使用ELISA法检测MCF-7细胞中8-oxo-dG水平以评估氧化性DNA损伤

摘要

本方案描述了一种利用ELISA技术对MCF-7细胞中DNA氧化损伤进行定量检测的有效方法。

摘要

8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-oxo-dG）碱基是常见的DNA氧化损伤中最主要的形式。DNA损伤显著影响基因表达，并在促进神经退行性疾病、癌症和衰老过程中起关键作用。因此，对8-oxo-dG进行精确定量在DNA损伤检测方法的研究中具有重要的临床意义。然而，目前现有的8-oxo-dG检测方法在便捷性、快速性、经济性和灵敏度方面仍存在挑战。本研究采用夹心酶联免疫吸附测定法（ELISA），一种高效且快速的比色方法，检测经不同浓度过氧化氢（H₂O₂）刺激的MCF-7细胞样品中8-oxo-dG含量的变化₂O₂）。我们测定了H的浓度₂O₂ 通过检测其IC值，诱导MCF-7细胞的氧化损伤₅₀ MCF-7 细胞中的数值。随后，我们用 0、0.25 和 0.75 mM H 处理 MCF-7 细胞₂O₂ 孵育12小时后，从细胞中提取8-oxo-dG。最后，对样品进行ELISA检测。经过一系列步骤，包括包板、洗涤、孵育、显色、终止反应和数据采集，我们成功检测到H诱导的MCF-7细胞中8-oxo-dG含量的变化₂O₂通过这些努力，我们旨在建立一种评估细胞样本中DNA氧化损伤程度的方法，从而推动更快速、便捷的DNA损伤检测技术的发展。该研究将为探索DNA氧化损伤与多个领域之间的关联分析作出有意义的贡献，包括疾病临床研究以及有毒物质检测。

引言

DNA 氧化损伤是活性氧（ROS）的生成与细胞抗氧化防御系统之间失衡的结果¹。其主要涉及 DNA 嘌呤和嘧啶碱基的氧化^2,3。DNA 碱基的这种氧化修饰不仅破坏基因组的完整性，还与多种病理问题相关，包括癌症、神经退行性疾病和心血管疾病^4,5。DNA 中的鸟嘌呤碱基具有最低的还原电位，最易发生氧化⁶。因此，8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-oxo-dG）是评估 DNA 氧化损伤程度的主要标志物^7,8。准确量化 8-oxo-dG 已成为研究疾病发生、发展以及评估多因素氧化负荷的关键问题⁹。

检测8-oxo-dG的传统方法，如高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ECD）、质谱法及相关联用技术，具有高灵敏度和高特异性^10,11,12。然而，这些技术通常操作复杂且成本较高，限制了其在高通量样本分析中的广泛应用和实用性。随着科学技术的不断进步，多种新型、高效且准确的方法相继出现。这些新技术的应用使我们能够更精确地定量8-oxo-dG水平，为深入研究氧化应激与疾病之间的关联提供了更强大的工具。例如，研究人员已将纳米孔技术应用于DNA的定量检测与测序¹³，利用单步点击化学测序策略识别DNA损伤类型¹⁴，开发高通量测序方法，并通过结合生物素-链霉亲和素与ELISA构建基于8-oxoG的生物传感器¹⁵。其中，ELISA因其在特异性、高通量筛选和成本方面的公认优势，成为检测8-oxo-dG的理想方案之一。因此，开发一种高通量、高灵敏度、便捷且快速的8-oxo-dG检测方法至关重要。

酶联免疫吸附测定（ELISA）技术于1971年建立¹⁶，在过去50年中迅速发展，现已成为生物学和医学领域最常用的检测方法之一^17,18,19。ELISA技术具有高灵敏度和高特异性，反应时间短，操作简便，因此被广泛认可为大规模样本检测和高通量分析的首选方法²⁰。因此，ELISA已被广泛用于对细胞内化合物、蛋白质、抗体或分子进行定量或半定量分析^21,22,23。例如，该技术已被应用于多种疾病相关生物标志物、药物残留及生物分子的检测²⁴。根据实验设计和原理的不同，ELISA可分为四种主要类型²⁵，包括直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA和竞争ELISA^26,27。其中，本文研究所采用的是夹心ELISA，该方法利用两种特异性抗体，一种用于捕获目标分子，另一种用于检测。夹心ELISA的实验原理如下：首先，将一种特异性抗体固定在微孔板的孔中，以捕获目标分析物；加入标准品或待测样本后，目标分析物与固相抗体结合；随后加入识别抗原上另一表位的标记抗体，形成“夹心”结构；洗去未结合的抗体后，加入底物；在二抗的催化作用下发生显色反应，显色强度与样本中目标分析物的浓度呈正相关；最后通过测定光密度（OD）值来确定样本浓度。夹心ELISA具有对目标样本更高的灵敏度和特异性，适用于检测低浓度目标分析物及复杂样本²⁸。此外，所得结果可进行定量分析，便于后续研究。这些优势使夹心ELISA成为科学研究和临床实验室中常用的检测方法²⁹。

本研究旨在定量检测MCF-7细胞中的8-oxo-dG，以确定细胞内DNA氧化损伤的程度。本研究主要包括两个部分：构建MCF-7细胞DNA氧化损伤模型，以及采用ELISA法检测8-oxo-dG。首先，培养MCF-7细胞 体外 并用不同浓度的 H 处理₂O₂ 不同时间。采用CCK-8法检测细胞活力，以确定半数抑制浓度（IC₅₀H 的)₂O₂ 在 MCF-7 细胞中。根据 IC₅₀ 值，一个适当的 H₂O₂ 选择适当的处理时间和诱导浓度。为提取经氧化损伤的MCF-7细胞样本，收集细胞样本及上清液，并加入预先包被有8-oxo-dG抗体的酶标板孔中。样本中的8-oxo-dG将与固相载体上结合的抗体发生特异性结合。随后加入辣根过氧化物酶标记的8-oxo-dG抗体，反应体系在恒温条件下孵育，以确保样本与抗体充分结合。通过洗涤去除未结合的酶，然后加入显色底物，反应液呈现蓝色。在酸性条件下，溶液变为黄色。最后在450 nm波长下测定各反应孔样本的吸光度（OD值），样本中8-oxo-dG的浓度与OD值成正比。通过绘制标准曲线，可计算出样本中8-oxo-dG的浓度。

方案

1. 在 MCF-7 细胞中构建 H₂O₂ 诱导的 DNA 氧化损伤模型

1. MCF-7 细胞复苏
   1. 将含有 3.5 x 10⁶ 个细胞的细胞培养冻存管⁶ MCF-7 细胞储存于 -80°C 冰箱中，并迅速转移至含有液氮的泡沫盒内。用镊子取出冻存管，置于 37 °C 恒温水浴中约 1 分钟，以融化保存的细胞。
      注意：在水浴解冻过程中，需间歇性摇动细胞，以确保冻存管受热均匀。
   2. 将冻存管放入离心机中，在室温下以150 x g离心 g 5 分钟。
   3. 使用移液器弃去冻存管中的上清液，加入1 mL完全培养基。充分混匀后转移至10 mm培养皿中，并补充额外的7 mL完全培养基。
   4. 以十字交叉方式轻轻摇动培养皿以确保混合均匀，并在 CO₂ 培养箱中继续培养。₂ 37 °C、5% CO₂ 培养箱₂.
      注意：完全培养基由添加了10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的DMEM培养基组成。
2. 细胞活力评估
   1. 选择处于对数生长期且细胞状态良好的MCF-7细胞用于实验。在对数生长期，细胞通常具有较短的分裂周期和较高的分裂频率。
      1. 使用电子显微镜观察MCF细胞的形态和生长速率。当细胞呈现均匀且紧密排列的单层形态，并可见明显的细胞增殖时，可判定细胞基本处于对数生长期。
   2. 细胞洗涤：用移液器吸去培养皿中的培养基，加入1 mL PBS缓冲液洗涤细胞，然后弃去PBS。
   3. 细胞消化：加入1 mL胰蛋白酶洗涤细胞，孵育约1分钟，使胰蛋白酶充分消化并使细胞从培养皿上完全脱落。轻轻敲击培养皿，观察细胞是否移动
      成片状表明细胞已充分脱离。
   4. 终止细胞解离与细胞计数：加入8 mL完全培养基以终止解离过程，轻柔吹打混匀细胞，并使用细胞计数仪测定细胞悬液浓度。
      注意：计数前需轻轻吹打细胞悬液，确保其均匀。
   5. 细胞接种：将稀释后的细胞悬液调整至每100 µL含5,000个细胞。使用移液枪将100 µL细胞悬液接种至96孔板的21个孔中。在接种细胞的孔周围孔中加入100 µL PBS缓冲液，以防止培养基过度蒸发。
   6. H的制备₂O₂含培养基：在12孔细胞培养板中选取9个孔，根据H的梯度进行标记₂O₂ 浓度（0、0.25、0.50、0.75、1.0、1.5、2.0 mM）。向标记为2.0 mM和1.5 mM的孔中各加入720 µL完全培养基，向其余各孔中各加入360 µL完全培养基。
      1. 使用移液器，分别加入 1.63 µL 和 1.22 µL 的 3% H₂O₂ 将试剂分别加入标记为 2.0 mM 和 1.5 mM 的孔中，充分混匀。使用移液器，将 360 µL 的 2.0 mM H₂O₂ 加入标记为1.0 mM的孔中并混匀；然后，取360 µL的1.0 mM H₂O₂ 加入标记为0.5 mM的孔中并混匀；最后将360 µL的0.5 mM H₂O₂ 加入标记为 0.25 mM 的孔中。用移液器吸取 360 µL 的 1.5 mM H₂O₂ 加入标记为0.75 mM的孔中，稀释至所需浓度。图1).
         ​注意：确保 H₂O₂ 将移液管中的储备液完全转移至孔板中，避免残留任何溶液。在进行稀释前，确保溶液充分混匀。
   7. 孵育：细胞接种约24小时后，待细胞贴壁，用移液器从96孔板中吸除培养基。根据浓度梯度，加入相应浓度的H₂O₂向每孔加入含培养基。将培养板放回培养箱中孵育12小时。
   8. CCK-8试剂的添加：在指定的12小时处理期结束后，用移液器从96孔板中吸去培养基，每孔加入100 µL完全培养基和10 µL CCK-8试剂，并设置三孔空白对照。将培养板置于37 °C孵育2小时。
      注意：加样过程中应避免产生气泡，以防干扰 OD 值的读数。
   9. 吸光度测定：从培养箱中取出96孔板，使用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度，并记录结果。
   10. 根据IC₅₀ 计算公式，
       抑制率（%）=（药物实验组OD值－药物对照孔平均OD值）/（细胞对照孔平均OD值－药物对照孔平均OD值）× 100%
       以对照组培养物的吸光度百分比计算结果。
   11. 将处理后的实验数据导入统计分析软件，选择分析类型 非线性回归，构建四参数逻辑模型，然后点击 拟合曲线 用于曲线拟合的按钮。拟合完成后，软件将自动计算 IC₅₀ 值
3. H₂O₂诱导的 MCF-7 细胞氧化实验
   1. 取生长状态良好的对数生长期MCF-7细胞用于实验。
   2. 洗涤，进行细胞解离，终止解离反应，并对细胞进行计数（具体方法参见步骤1.2）。
   3. 细胞接种：将细胞悬液的密度调整至 1 x 10⁶ 每皿细胞数，每6 cm直径培养皿加入4 mL悬浮液。
   4. 标记两个5 mL微量离心管，分别标注为0.25 mM和0.75 mM 3% H₂O₂. 每管加入 4 mL 完全培养基，然后分别加入 1.13 µL 和 3.40 µL 的 3% H₂O₂，分别。轻轻摇动试管以确保充分混匀。将三个培养皿中的培养基更换为含有H的完全培养基₂O₂ 0、0.25 和 0.75 mM 浓度。
   5. 孵育培养物：将培养皿放回培养箱中孵育12小时。

2. 细胞样品的制备和ELISA试剂的准备

1. 细胞提取物样品的收集
   1. 样品采集：弃去 MCF-7 细胞培养上清液，冲洗后进行细胞解离，终止解离反应，并收集细胞。将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中。
   2. 离心：在 800 × g 条件下离心 5 分钟，收集细胞沉淀。每份细胞样品加入 200 µL PBS 重悬，并通过反复冻融循环裂解细胞。将细胞裂解液在 1,500 × g 条件下离心 10 分钟，用移液器吸取上清液用于分析。
      注意：当细胞量较少时，应减少用于重悬的 PBS 体积。若无法立即进行分析，样品可在 4 °C 下保存最多 1 周。如需长期保存，应根据单次使用量分装样品并置于 -80 °C 保存，避免反复冻融。
2. ELISA 试剂的准备
   1. 试剂解冻：将 ELISA 试剂（包括封板膜、预包被板、标准品、样品稀释液、检测抗体-HRP、显色底物、终止液、20 倍浓缩洗涤液）以及待测样品在开始实验前于室温（18–25 °C）平衡 20 分钟。使用前 15 分钟开启 ELISA 酶标仪。
   2. 洗涤液的配制：计算所需稀释洗涤液的体积，将 20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释至 1 倍工作浓度。未用完的浓缩洗涤液应放回 4 °C 冰箱保存。
      注意：洗涤液应在使用前新鲜配制。若冷藏保存的浓缩洗涤液中出现结晶，需将其恢复至室温并轻轻摇动，直至结晶完全溶解后方可使用。
   3. 标准品的配制
      1. 分别配制浓度为 1.25、2.5、5、10、20 和 40 ng/mL 的标准品工作液。为确保实验结果的准确性，使用前应仔细上下混匀标准品，避免溶解过程中产生气泡。

3. ELISA 实验

1. 包被板：预先设计好标准品、样品及空白/对照所需的孔数，并取出相应的板条。向反应孔中加入50 µL不同浓度的标准工作液和待测样品。标准品设三个复孔，空白/对照孔中不加任何样品²⁵。
   注意：ELISA实验的操作步骤如图2所示。若样品浓度超出检测范围，应在加样前用样品稀释液进行稀释。加样时应将液体加至孔底，避免接触孔壁，轻轻震荡混匀，避免产生气泡。为确保实验准确性，每次加样应在10分钟内完成。
2. 孵育：除空白孔外，每孔加入100 µL辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体，用封板膜密封后，在37 °C恒温孵育箱中孵育60分钟。
3. 洗涤：弃去孔内液体，甩干，用吸水纸拍干；每孔加入350 µL洗涤缓冲液，静置1–2分钟，然后弃去洗涤液。重复洗涤5次。
   注意：充分洗涤至关重要，因其直接影响实验结果的准确性。每次洗涤后应确保彻底甩净洗涤液。洗涤后仔细擦拭板底残留液滴，以免影响吸光度测定。
4. 显色反应：每孔加入50 µL底物A和50 µL底物B，密封后于37 °C避光孵育15分钟。
   注意：加入显色试剂后应及时观察反应孔颜色变化。若颜色过深，可提前加入终止液以终止反应。
5. 终止反应并测定吸光度：每孔加入50 µL终止液，立即使用酶标仪在450 nm波长下测定OD值（需在15分钟内完成）。
6. 数据分析：将处理后的实验数据导入统计分析软件，选择分析类型为线性回归。以标准品浓度为X轴，光密度（OD）值为Y轴绘制标准曲线。利用所建立的标准曲线确定样品中8-oxo-dG的浓度。构建Logistic数学模型，并点击拟合曲线按钮进行曲线拟合。拟合完成后，软件将自动计算标准曲线及P值。
   注意：标准曲线不可重复使用，每次实验均需重新绘制。

结果

如图3所示，X轴表示施加于MCF-7细胞的H₂O₂浓度，Y轴表示细胞活力。以0.75 mM浓度处理12小时后，MCF-7细胞的活力降至67%。随着浓度增加，MCF-7细胞活力显著下降，尤其在1.5 mM浓度时，细胞活力降至3%以下（表1）。实验结果表明，MCF-7细胞的IC₅₀为0.7655 mM。

在本系列实验中，我们采用了一种改进的ELISA技术来定量检测8-oxo-dG水平。通过数据分析，得到标准曲线的回归方程为：

Y = 23.66 × X + 0.07038。

如图4A所示，标准曲线表现出高度线性（R²=0.978）；图4B显示，样品中测得的8-oxo-dG浓度与其相应添加量之间具有强相关性，表明方法具有良好的精密度（变异系数小于5%）。此外，多次重复实验所得结果的一致性表明该实验方法具有可靠性和可重复性。

综上所述，实验数据表明，在严格控制的条件下，我们优化后的 ELISA 方法能够成功检测 8-oxo-dG 水平的变化。这对于将来在更广泛的样本类型中应用该技术以监测氧化应激引起的 DNA 损伤具有重要意义。尽管存在某些局限性，但在优化实验条件后，该方法的应用前景仍十分可观。

图1：制备H₂O₂稀释液。 该示意图描述了过氧化氢（H₂O₂）稀释液的制备方法，包括精确混合溶液，并将不同浓度的H₂O₂溶液分别转移至标记为1.0 mM、0.5 mM和0.25 mM的试管中。通过将1.5 mM的H₂O₂转移至标为0.75 mM的试管中，以获得目标浓度。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：用于抗原检测的酶联免疫吸附测定（ELISA）。 本示意图展示了用于抗原检测的酶联免疫吸附测定（ELISA）的各个连续步骤：样品加入与空白对照设置；HRP标记抗原孵育；洗涤及板孔准备；底物加入与孵育；反应终止及光密度（OD）测定。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：H₂O₂ 抑制 MCF-7 细胞增殖。 采用 CCK-8 法检测细胞活力，用不同浓度的 H₂O₂（0、0.25、0.50、0.75、1.0、1.5 或 2.0 mM）处理细胞 12 小时，并计算指定条件下的 IC₅₀ 值。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：H₂O₂ 处理后 MCF-7 细胞中 8-氧代脱氧鸟苷（8-oxo-dG）的定量分析。（A）8-氧代脱氧鸟苷（8-oxo-dG）的 ELISA 标准曲线。显示已知浓度的 8-oxo-dG（1.25、2.5、5、10、20 和 40 ng/mL）与其相应吸光度值之间的关系。标准曲线的回归方程为 Y = 23.66 × X + 0.07038。（n=3，R²=0.978）。（B）经 H₂O₂ 处理的 MCF-7 细胞中 8-oxo-dG 的浓度。该图显示了暴露于不同浓度 H₂O₂（0、0.25 和 0.75 mM）的 MCF-7 细胞中 8-oxo-dG 的水平。每个数据点代表三次独立实验的平均值 ± 标准误（SE）（n=3），说明氧化应激对 DNA 损伤的影响。请点击此处查看该图的放大版本。

参数
H2O2 浓度，mM	0	0.25	0.5	0.75	1	2
MCF-7 细胞活力，%	100	82.8	81.37	61.07	13.4	2.77

表1：经H₂O₂处理的MCF-7细胞的细胞活力。

讨论

ELISA 方法的开发对于现有及新型 DNA 损伤检测技术具有重要意义。与传统的高效液相色谱法（HPLC）和质谱技术相比，该方法不仅操作简便，而且具有高灵敏度，能够满足高通量筛选的需求³⁰。这使得在大规模疾病筛查研究中对 8-oxo-dG 进行监测成为可能，有助于深入理解该生物标志物与多种疾病之间的关联。

在实验过程中，若干关键步骤对于确保结果的可靠性和可重复性至关重要。首先，实验准确评估了MCF-7细胞对H₂O₂的敏感性，在12小时时的IC₅₀值为0.7655 mM，反映了MCF-7细胞的耐受水平。该结果对于理解MCF-7细胞的抗氧化防御机制及其在氧化应激条件下的存活具有重要的科学意义，同时为未来抗氧化药物的筛选或相关治疗机制的研究提供了重要的参考指标³¹。此外，8-oxo-dG抗体的选择与配对对于ELISA检测至关重要，直接影响ELISA检测系统的特异性和灵敏度。同时，优化信号放大策略和样品处理步骤也是影响检测准确性的关键因素。我们发现，采用稳定的底物反应体系可降低背景误差，并提高检测的灵敏度范围。

在实验过程中，可能会出现抗体不稳定、信号波动以及反应物交叉反应等技术问题。为解决这些问题，我们采用了一种更为稳定的实验方案，包括使用稳定的抗体溶剂以提高抗体的稳定性，并对实验条件进行优化和调整。此外，为消除信号波动所导致的误差，我们利用标准的8-oxo-dG样品对实验进行标准化处理，以确保结果的一致性。

关于实验方法的局限性，尽管ELISA提供了一种高通量的检测方法，但其结果仍可能受限于特异性抗体的覆盖范围以及不可避免的底物交叉反应性³²。因此，对于复杂的样本，可能需要额外的样品纯化或预处理步骤。此外，对于浓度较低的样本检测，可能需要进一步优化抗体活性，以满足研究要求。

综上所述，8-oxo-dG 的 ELISA 检测方法在特定研究领域具有重要意义。该方法在环境监测、疾病风险评估以及早期诊断方面具有潜在应用价值，并为农业、食品安全和药物筛选中的 8-oxo-dG 检测提供了新的技术手段³³。例如，在环境生物监测中，检测环境毒素在生物体内引起的 DNA 氧化损伤应激，有助于及时识别潜在风险³⁴。未来，随着检测技术的进一步优化及其在多学科领域的应用，该方法有望在生命科学研究中发挥更为关键的作用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA(1x)	Gibco	25200-072
Cell Counting Kit-8	Dojindo	CK04
细胞计数板	QiuJing	XB-K-25
CO2 培养箱	Thermo	51032872
DMEM 基础培养基(1X)	Gibco	C11995500BT
FBS	PAN	ST30-3302
GraphPad Prism X9	GraphPad Software		统计分析软件
高速离心机	Thermo	9AQ2861
人8-oxo-dG ELISA试剂盒	Zcibio	ZC-55410
L-1000XLS+ 移液器	Rainin	17014382
L-20XLS+ 移液器	Rainin	17014392
液氮罐	Mvecryoge	YDS-175-216
MCF-7 细胞	BNCC	BNCC100137
Multiskan FC 微孔板分光光度计	Thermo	1410101
PBS	Solarbio	P1020
青霉素-链霉素溶液，100X	Beyotime	C0222
三目活细胞显微镜	Motic	1.1001E+12
超低温冰箱	Haire	V118574