糖 | SRL | 42738 | |
| 数字分光光度计 | SYSTRONICS | 2710 | |
| 乙醇 | EMSURE | 1009831000 | |
| Finpipettes | THERMOFISHER | 4642090 | |
| 玻璃搅拌棒 | BOROSIL | 9850107 | |
| L-组氨酸 | SRL | 17849 | |
| NaCl | SRL | 41721 | |
| 腈类手套 | KIMTECH | 112-4847 | |
| 培养皿 | TARSONS | 460090 | |
| 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) | SRL | 95131 | |
| 移液器吸头 | ABDOS | P10102 | |
| 碳酸钠 | SRL | 89382 | |
| 硝酸钠 | SRL | 44618 | |
| 磷酸氢二钠（无水） | SRL | 53046 | |
| 磷酸二氢钠（无水） | SRL | 22249 | |
| 磺基水杨酸 | SRL | 15354 |
参考文献
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