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研究小鼠中的正畸牙齿移动

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DOI：

10.3791/66884

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2024年8月2日

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1Department of Oral Diagnosis and Pathology, School of Dentistry, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2Department of Restorative Dentistry, School of Dentistry, Universidade Federal de Minas Gerais, 3Department of Physiology and Biophysics, Biological Science Institute, Universidade Federal de Minas Gerais, 4Private Clinic, 5Department of Metallurgical and Materials Engineering, School of Engineering, Universidade Federal de Minas Gerais, 6Laboratory of Immunopharmacology, Department of Biochemistry and Immunology, Biological Science Institute, Universidade Federal de Minas Gerais, 7Department of Orthodontics, School of Dental Medicine, University of Pittsburgh, 8Department of Oral Surgery, Pathology and Clinical Dentistry, School of Dentistry, Universidade Federal de Minas Gerais

本文内容

摘要

本文介绍了一种研究正畸牙齿移动（OTM）的实验方案，该模型适用于探究骨组织适应机制、牙根吸收过程以及骨细胞对机械刺激的反应。本综合指南详细阐述了OTM模型的建立、微型计算机断层扫描（micro-CT）的数据采集及其后续分析方法。

摘要

正畸牙齿移动（OTM）是一种动态过程，其中牙槽骨在受压区域发生吸收，在受拉区域发生沉积，分别由破骨细胞和成骨细胞调控。该机制为研究骨适应的多个方面提供了有价值的模型，包括牙根吸收以及细胞对机械力刺激的反应。本文所述的实验方案提供了一种简便的方法用于研究OTM，在采用镍钛（NiTi）螺旋弹簧的小鼠模型中确定0.35 N为最佳施力。通过显微计算机断层扫描（micro-CT）分析，我们通过测量釉牙骨质界处线性距离的差异来量化OTM。评估还包括对正畸诱导的炎性牙根吸收的分析，评估指标包括牙根矿化密度以及牙根体积占总体积的百分比。该综合性实验方案有助于深入理解骨重建过程，并提升开发有效正畸治疗策略的能力。

引言

骨重建是一个由破骨细胞、成骨细胞、骨衬细胞和骨细胞共同调控的持续过程，对维持成人骨骼系统的完整性至关重要1,2。这一动态过程主要由破骨细胞和成骨细胞的分化与活性驱动，包括骨吸收和骨沉积，通常由机械应力和负荷触发3,4,5。

动物实验在阐明正畸牙齿移动（OTM）背后的复杂生物学和细胞机制方面发挥着关键作用6,7。该过程涉及多种细胞类型，如成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、成纤维细胞，以及位于颌骨和牙周膜内的免疫细胞（如巨噬细胞和T细胞）7,8。这些细胞会动态响应机械刺激及局部微环境的变化，从而影响周围骨组织的组成和结构7,8。此外，即使不存在病原体，这些细胞也会在细胞水平上引发炎症反应。这种炎症反应有助于提高骨组织的更新速率9。

在正畸牙移动（OTM）的实验研究中，已使用多种动物模型，包括小鼠、大鼠、兔子、狗和猴子7,8,10。其中，啮齿类动物尤其是小鼠，因其适用于研究牙齿移动的初始阶段及骨重建过程而被广泛采用6。以往研究强调，相较于大鼠模型，小鼠模型具有明显优势，主要体现在存在大量可获得的基因修饰品系，从而能够深入探究遗传因素在OTM中的作用7,11。目前，诱导小鼠牙齿移动主要有两种模型。第一种方法是在上颌第一磨牙与上颌门齿之间插入镍钛（NiTi）螺旋弹簧4,12；第二种方法是在上颌第一和第二磨牙之间的牙间隙内放置弹性结扎圈13。主要观察指标通常包括牙齿移动的距离以及骨微结构的变化，首选微计算机断层扫描（micro-CT）进行评估14。 理想情况下，评估牙根的完整性至关重要，以确保施加的力值适当，从而实现有效的正畸牙移动（OTM）4。

尽管显微CT（micro-CT）被广泛认为是评估矿化组织微观结构的金标准14，但扫描、分析和报告数据缺乏标准化的方法和协议，常常导致难以明确所采用的具体操作流程、结果解读以及不同正畸牙齿移动（OTM）模型之间的比较14,15。

本文介绍了一种OTM小鼠模型的逐步操作指南，包括OTM、骨微结构和牙根的显微CT数据采集与分析。该方法通过在第一磨牙上施加可控的机械力，诱导牙齿在颌骨内的移动。选择该方法的原因包括其实用性、相关性和精确性。这种方法能够实现详细的定量分析，有助于深入理解正畸牙齿移动背后的生物学过程，并为未来改进正畸治疗策略提供重要依据。

方案

所有实验程序均严格遵守米纳斯吉拉斯联邦大学伦理委员会（编号：166/2022）制定的伦理标准。每次实验前必须进行样本量计算。使用8至10周龄、体重约20至30 g的雄性C57BL6/J野生型小鼠。小鼠应饲养在温度维持在25 °C的房间内的笼子中，并保持12小时光照/12小时黑暗的循环周期。安装线圈后，应为动物提供软质饲料。每日需监测体重及整体健康状况。

1. 机械诱导的牙槽骨重塑

  1. 使用远端剪钳，用正畸Weingart钳将0.25 × 0.76英寸的NiTi开放式线圈弹簧剪成六个环，并将两个环形末端垂直于弹簧方向定位。
  2. 使用Mathieu镊子和圆形工具作为尺寸参考，将直径为0.20 mm的圆形铬镍（CrNi）金属丝弯制成所需形状，并带有环形末端。
  3. 将线圈的环形末端与0.20 mm圆形CrNi金属丝连接在一起。
  4. 通过腹腔注射0.2 mL含有赛拉嗪（10 mg/kg）和氯胺酮（100 mg/kg）的溶液对动物进行麻醉。在开始操作前，使用足底反射评估麻醉深度。用镊子轻轻夹捏动物的一个脚趾，若无反射，则表明已达到适当的全身麻醉水平。为避免角膜损伤和术后疼痛，在动物麻醉后应涂抹眼用润滑剂。
  5. 将动物仰卧位固定于手术台上，固定其四肢以限制活动，并便于口腔内操作。
  6. 使用由直径0.50 mm金属丝制成并用0.08 mm金属丝固定的开口器，以实现充分视野暴露并防止头部移动。右侧作为实验侧（OTM侧），左侧作为对照侧（无正畸线圈，即对照侧）。
    注意：必须使用体视显微镜和光学照明系统以增强口腔内结构的可视化效果。
  7. 分别使用丙酮和自酸蚀引物清洁并处理右侧第一磨牙和切牙的表面。该系统为自酸蚀型，意味着无需预先进行酸蚀处理。
    1. 单步应用引物，该引物同时具有酸蚀和粘接功能。使用微刷蘸取少量自酸蚀引物，涂抹于上颌第一磨牙和切牙的咬合面。此步骤需特别注意，确保自酸蚀引物不接触第一与第二磨牙之间的邻面区域，以免导致牙齿粘连，阻碍牙齿移动。 在 磨牙和切牙的咬合面进行光固化30秒。
  8. 使用光固化树脂将六环NiTi开放式线圈弹簧的远端固定于右侧上颌第一磨牙的咬合面，并光固化30秒。 在金属丝边缘添加额外的树脂增量 ，以避免对小鼠造成伤害，并再次光固化30秒。
  9. 使用专为此设计的装置（由安装在手术台上的导轨和曲柄机构组成）激活线圈，该装置可实现纵向滑动运动。
  10. 将0.20 mm圆形金属丝的自由环形末端连接至张力计的挂钩上。
  11. 旋转曲柄时，沿导轨移动手术台，直至测力计显示施加力为0.35 N。
  12. 将0.20 mm圆形金属丝固定于两个上颌切牙上，以锚定线圈。在实验期间不再进行进一步加力。 剪断金属丝，使动物与测力计分离。 再添加一层树脂，确保装置的金属边缘被完全覆盖，不会对 动物造成损伤。光固化30秒。将动物从手术台上拆下。
  13. 上颌右侧第一磨牙处施加0.35 N向近中方向的力，构成实验侧。以上颌左侧（无正畸装置）作为对照4,16。
  14. 该装置维持12天，期间无需再次加力。不使用任何镇痛药物。正畸移动通过炎症过程实现，而止痛药物可能对花生四烯酸级联反应产生负面影响，干扰骨重建速率，进而可能导致实验结果无效。
  15. 手术结束后，皮下注射 生理盐水溶液，以防止动物在佩戴装置期间因适应不良而脱水。将动物置于带加热装置的单独笼中，直至其完全恢复意识，之后方可转移至集体饲养笼中。
  16. 于第12天 处死小鼠，方法为腹腔注射0.2 mL含赛拉嗪（10 mg/kg）和氯胺酮（100 mg/kg）的溶液进行镇静，随后使用锋利剪刀进行断头术。

2. 微型计算机断层扫描（Micro-CT）测量

  1. 使用锋利的剪刀切除上颌骨，切断所有软组织，沿矢状面切断颧骨，沿冠状面切断额鼻缝和蝶枕软骨结合处。将上颌骨浸入10%中性缓冲福尔马林溶液（pH=7.4）中固定48小时。固定结束后，将福尔马林溶液更换为70%乙醇。
  2. 对上颌骨进行显微CT扫描，扫描参数设置如下：各向同性体素尺寸为9至18 µm，X射线参数为50 kV，0.5 mm铝滤光片，旋转角度为0.5°。 一次显微CT扫描可同时容纳多个下颌骨样本。
  3. 使用所用显微计算机断层扫描（microCT）设备制造商提供的微断层成像重建程序对获取的图像进行重建17。
  4. 使用所用微断层成像设备制造商提供的3D检测程序对重建后的图像进行定位。
  5. 通过测量右侧上颌半侧（正畸移动侧）第一与第二磨牙釉牙骨质界（CEJ）之间的线性距离变化，与左侧上颌半侧（对照侧）进行比较，定量分析牙齿移动量（OTM）。使用适当的显微CT分析软件中的直线工具完成该测量17,18,19,20。
  6. 检查样本是否存在正畸诱导的炎性牙根吸收（OIIRR）。采用手动勾画不规则解剖区域的方法，选择上颌第一磨牙远中颊根作为感兴趣区域（ROI）。测量以下参数：牙根矿物密度（RMD；g/cm3）和牙根体积占总体积的百分比（RV/TV；%）。使用适当的显微CT分析软件中的3D体积工具完成该测量16,21。
  7. 使用Mimics软件对上颌第一磨牙进行三维重建，并分析所得数据，以对实验模型中的牙齿移动量（OTM）和正畸诱导的炎性牙根吸收（OIIRR）得出结论16,21。

结果

本方案通过使用镍钛合金螺旋弹簧建立正畸牙齿移动（OTM）小鼠模型。当施加0.35 N力时，对照侧第一与第二磨牙之间的釉牙骨质界（CEJ）平均距离为 243.69 µm (图1A，线A），而在OTM侧的测量位置为 284.66 µm (图1A，B线）。OTM侧与对照侧之间的差异为 40.97 µm (图1B)右侧上颌半侧（OTM侧）与左侧上颌半侧（对照侧）第一和第二磨牙间釉牙骨质界（CEJ）的线性距离，使用适当的显微CT分析软件中的直线工具，在至少六个不同断面上进行测量。将对照侧六次测量的平均值减去OTM侧六次测量的平均值得到OTM结果。图1).

关于 OIIRR，在对照侧（牙科 RV/TV 和 RMD 值分别为 71.02 ± 10.11% 和 1.071 ± 0.1536 g/cm2）和 OTM 侧（牙科 RV/TV 和 RMD 值分别为 73.38 ± 6.162% 和 1.048 ± 0.2119 g/cm2 µm；图 2）均展示了相关数值。

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图1：正畸牙齿移动（OTM）。（A）对照侧与OTM侧的代表性图像。（B）对照侧与OTM侧釉牙骨质界（CEJ）距离的结果，以及两者距离之差所反映的OTM距离。使用镍钛螺旋弹簧对右侧上颌第一磨牙施加0.35 N的近中方向力，研究终点为第12天。数据为10只小鼠实验结果的均值±标准差。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：选定感兴趣区域（ROI）的代表性图像。 显示的是上颌第一磨牙远中-前庭侧牙根的感兴趣区域（ROI），该区域采用手动勾画法绘制不规则解剖形状的感兴趣区域，用于分析牙根矿物密度（RMD；g/cm3）和单位总体积中的牙根体积百分比（RV/TV；%）。数据结果来自10只小鼠，以均值±标准差表示。请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件 1： 小鼠正畸牙移动的逐步操作指南。 请点击此处下载该文件。

讨论

本文介绍了一种标准化的实验方案，旨在阐明正畸牙齿移动（OTM）过程中骨重建的细胞与分子机制。要全面理解小鼠中的这些机制，必须制定周密的实验流程，以确保结果的准确性和可靠性7,11。本研究团队开展的研究表明，该方案通过引入张力测量装置和专门设计的器械，有效降低了操作者间的差异，并确定0.35 N为小鼠模型中OTM的最佳施力值4,16,17,18,19,20。为了提高实验操作的效率并最大化动物样本的利用，用于显微CT分析的样本还可进一步进行常规组织学处理。随后可在5 µm切片中评估OTM情况，并以牙骨质-釉质交界处（CEJ）作为测量参考点16,19。 苏木精-伊红染色以及抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色和Masson三色染色等特殊技术，也可有效用于评估牙根完整性，并对目标区域内的骨细胞、破骨细胞和成骨细胞进行定量分析4,5,16。

啮齿类动物正畸牙齿移动（OTM）过程中牙槽骨微结构的动态变化已通过显微CT系统进行了研究。这些评估旨在为临床正畸治疗提供有价值的参考14,15。显微CT是一种能够以高分辨率和微米级精度捕捉内部结构的分析技术。该方法可将微小样本重建为详细的三维图像，从而实现对样本的准确定性和定量分析22。与既往研究一致，OTM通过量化右侧上颌半侧第一与第二磨牙釉牙骨质界（CEJ）之间的线性差异，并与左侧上颌半侧进行比较来评估17,18,19,20。在牙科影像学领域，显微CT具有多项优势：可识别根面微小缺陷，精确测量牙齿线性变化，并评估小梁骨和皮质骨的形态22,23。值得注意的是，目前使用显微CT评估啮齿类动物骨微结构的指南强调了描述小梁骨和皮质骨形态计量学所推荐的最少变量集23。此外，分析正畸治疗期间一种严重并发症——正畸诱导性牙根吸收（OIIRR）的发生情况至关重要16,21。研究人员应评估牙根吸收的程度，因为OIIRR的存在提示所施加的力可能过大，需进行调整16,21。

在动物模型中进行正畸牙齿移动（OTM）研究时，遵循关键步骤对于获得可靠结果至关重要。这包括仔细选择动物，需考虑品系、年龄、骨代谢、生长速率和遗传背景等因素。动物模型的选择会显著影响研究结果，因为这些因素的差异会影响骨生理学特性以及对正畸力的反应6。动物安乐死的时间点也极为关键，因为它决定了能否捕捉到骨重建在正畸力作用下特定阶段的变化。例如，Taddei 等人4在0、12和72小时进行分子分析，并在第6天进行组织病理学分析，从而能够评估OTM过程中骨重建标志物的时间动态变化。此外，已有研究探讨了与年龄相关的OTM差异，揭示了衰老如何影响骨重建过程23。

尽管镍钛（NiTi）螺旋弹簧在诱导牙齿移动方面有效，但其使用存在某些可能影响动物福利和实验结果的缺点。与使用橡皮圈等其他方法相比，植入NiTi螺旋弹簧的操作更耗时且技术要求更高7。这种增加的复杂性可能提高植入过程中造成损伤的风险，进而导致术后动物体重下降更明显以及死亡率升高7。根据我们的经验，对动物进行每日监测并采取支持性措施（如提供软化饲料），在最大程度减少NiTi螺旋弹簧用于动物模型正畸牙齿移动（OTM）所引起的不良反应方面具有重要作用。这些措施不仅有助于改善动物福利，还可通过减少混杂因素并确保研究方案的一致性，提高实验结果的可靠性和有效性4,16,17,18,19,20。

在小鼠中应用OTM并结合显微CT分析，为研究骨适应机制、牙根吸收以及细胞对机械力刺激的反应提供了合适的模型。这种整合方法有助于深入理解正畸治疗背后的复杂过程，并促进新型治疗策略和干预手段的开发。

披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

我们衷心感谢 Beatriz M. Szawka 女士在示意图绘制方面所做的贡献，以及 Ilma Marçal de Souza 女士提供的技术支持。J.A.A.A. 获得了巴西里约热内卢州卡洛斯·查加斯·菲略研究资助基金会（FAPERJ，项目编号 E-26/200.331/2024）的博士后奖学金资助。本研究得到了巴西国家科学技术发展委员会（项目编号 406928/2023-1）、米纳斯吉拉斯州研究资助基金会以及高等级人才培养协调办公室（资助代码 001）的支持。 作者感谢巴西米纳斯吉拉斯联邦大学实验室生物技术中心（LabBio/UFMG）Eduardo H. M. Nunes 教授博士提供的X射线显微断层扫描分析支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙酮Sigma-Aldrich67-64-1
远端剪断钳QuinelatoQO.700.00
测力计SHIMPOFGE-5XY
光纤照明器Cole-ParmerN/A
氯胺酮Syntec100477-72-3
NiTi 开簧弹簧 0.25 × 0.76Lancer Orthodontics
Ø 0.20 mm 圆形铬镍（CrNi）丝Morelli55.01.208
圆形 CrNi 高弹性正畸丝 Ø0.50 mm（0.020 英寸）Morelli55.01.050
圆形 CrNi 结扎丝 Ø0.20 mm（0.008 英寸）Morelli55.01.208
体视显微镜QuimisQ7740SZ
Transbond Plus 自酸蚀粘接剂3MLE-Q100-1004-7
Weingart 钳QuinelatoQO.120.00
赛拉嗪Syntec23076-35-9
MicroCT 分析
Skyscan 1174v2Bruker1174v2
软件
NReconSkyscanN/A
DataViewerSkyscanN/A
CTAnSkyscanN/A
MimicsMaterialiseN/A

参考文献

  1. Kohli, N., et al. Bone remodelling in vitro: Where are we headed?: -A review on the current understanding of physiological bone remodelling and inflammation and the strategies for testing biomaterials in vitro. Bone. 110, 38-46 (2018).
  2. Epsley, S., et al. The effect of inflammation on bone. Front Physiol. 11, 511799(2021).
  3. Bolamperti, S., Villa, I., Rubinacci, A. Bone remodeling: an operational process ensuring survival and bone mechanical competence. Bone Res. 10 (1), 48(2022).
  4. Taddei, S. R., et al. Experimental model of tooth movement in mice: a standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains. J Biomech. 45 (16), 2729-2735 (2012).
  5. Guerrero, J. A., et al. Maxillary suture expansion: A mouse model to explore the molecular effects of mechanically-induced bone remodeling. J Biomech. 108, 109880(2020).
  6. Ibrahim, A. Y., Gudhimella, S., Pandruvada, S. N., Huja, S. S. Resolving differences between animal models for expedited orthodontic tooth movement. Orthod Craniofac Res. 20, Suppl 1 72-76 (2017).
  7. Kirschneck, C., Bauer, M., Gubernator, J., Proff, P., Schröder, A. Comparative assessment of mouse models for experimental orthodontic tooth movement. Sci Rep. 10 (1), 12154(2020).
  8. Huang, H., Williams, R. C., Kyrkanides, S. Accelerated orthodontic tooth movement: molecular mechanisms. Am J Orthod Dentofac Ortho. 146 (5), 620-632 (2014).
  9. Ariffin, S. H. Z., Yamamoto, Z., Abidin, I. Z., Wahab, R. A. M., Ariffin, Z. Cellular and molecular changes in orthodontic tooth movement. Sci World J. 11, 1788-1803 (2011).
  10. Alhasyimi, A. A., Pudyani, P. P., Asmara, W., Ana, I. D. Enhancement of post-orthodontic tooth stability by carbonated hydroxyapatite-incorporated advanced platelet-rich fibrin in rabbits. Orthod Craniofac Res. 21, 112-118 (2018).
  11. Klein, Y., et al. Immunorthodontics: in vivo gene expression of orthodontic tooth movement. Sci Rep. 10 (1), 8172(2020).
  12. Fujimura, Y., et al. Influence of bisphosphonates on orthodontic tooth movement in mice. Eur J Orthod. 31 (6), 572-577 (2009).
  13. Waldo, C. M., Rothblatt, J. M. Histologic response to tooth movement in the laboratory rat; procedure and preliminary observations. J Dental Res. 33 (4), 481-486 (1954).
  14. Chavez, M. B., et al. Guidelines for micro-computed tomography analysis of rodent dentoalveolar tissues. JBMR Plus. 5 (3), e10474(2021).
  15. Trelenberg-Stoll, V., Wolf, M., Busch, C., Drescher, D., Becker, K. Standardized assessment of bone micromorphometry around teeth following orthodontic tooth movement: A µCT split-mouth study in mice. J Orofac Ortho. 83 (6), 403-411 (2022).
  16. Santos, M. S., et al. Targeting phosphatidylinositol-3-kinase for inhibiting maxillary bone resorption. J Cell Physiol. 238 (11), 2651-2667 (2023).
  17. Macari, S., et al. Oestrogen regulates bone resorption and cytokine production in the maxillae of female mice. Arch Oral Biol. 60 (2), 333-341 (2015).
  18. Macari, S., et al. Lactation induces increases in the RANK/RANKL/OPG system in maxillary bone. Bone. 110, 160-169 (2018).
  19. Pereira, L. J., et al. Aerobic and resistance training improve alveolar bone quality and interferes with bone-remodeling during orthodontic tooth movement in mice. Bone. 138, 115496(2020).
  20. Silva, F. R. F., et al. Protective effect of bovine milk extracellular vesicles on alveolar bone loss. Mol Nutri Food Res. 68 (3), 2300445(2024).
  21. Amaro, E. R. S., et al. Estrogen protects dental roots from orthodontic-induced inflammatory resorption. Arch Oral Biol. 117, 104820(2020).
  22. Xu, X., Zhou, J., Yang, F., Wei, S., Dai, H. Using micro-computed tomography to evaluate the dynamics of orthodontically induced root resorption repair in a rat model. PLoS One. 11 (3), e0150135(2016).
  23. Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Mineral Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
  24. Kanou, K., et al. Effect of age on orthodontic tooth movement in mice. J Dent Sci. 19 (2), 828-836 (2024).

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