本文介绍一种经济且可重复的方法，用于演示组氨酸在山羊肠道中的膜转运过程。该过程通过肠上皮细胞膜两侧的钠离子梯度驱动，实现组氨酸与钠离子的共转运。本方法采用体验式学习教学法，以增进对溶质在生物膜间转运机制的理解。
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摘要
摘要
组氨酸是一种必需氨基酸，同时也是参与免疫系统、肺通气和血管循环代谢物的前体。膳食中组氨酸的吸收主要依赖于小肠上皮细胞顶膜上的广谱中性氨基酸转运蛋白（B0AT）介导的钠离子偶联中性氨基酸转运。本文通过山羊空肠倒置囊模型，演示了小肠绒毛上皮细胞从肠腔吸收组氨酸的过程。将暴露于不同浓度钠离子和组氨酸条件下的空肠囊进行孵育，并测定随时间变化囊内组氨酸的浓度。结果表明组氨酸存在主动吸收现象。增加盐浓度可提高组氨酸的吸收水平，提示在山羊肠道倒置囊中组氨酸的吸收与钠离子以同向转运方式协同进行。本方案经适当修改后，可用于观察氨基酸或其他代谢物在肠道中的转运行为。我们建议将该实验作为一种体验式教学工具，帮助本科生理解膜转运的概念。
引言
生物细胞被一层膜脂双层所包围，该双层膜将细胞内胞质溶胶与细胞外环境分隔开来。细胞膜作为一种半透性屏障，调控溶质的跨膜移动1。溶质跨生物膜的运输受其通透系数影响，而通透系数取决于多种因素，包括溶质的浓度和电荷。通常情况下，溶质通过三种机制穿过细胞膜（图1）：被动扩散、协助扩散和主动运输2。简单扩散是指可溶性、不带电且非极性的溶质顺其浓度梯度穿过半透膜的过程（图1A）。该过程无需膜蛋白参与，因其仅涉及溶质从高浓度区域向低浓度区域的移动。扩散速率遵循菲克定律（Fick's Law）3。另一方面，协助扩散是一种依赖蛋白质的运输方式，细胞膜仅允许特定溶质在不消耗能量的情况下沿浓度梯度通过（图1B）。此类运输具有特异性，并表现出饱和动力学特征，与简单扩散不同。
主动运输是一种依赖蛋白质的分子跨膜运输过程，可逆浓度梯度进行，即利用ATP或离子梯度将分子从低浓度区域转运至高浓度区域（图1C）。当转运蛋白水解ATP时，该过程称为主动运输的初级主动运输形式（图1C；左图）。另一种主动运输形式为次级主动运输（图1C；右图）。在次级主动运输中，溶质的转运依赖于电化学梯度。当转运蛋白将某种离子（通常为Na+）顺其浓度梯度的移动与另一分子或离子逆其浓度梯度的移动相偶联时，即发生此类运输。这种溶质的转运方式可以是共转运（同向转运，Symport），即溶质与离子朝同一方向移动；也可以是交换转运（反向转运，Antiport），即溶质与离子朝相反方向移动。
食物来源的膳食氨基酸和单糖在小肠中被吸收。小肠在功能上可分为三个节段：十二指肠、空肠和回肠（图2）。溶质的吸收在整个小肠中进行，其中以空肠和回肠近端的吸收最为显著。肠上皮细胞为极性细胞，相邻细胞之间由紧密连接连接，形成两个不同的膜区域——基底外侧膜和顶膜区域（图2）。由消化产生的管腔溶质的吸收发生在顶膜区域4。
组氨酸在肠上皮细胞顶膜的转运是依赖钠离子的继发性主动同向转运的一个实例。在基底外侧端，进入肠上皮细胞的组氨酸顺浓度梯度进入肝门静脉循环。由于位于基底外侧膜上的Na+K+ATP酶主动将钠离子泵出细胞，肠上皮细胞内的钠离子浓度维持在12 mmol/L1，低于细胞外/管腔内的浓度（图3）。在肠上皮细胞的顶膜上，B0AT和钠依赖性中性氨基酸转运蛋白（SNAT）5是主要的转运体，不仅转运组氨酸，还以钠依赖性共转运方式转运天冬酰胺和谷氨酰胺等氨基酸5,6。另一种称为大中性氨基酸转运体（LAT）1的转运蛋白存在于肠上皮细胞的基底外侧膜，可介导亮氨酸、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等大中性氨基酸跨膜转运7。
为了通过体验式教学法讲授与分光光度法和常规生化检测技术相结合的膜转运概念，亟需开发出不仅能够以通俗易懂的方式演示该概念，还能促进本科生参与式学习的教学方法。目前，学生缺乏可用于动手实践以学习此类生物化学概念的资源。本文报道了一种简单易行的实验方案，用于演示组氨酸通过山羊肠膜的转运过程，该方案易于在本科生实验室中重复实施，并可进一步改进用于评估其他代谢物的转运。更重要的是，该方法使用本科生实验室中常见的低成本材料，因此即使在最基础的实验条件下也能实现体验式学习。
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方案
包含所有步骤的完整方案以示意图形式展示于图4中。本方法改编自先前使用大鼠肠道的研究8。实验过程遵循机构指导原则。本研究中所使用的样本购自商业供应商。
注意：本实验过程中需佩戴手套。
1. 倒置空肠囊的制备
- 预处理并清洗山羊空肠。
- 从持有许可证的供应商处获取一只 freshly sacrificed 健康山羊的内脏。
- 将内脏置于足量的1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，确保完全浸没，以进行清洗。
- 将小肠与大肠分离，并使用剪刀去除外部的结缔组织。
- 使用10 mL注射器以1×PBS轻轻冲洗小肠，确保清除未消化的食物残渣，以获得中空的小肠组织袋。重复此步骤至少三次，以实现有效清洗。
注意：冲洗时避免使用过大的力量或针头。用力过猛可能导致肠壁穿孔，从而损伤肠上皮细胞。 - 使用直尺测量小肠的全长，将其分为三部分：十二指肠（1/4）th 小肠）的其余部分平均分为空肠和回肠。
- 使用空肠部分继续实验。
- 制备回肠倒置样本。
- 使用刀片去除所有结缔组织，清洗空肠部分。
- 将空肠切成12–15 cm长的节段，用1×PBS冲洗，置于含有PBS的培养皿中。
- 使用玻璃棒将空肠部分翻转，使绒毛部分暴露在外部。
注意：避免使用带有锋利边缘的玻璃棒。此外，玻璃棒的直径不应大于囊袋的直径。
注意：此时可在光学显微镜下观察绒毛图4). - 用1×PBS轻轻冲洗倒置的空肠部分。
- 检查倒置的空肠两侧是否有泄漏。
- 将倒置的空肠部分切成5厘米长的肠段。
- 用细绳绑紧一端，并通过向囊内注入PBS来目视检查绑扎端是否存在泄漏。
- 将另一端打结，形成一个外表面带有绒毛的空置倒置囊袋。
- 通过将倒置的囊袋轻拍在滤纸上，重新检查是否存在外部泄漏。
- 将倒置的囊泡在1x PBS中平衡。
- 同一天继续进行实验，或在4 °C条件下将囊泡保存在1x PBS中过夜。
组氨酸转运的实验设置
- 根据表1中所示的不同氯化钠浓度，准备两组各三个50 mL试管。
- 将制备好的肠囊分别浸入各组试管中，每组分别作用30分钟和60分钟。
- 在指定时间后，将肠囊内的溶液排入单独的1.5 mL微量离心管中，并测定其体积。
- 使用2 mL注射器抽吸肠囊内的液体。或者，解开肠囊一端，将内容物收集至新的1.5 mL离心管中。
- 取0.1 mL收集的样品进行组氨酸含量测定，并利用标准曲线计算其浓度。
3. 使用Pauly反应估计组氨酸
- 制备组氨酸的标准曲线。
- 使用组氨酸储备液（5 mM）和水，配制不同浓度的组氨酸溶液，具体浓度如表2所示。
- 向每支试管中加入磺基水杨酸（0.5 mL）和硝酸钠（0.5 mL）。
- 室温孵育5分钟，然后向每支试管中各加入碳酸钠（1 mL）和乙醇（1 mL）。
- 在室温（约20 °C）下孵育20分钟，测定490 nm波长处的吸光度。
- 绘制吸光度与组氨酸浓度的标准曲线。
注意：该组氨酸检测方法基于组氨酸可形成偶氮化合物的特性（图5）。
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结果
通过肠绒毛吸收组氨酸进入倒置肠囊腔内的实验流程，以展示组氨酸在肠道中的移动性，如图4、Table 1和Table 2所示。共进行了三次独立的实验，代表性数据见图6。
在给定的实验条件下，使用Pauly反应测定组氨酸时，其浓度在300 µM范围内符合朗伯-比尔定律（图6A）。该组氨酸检测方法基于氨基酸与试剂中重氮离子的偶联反应。Pauly试剂中含有溶于浓盐酸的磺基苯甲酸。该酸在硝酸钠和盐酸存在下发生重氮化反应。生成的重氮盐对苯基重氮磺酸盐在碱性条件下与组氨酸分子反应，形成深红色/橙色至黄色的复合物，可在490 nm处通过分光光度法测定（图5）9。需要注意的是，组氨酸和酪氨酸均可产生该反应阳性结果。本研究中所采用的检测方法对原始反应进行...
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讨论
膜转运是所有主要生物科学学科（无论是基础还是应用）本科生教学中最基本的概念之一。传统上，人们使用放射性同位素标记的代谢物来可视化膜跨膜运输过程。然而，这些方法具有极高的危险性，不适合教学或学习使用。尽管体验式学习是理解此类复杂概念的最佳教学方法，但这一挑战因缺乏基础设施、荧光染料/代谢物成本高昂，以及最重要的是动物解剖实验被禁止而进一步加剧。因此，亟需开发出既安全又廉价、且适合本科生实验环境的工具和替代方法。本文为本科生开发了一种全新的膜转运教学方法。所报道的实验方案改编自 Agar 等人 1954 年的研究8，用于演示组氨酸通过山羊肠细胞的单向主动膜转运过程。本研究旨在展示如何利用基于比色法的检测手段，可视化组氨酸在肠膜上的吸收过程。该方法操作简单、可重复性强，易于学生理解，可在任何实验室条件下开展。
翻转肠囊模型最初由 Wilson 和 Wiseman10 建立，随后经过改进以提高组织的存活性。利用肠道翻转囊已阐明药物吸收的机制与动力学特征11
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披露
作者不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。
致谢
本研究得到了德里大学斯里文卡特斯瓦拉学院生物化学系的支持。作者感谢实验室工作人员提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量离心管 | TARSONS | 500020 | |
| 10 mL 试管 | BOROSIL | 9800U04 | |
| 50 mL 无菌 Falcon 管 | TARSONS | 546041 | |
| 500 mL 烧杯 | BOROSIL | 10044977 | |
| 500 mL 锥形瓶 | BOROSIL | 691467 | |
| D-葡萄糖 | SRL | 42738 | |
| 数字分光光度计 | SYSTRONICS | 2710 | |
| 乙醇 | EMSURE | 1009831000 | |
| Finpipettes | THERMOFISHER | 4642090 | |
| 玻璃搅拌棒 | BOROSIL | 9850107 | |
| L-组氨酸 | SRL | 17849 | |
| NaCl | SRL | 41721 | |
| 腈类手套 | KIMTECH | 112-4847 | |
| 培养皿 | TARSONS | 460090 | |
| 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) | SRL | 95131 | |
| 移液器吸头 | ABDOS | P10102 | |
| 碳酸钠 | SRL | 89382 | |
| 硝酸钠 | SRL | 44618 | |
| 磷酸氢二钠（无水） | SRL | 53046 | |
| 磷酸二氢钠（无水） | SRL | 22249 | |
| 磺基水杨酸 | SRL | 15354 |
参考文献
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- Stillwell, W. Membrane Transport. An Introduction to Biological Membranes. , Elsevier Science. (2013).
- Fick, A. V. On liquid diffusion. The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 10 (63), 30-39 (1855).
- Sherwood, L. Introduction to Human Physiology. , Brooks/Cole Cengage Learning. (2013).
- Bröer, S. Intestinal amino acid transport and metabolic health. Annu Rev Nutr. 43, 73-99 (2023).
- Avissar, N. E., Ryan, C. K., Ganapathy, V., Sax, H. C. Na+-dependent neutral amino acid transporter ATB0 is a rabbit epithelial cell brush-border protein. Am J Physiol Cell Physiol. 281 (3), C963-C971 (2001).
- Bröer, S. Amino acid transport across mammalian intestinal and renal epithelia. Physiol Rev. 88 (1), 249-286 (2008).
- Agar, W. T., Hird, F. J. R., Sidhu, G. S. The uptake of amino acids by the intestine. BBA - Biochim Biophys Acta. 14 (1), 80-84 (1954).
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