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方法文章

大鼠股骨头无张力负重型激素性骨坏死模型

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DOI：

10.3791/66883

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2024年9月27日

 ,  ,  ,  , 
1Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 2Beijing Key Lab of Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital, 3Department of Orthopedic and Joint Surgery, China-Japan Friendship Hospital

本文内容

摘要

本方案展示了利用弹性治疗胶带建立一种简单且经济的负重训练大鼠模型，用于股骨头 steroid-induced osteonecrosis 的研究。

摘要

与人类不同，大鼠是四足行走的动物，而人类是直立行走的双足动物，在行走和站立时髋关节承受着巨大的压力。在大鼠激素诱导的股骨头坏死模型中，常常需要模拟人体髋关节在较高压力下的生物力学特征。一些学者尝试通过让大鼠负重来模拟人类髋关节的压力状态，但将负重物固定在大鼠身上存在困难。大鼠容易挣脱固定装置，而使用胶带将重物粘附在大鼠体表则可能导致其因窒息或肠梗阻而死亡。本研究团队采用弹性治疗胶带对大鼠的负重物进行无张力固定，使大鼠能够自由呼吸，并在负重状态下不会挣脱固定。与常规的激素诱导股骨头坏死大鼠模型相比，我们发现这种负重干预可加重股骨头坏死的进展。

引言

糖皮质激素的使用是股骨头非创伤性骨坏死（ONFH）最常见的危险因素1。大量证据表明，除糖皮质激素外，患者髋关节所受的压力负荷也与ONFH的发生相关。体重和体力劳动强度等因素已被公认为ONFH的危险因素2。多项临床研究已证实，髋关节负荷状况与关节置换的时间及发生率之间存在密切关系3,4,5,6。因此，建立一个反映负荷与股骨头激素性骨坏死（SONFH）之间关系的模型，对于全面研究该疾病具有重要意义。

大型双足鸟类（如鸵鸟和鸸鹋）是模拟髋关节应力的良好模型，其腿部负荷与人类相似7,8。然而，饲养大型鸟类物种较为困难，且相关研究成本较高。自发性高血压大鼠模型9,10虽可表现出更高的股骨头缺血性坏死（ONFH）发生率，但由自发性高血压在骨髓中产生的腔室压力负荷与机械压力存在显著差异，因此不适用于研究机械压力对股骨头缺血性坏死（SONFH）的影响。

小型动物模型常用于股骨头坏死（SONFH）的研究。然而，四足爬行动物的髋关节应力较低，其髋关节模型无法模拟人类在双足行走时髋关节的生物力学环境。单侧肢体固定模型11和部分减载模型12较为常见，但二者均会降低肢体负荷。由于人类是双足生物，在站立和行走时下肢承受较大的负荷，因此在这些模型中减少负荷会削弱动物模型与人类疾病之间的关联性。

本研究旨在建立一种简单且经济有效的负重训练模型，以探讨负重训练对大鼠股骨头 steroid 诱导性骨坏死的影响。目前已有研究采用大鼠模型来研究 steroid 诱导性股骨头骨坏死13,14，但尚缺乏一种能够实现长期、安全固定，对动物活动干扰较小，同时又相对简便且成本较低的模型。本研究采用高黏性固定材料，实施无张力固定，可在维持大鼠活动能力的同时，减少因固定不当所导致的痛苦甚至死亡。

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方案

本方案遵循北京中医药大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）制定的伦理准则，方案编号为BUCM-4-2022062001-2109。本方案使用Sprague Dawley（SD）大鼠（SCXK(京)2019-0008），年龄为8–10周，体重为200 g–250 g。

1. 适应性训练

  1. 白化大鼠的视觉范围通常小于60 cm15在建模过程中，将大鼠放置于不透明的笼子中，并尽可能远离非建模大鼠（至少应确保其他大鼠处于建模大鼠的最大可视范围之外），以防止其经历创伤性应激。
  2. 打开电源，将跑步机速度设置为10 m/min，坡度为0°。将大鼠放置于跑步机上，操作动作应尽可能轻柔，以避免造成应激。无需使用额外刺激，由于大鼠对环境不熟悉，会自然向前爬行。
  3. 训练持续15分钟。训练结束后，清理大鼠留下的粪便和尿液，并喷洒酒精以消除动物气味。随后，准备下一只大鼠进行训练。
    注意：如果大鼠拒绝在跑轮上行走达5分钟，则将其排除 来自该研究。
  4. 继续适应性训练直至第1阶段结束st 周

2. 测量大鼠的最大负重能力

  1. 准备两个试管、一个钩子和一条长约80 cm的钩环扣带。将钢球放入试管中，确保试管、钩子和钩环扣带的初始总重量为150 g。准备以10 g为增量、总重量不同的试管，最大重量为350 g。
  2. 一名研究人员戴手套后用双手固定大鼠（图1）。另一名研究人员将试管放置在大鼠背部，距离背中线约1 cm处。由于此步骤不需要移动大鼠，只需将钩环扣带绕过大鼠身体即可固定试管，无需采取额外固定措施。
  3. 逐步更换更重的试管，直至大鼠达到最大负重。当大鼠达到最大负重能力时，在轻触刺激或实验者离开时无法站立。此时将重量减少10 g，使大鼠能够重新站立。该重量即为大鼠的最大负重能力。

3. 重量负荷的制备

  1. 由于训练期间需要牢固固定，应根据大鼠体型使用 1-1.5 m 的弹性治疗胶带将物体固定，该胶带具有较强的黏附性。使用黏土调节试管的重量，以减少负载摆动。
  2. 在称量试管和固定物体的重量后，向试管内加入适量黏土，使其达到目标重量。使用玻璃搅拌棒将黏土在试管内部均匀铺开。若黏土集中在试管一端，可能在训练过程中导致其容易脱落。
  3. 将调整后的试管与黏土总重量设定为大鼠最大负重能力的 50%（图 1A）。超过此重量将使大鼠难以完成训练。在实验结束前，不得再次调整负载重量。

4. 建立体外激素诱导的股骨头骨坏死模型

  1. 采用甲基泼尼松龙联合脂多糖（LPS+MPS）方法建立股骨头坏死（SONFH）模型16,17。使用标准针头在大鼠腹部中线处进行腹腔注射脂多糖（LPS，20 µg/kg），每24小时一次，共注射2次。
  2. 末次LPS注射后，在正常喂养24小时后向单侧臀肌注射MPS（40 mg/kg），之后每24小时注射一次，交替注射于两侧臀肌区域，共注射3次。

5. 使用弹性治疗胶带进行无张力负重固定及跑步机训练

  1. 在大鼠背部中线两侧各标记1-2 cm处，作为负重参考点。确保标记位置适当，以防止大鼠在跑台训练过程中发生倾倒或行动受阻。
  2. 一名研究人员戴手套固定大鼠时，一只手置于大鼠腋下以固定前肢和下颌，另一只手固定后肢和尾巴。避免用力过大，以防造成应激或窒息（图1B).
  3. 将弹性治疗胶带无张力地粘贴在试管上，以固定大鼠背部的负载。缠绕过程中，切勿拉伸弹性治疗胶带，以实现无张力固定。
    注意：本模型中使用的弹性治疗贴布专为高强度体育活动贴扎设计，具有高粘附性和高弹性18由于其高弹性，能显著减少对大鼠爬行时运动的干扰。
  4. 让第二位研究人员将试管平行于大鼠脊柱固定在大鼠背部，固定位置依据先前标记的位置，即位于大鼠背部两侧距正中线1-2 cm处。
  5. 为尽量减少大鼠的痛苦，降低固定对其活动的影响，并减少因固定导致的死亡率，应采用无张力固定法。将装有适当重量的试管粘附于弹性治疗胶带上，然后使用无张力技术将试管缠绕固定于大鼠体表。
  6. 确保无张力固定，保持弹性治疗胶带原始长度，避免拉伸，以防止对大鼠呼吸和运动造成任何不良影响（图1C).
  7. 将试管缠绕在大鼠身体上后，将大鼠置于开放空间或单独的笼子中，观察其呼吸状况和移动方向。若出现呼吸急促或张口等迹象，应立即释放大鼠，以防窒息。
    1. 理想的固定方式应允许大鼠自由活动，能够进行饮水、抬起前肢和进食等活动（图1D若固定效果不理想，可暂时解除固定，20分钟后重新固定，以减少因反复固定刺激对大鼠造成的应激。
  8. 打开电源，将跑步机速度设置为 1 m/min，坡度为 0°。跑步机训练时间为 30 分钟。轻柔地将大鼠放置于跑步机上，同时启动计时器。
  9. 不要对大鼠施加额外刺激。如果大鼠无法完成30分钟的训练，将其放入笼中休息10分钟，期间不拆除固定装置。
    注意：本研究中使用的弹性治疗胶带具有优异的延展性和黏附性。在无张力状态下正确固定后，长期固定不会导致试管脱落，也不会引起大鼠窒息死亡。
  10. 训练结束后，清理大鼠留下的粪便和尿液，并喷洒酒精以消除动物气味。
  11. 避免其他大鼠看到上述操作步骤，并尽可能轻柔地处理动物，以防止动物发出声音，从而对其他大鼠造成创伤性应激。
  12. 训练结束后立即解除对大鼠的固定图1E）。释放时，用手指按压大鼠的毛发以保护其皮肤，尽量减少释放过程中毛发的脱落（图1F).

6. 动物分组

  1. 为研究负重训练对股骨头坏死（SONFH）的影响，将60只大鼠随机分为四组。
  2. 对照组不建立激素性股骨头坏死（SONFH）模型，也不进行负重训练；对照+负重组仅进行负重训练，不建立激素性股骨头坏死模型；模型组仅建立激素性股骨头坏死模型；模型+负重组在建立激素性股骨头坏死模型后进行负重训练。

7. 安乐死与样本采集

  1. 将大鼠放入小型动物安乐死舱内，注入足量二氧化碳，使舱内二氧化碳浓度超过5%。待大鼠失去意识后，通过心内注射给予每公斤体重0.3 mL的20%氯化钾溶液，总量为20 mL。
  2. 监测大鼠的呼吸和心跳，确保其在安乐死过程中无疼痛或不适。通过检查呼吸和心跳是否停止来确认死亡。喷洒酒精以清除任何异味。
  3. 安乐死后，解剖大鼠髋部区域，在保持股骨完整的前提下取出股骨头。在预处理后进行显微CT扫描，随后进行苏木精-伊红（HE）染色。

8. 苏木精-伊红染色

  1. 建模完成后，处死大鼠，取出股骨用于苏木精-伊红（HE）染色。
  2. 将大鼠股骨浸泡于4%多聚甲醛中24小时，以固定生物组织作为标本；随后将股骨标本浸泡于5%甲酸中进行脱钙，持续5天。
  3. 将标本切成5 µm厚的切片，用于HE染色。
    注：空陷窝指的是骨组织19中本应含有骨细胞的陷窝内缺失这些细胞的现象。它是评估骨组织健康状况的重要指标。在骨坏死的病理过程中，血液供应不足可能导致骨细胞死亡，从而形成空陷窝。在骨坏死的诊断与评估中，空陷窝的数量和分布是衡量疾病严重程度的重要参数20,21。
    1. 将大鼠股骨标本放入熔化的石蜡（56–60 °C）中，必要时先浸入低熔点石蜡，然后逐步转移至高熔点石蜡，每次约1小时，以确保组织充分浸蜡。
    2. 准备包埋模具，将熔化的石蜡倒入模具至适当深度。用镊子取出已浸蜡的组织样本，去除多余石蜡后置于模具中，冷却至室温使石蜡凝固，形成石蜡块。
    3. 使用石蜡切片机将包埋好的石蜡块切成5 µm厚的切片。
  4. 将附有切片的大鼠股骨标本置于载玻片烘片台上烘烤1小时，以增强切片与盖玻片之间的黏附性，并减少后续染色过程中的漂浮现象。
  5. 将烘烤后的切片依次浸入纯二甲苯中以去除石蜡，随后依次通过无水乙醇、梯度乙醇（100%、95%、80%、70%）和水进行脱水，每步2分钟，完成脱蜡和复水过程。
  6. 将脱蜡后的切片浸入苏木精染色液中染色10分钟，然后用流水冲洗以去除未结合的苏木精。
  7. 将经苏木精染色的切片浸入伊红染色液中染色2分钟，使细胞质和结缔组织着色，随后用1%乙酸溶液冲洗以固定染色效果。
  8. 将大鼠股骨骨标本切片依次浸入70%、80%、90%、95%和100%乙醇中，每个梯度2分钟，逐步去除水分。
  9. 将大鼠股骨骨标本切片浸入纯二甲苯中透明，然后用流水冲洗以去除二甲苯。滴加中性树胶封片剂覆盖切片，轻轻敲击以排除气泡，待封片剂凝固后完成封片过程。
  10. 使用R语言中的randomizr程序包，每组随机选取30张HE染色切片，分配给两位研究人员各15张。在不告知分组信息的情况下，要求研究人员计算各切片的空陷窝率，并收集结果进行统计分析。

9. 微型计算机断层扫描（MicroCT）分析

  1. 建模完成后，处死大鼠，取出股骨用于苏木精-伊红染色。
  2. 将大鼠股骨浸泡于4%多聚甲醛中固定24小时，以保存生物组织作为标本。随后将大鼠股骨置于适用于小动物的微型计算机断层扫描（microCT）设备中。
  3. 设置microCT扫描参数如下：X射线电压：80 kV，电流：100 µA，单次曝光时间：50 ms，扫描分辨率：25 µm。以0.5°为间隔进行扫描，感兴趣区域为从软骨下方至骨骺上部的松质骨部分。
  4. 将大鼠股骨颈上方区域定义为感兴趣区域。
  5. 利用microCT设备对扫描结果进行冠状面重建，并采集设备内置软件生成的骨形态计量学参数。记录以下观察指标：总体积（TV）、骨体积百分比（BV/TV）、骨表面积/体积比（BS/BV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分离度（Tb.Sp）、骨小梁数量（Tb.N）、骨密度（BD）。

10. 统计分析

  1. 以均值 ± 标准差（SD）表示数据。采用独立样本 t 检验对 micro-CT 和定量组织学评估进行统计分析。将 p 值 < 0.05 视为具有统计学意义。

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结果

组织病理学分析
苏木精-伊红染色显示，对照组和对照+加载组中骨小梁结构完整且排列规则。骨陷窝内可见血管内皮细胞，细胞形态饱满。相比之下，模型组和模型+加载组的骨小梁出现断裂且排列紊乱，空骨陷窝数量显著增多。模型+加载组的空骨陷窝数量较模型组更多。在模型组中，部分骨髓细胞出现脂质积聚，而模型+加载组的骨髓腔则显得相对空虚（图2A）。对照组、对照+加载组、模型组和模型+加载组的空骨陷窝率分别为6.0 ± 2.5、6.4 ± 3.8、57.6 ± 29.6和78.2 ± 15.5（图2B）。

显微CT分析
显微CT结果清晰地展示了骨小梁的微观结构，反映了组织结构的完整性及骨量的变化。本研究中，对照组和对照+加载组的骨小梁密集、排列整齐且清晰可见；模型组的骨小梁稀疏，排列紊乱且不规则；模型+加载组在骨骺线以上区域的骨小梁形态不完整。四个组别的股骨头表面均光滑，无明显塌陷（

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讨论

目前，多种动物可用于建立股骨头坏死模型，例如兔子25、大鼠26、小鼠27、猪28、肉鸡29、鸵鸟8和鸸鹋30。其中，大鼠、小鼠和兔子是最常用的物种。大鼠作为股骨头坏死的模型具有诸多优势：易于饲养和繁殖，生长迅速，且其生理和代谢特征与人类相似。大鼠的股骨头大小适中，适合进行影像学和病理学研究26。然而，由于大鼠是体型较小的四足动物，在运动过程中后肢承受的负荷较低，因此利用常规的大鼠模型研究机械压力负荷与股骨头坏死发生之间关系较为困难。

大鼠体型呈纺锤形，体表被光滑的毛发覆盖，使用传统固定方法难以稳固负重，且会显著影响大鼠的活动能力。在研究初期，我们曾尝试使用胶带、尼龙绑带和牵引绳等方法对大鼠进行固定，但均未...

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披露

作者声明不存在可能影响本研究客观性或结果的利益冲突、隶属关系或合作关系。

致谢

本研究为独立开展的研究，未获得任何资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 ml 离心管康宁，美国430791
5 mm不锈钢珠格尔森，中国5 mm
乙酸德国默克集团64-19-7
无水乙醇德国默克集团64-17-5
黏土中国彩麦文具102
盖玻片Servicebio，中国WMWD-1818
10 ml 平底压力瓶BEHNCKE，中国MD 10 ml
甲酸Macklin 生化 中国64-18-6
HE染色试剂盒Solarbio，中国G1120
HistoCore AUTOCUTLeica，德国149AUTO00C1
肌内效贴布（弹性治疗贴布）中国富洛医药CL1819
脂多糖Solarbio，中国L8880
脂多糖（LPS）Selleck，美国S7850 
手动二氧化碳安乐死箱中国台湾LC-500-S1
甲泼尼龙 琥珀酸钠，MPSAbMole，中国M25573
微型计算机断层扫描 Hiscan，中国 Hiscan VM Pro
中性树脂北京中杉金桥生物技术有限公司 中国ZLI-9555
石蜡Servicebio，中国WGHB-319213129
多聚甲醛Servicebio，中国G1101-500ML
氯化钾Macklin 生化 中国 7447-40-7
幻灯片Servicebio，中国WG6012
大鼠跑步机  小鼠Litc 生命科学，美国801
二甲苯麦克林生化 中国台湾 1330-20-7

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