本研究描述了一种通过开腹手术在大鼠中进行胸腹主动脉阻断后内脏缺血-再灌注所致急性肺损伤的模型。该模型可用于研究主动脉阻断的临床和生物学效应，以及缺血-再灌注对内脏器官和远隔肺部损伤的影响。
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摘要
摘要
腹主动脉瘤的开放手术需要暂时中断血液循环，从而导致远端器官的缺血-再灌注损伤。肾动脉、肠系膜动脉和内脏动脉可能受累。目前尚无任何疗法被证实可有效预防腹腔干上方主动脉阻断后由缺血-再灌注引起的远隔性肺损伤。为了研究急性肺损伤的病理生理通路及药物治疗，已在大鼠中建立主动脉阻断的实验模型。
术前给予丁丙诺啡（0.05 mg/kg）进行皮下镇痛。通过面罩吸入卤代烃气体（2.5%异氟烷）诱导自主呼吸下的全身麻醉。在加热手术台上（直肠内监测体温）行剑突至耻骨的剖腹手术。将胃脾组织块和肠管向右侧腹壁牵拉，肝脏游离至腹腔上部。辨认膈肌及其膈脚，逐步松解腹腔动脉上方的主动脉膈内走行段。轻柔分离，以实现对膈脚间主动脉的环周控制。仔细辨认其深部的腹腔干和肠系膜上动脉。可在内脏动脉上方使用微血管夹夹闭主动脉。通过观察主动脉搏动消失及小肠颜色变苍白来确认夹闭成功。在整个缺血期间，大鼠持续保持麻醉状态。缺血结束后，移除微血管夹，观察主动脉搏动恢复情况以及小肠颜色是否恢复正常。随后缝合腹壁，再缝合大鼠皮肤。在再灌注期结束时，以相同方式再次麻醉动物。通过采血过程中的放血法实施安乐死，随后可取出肺组织。肺损伤可通过血气分析、肺重量测定及组织学检查进行评估。肺组织样本还可用于RT-PCR和Western blot分析。
引言
主动脉瘤是指主动脉的局部且永久性扩张1。动脉瘤的发展趋势是发生破裂，导致大出血，具有较高的死亡率2。因此，治疗的重点在于预防这一严重并发症。主动脉瘤最常见于肾下段，可通过主动脉腔内移植物进行治疗。主动脉双髂支腔内移植物是一种带膜的分叉支架，通过股动脉经皮穿刺途径以微创方式置入。该技术无需主动脉阻断，避免了内脏缺血的发生，且可在局部麻醉下完成。相比之下，范围更广的主动脉瘤——如胸腹主动脉瘤和复杂的腹主动脉瘤——采用腔内技术治疗更具挑战性。这是由于动脉瘤累及肾动脉、肠系膜上动脉以及腹腔干 (图1)。除主动脉本身外，这些主要的内脏动脉也需要重建。因此，腔内微创治疗方法需要更为复杂的操作，涉及使用开窗型和/或分支型腔内移植物来重建内脏动脉。这类移植物的主要局限在于制造周期较长——通常需要数月时间——因而不适用于急诊治疗。在此类情况下，传统的开放手术修复仍是一种可行且可靠的治疗选择。
开放修复治疗需要开腹手术和胸腹主动脉上方内脏区域的临时阻断，即暂时性内脏缺血。此类胸腹主动脉瘤治疗过程中的并发症发生率较高，死亡率介于5%至15%之间3。肺部并发症发生率为60%，肾脏并发症为40%4。这些并发症常伴随全身性炎症反应，可能进展为多脏....
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方案
该模型的建立遵循动物护理与实验的指导原则以及法国和欧洲的法律法规。此模型已在一项实验动物研究中得到验证，该研究已获得法国鲁昂诺曼底地区大学伦理委员会批准（编号°APAFIS：#18974
1. 动物模型与适应性饲养
- 动物模型适应期
注意：该模型遵循优化原则。- 手术前将动物饲养在不拥挤的设施中一周，以适应环境。
- 每笼饲养两只大鼠，自由饮水和进食，由经验丰富的人员每日检查。
- 每日检查垫料（纸条）的清洁度，并由经验丰富的人员每周系统更换两次，必要时增加更换频率。
- 经过为期一周的适应期，在此期间动物每日与实验人员接触，并暴露于12小时光照循环中，实验将在同一实验人员操作下的独立、安静房间内进行。
- 动物模型物种
- 使用雄性Wistar或Sprague Dawley大鼠，以避免激素（如雌二醇）对内脏缺血-再灌注病理生理学分析的影响，动物应来自经认证的合格繁殖机构11,20。
- 预先确定实验分组及每组动物数量。
- 建议选用6至10周龄的大鼠（体重350 g）进行实验。
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结果
该方案被证实是安全的，在麻醉和手术过程中动物损失极少（低于5%），并能有效诱导急性肺损伤。异氟烷麻醉比氯胺酮联合赛拉嗪麻醉更安全（损失率约为15%），且动物苏醒迅速，大鼠恢复情况更好（数据未显示）。所有麻醉动物均能通过该方法顺利完成安全有效的主动脉夹闭。所有（100%）成功实施主动脉夹闭的动物均分别耐受了持续40分钟的缺血期和3小时的再灌注期。
根据本方案，血样分析已成功完成。在涉及65只大鼠的研究中，平均采集血量为4.5 ± 1.2 mL，可用于血气分析以及ELISA和多重检测法进行生化血浆分析。血气分析的成功率为100%。回收血浆的平均体积为750 µL。血气分析显示，在腹腔动脉上方主动脉阻断后，pH、PaO₂、SpO₂和HCO₃⁻降低，PaCO₂升高（表2）
成功进行了组织分析，实现了核酸分析（逆转录聚合酶链式反应/RT-PCR）、蛋白质分析（Western Blot/WB）以及组织学评估。肺组织学结果如表3所述，在主动脉阻断后总体损伤评分显著升高（分别.......
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讨论
这种主动脉阻断的手术模型具有优势，可对内脏缺血-再灌注后发生的急性肺损伤进行全面分析，包括基于组织和基于血浆的分析。同时，该模型还提供了在预处理或后处理阶段通过腹腔内、肠内或静脉给药方式测试药理学分子的机会。
手术过程中一个关键步骤仍然是腹腔干上方的主动脉阻断。一旦掌握，该步骤可迅速完成。该技术的学习曲线较陡：通常只需进行不到三次操作即可掌握安全有效的手术方法。使用精细的弯头器械（如解剖钳和结扎钳）可大大便利操作过程。此外，使用单丝缝合线可防止 与周围组织粘连，且创伤更小。
经下腔静脉静脉注射也是一种具有显著出血风险的操作。止血敷料的使用带来了实质性改变，有助于避免直接缝合下腔静脉所带来的一系列技术难题。静脉壁极为脆弱，任何试图修复针刺损伤的操作都极有可能扩大血管损伤。手动压迫损伤部位是实现下腔静脉止血的一种可能替代方法；然而，这种方法可能导致静脉回流受阻，进而可能影响心肺功能。
在自主呼吸条件下实施该干预措施，可使模型无需复杂的兽医麻醉设备即可进行。使用异氟烷.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 µm 硝酸纤维素膜 Trans-Blot Turbo 转膜试剂盒 | 伯乐（Bio-Rad） | 1620150 | 0.2 µm 预切硝酸纤维素膜 |
| 1毫升鲁尔滑动式注射器（不含针头） | Terumo | MDSS01SE | 1毫升鲁尔滑动式注射器（不带针头） |
| 2毫升鲁尔滑动式注射器（不带针头） | Becton Dickinson | 2毫升鲁尔滑动式注射器（不带针头） | |
| 4 mL EDTA 管，BD K3，13 mm × 75 mm | BD Vacutainer | BD368860 | 5 mL EDTA 管 BD K3 13 mm × 75 mm |
| 5-0 编织缝合线 / Vicryl 5-0（Ethicon）或 Novosyn（B. Braun） | Ethicon - 强生公司 | V7970E | Vicryl 5-0 圆锥形针 1/2 圆 13 mm 长度 45 cm |
| 5-0 单丝可吸收缝线 / Monocryl Poliglecaprone | Ethicon - 强生公司 | Y493G | 针头，3/8圆弧，长度18英寸 |
| 5 cc 鲁尔滑动式注射器（不带针头） | Terumo | SS-05LE1 | 5cc 鲁尔滑动式注射器（不带针头） |
| 无创微血管夹/静脉用一次性血管夹 | AROSurgical | TKF-1-20g | 用于夹闭大鼠主动脉的无创微血管夹（适用于静脉） |
| BD Microlance 3 23 G × 1 0.6 × 25 mm | BD Vacutainer | 300800 | BD Microlance 3 23 G x 1 0.6 x 25 mm |
| BD Microlance 3 25 G x 5/8 0.5 x 16 mm | BD Vacutainer | 300600 | BD Microlance 3 25 G x 5/8 0.5 x 16 mm |
| BD Microlance 3 30 G x 1/2 0.3 x 13 mm | BD Vacutainer | 304000 | BD Microlance 3 30 G x 1/2 0.3 x 13 mm |
| β-actin Invitrogen | 美国加利福尼亚州卡尔斯巴德 | 15G5A11/E2 | |
| Bradford 法蛋白质测定 | 伯乐，马尔讷拉科凯特，法国 | 5000201 | |
| 布托啡诺 | 布托啡诺 | ||
| Sigma 3-30 离心机 | 德国 Sigma | 10375, 10376, 10377, 10378, 10379, 91276, 109014 | Eppendorf 离心机 |
| cOmplete Mini | 罗氏 | 11836153001 | 蛋白酶抑制剂混合物 25片 |
| 棉签 | |||
| Dacryogel 眼用凝胶 Lubrithal 10 g | 德克拉动物保健产品 | 代码 ACL7376464 | 眼用凝胶 Lubrithal 10 g |
| 一次性手术刀 | 至关重要 | PDSS11 | 一次性手术刀片 n°11 |
| 电灼术 | DentRMed | EMB/87400 | 高温止血笔 |
| 增强型化学发光检测系统 | 美国加利福尼亚州赫拉克勒斯，伯乐公司 | 1705060S | |
| Fisherbrand 24 孔珠磨机 | Fisher Scientific | 15515799 | 用于 研磨、裂解和生物样本的均质化，以用于分子提取 |
| 纱布拭子 | Raffin | .010106 | 纱布拭子 |
| ImageLabTM 软件 | 伯乐（Bio-Rad） | 在U盘或许可证中 | |
| 异氟烷 5% | 异氟烷 5% | ||
| 利多卡因-丙胺卡因凝胶 5% | Aguettant，里昂，法国 | 利多卡因-丙胺卡因凝胶 5% | |
| LightCycler 480 仪器 | 罗氏，Bâ瑞士 | 5015243001 | 热循环仪 |
| 润滑凝胶 无菌 K-Y 82 克 | 利洁时集团 | 润滑凝胶 无菌 K-Y 82 克 | |
| NanoDrop 2000 | 赛默飞世尔科技，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | ND-2000 | 分光光度计 |
| Peha 解剖镊 | Hartmann | 991063 | 解剖镊 |
| PhosSTOP | 罗氏 | 4906837001 | 磷酸酶抑制剂20片 |
| 石膏/胶带黏合剂 | Anapore | 135320 | 手术粘合胶带/敷料 |
| 聚维酮碘溶液 / Vété染色液 | Vé辅酶Q10氢醌形式 | 外用抗菌溶液 | |
| Precellys 裂解试剂盒管 | 硬组织匀浆器 CK28，Bertin | CK28 | Precellys 裂解试剂盒管 |
| 增殖è尼龙聚丙烯缝合线 | Ethicon - 强生公司 | 7472H | Prolè5-0 圆锥形切割针，3/8 圆弧，长度 13 mm，75 cm |
| Safe-Lock 管 1.5 mL | Eppendorf | .0030120086 | 安全锁扣管 1.5 mL 无色 1000 支 用于离心 |
| 2 mL Safe-Lock 管 | Eppendorf | .0030120094 | Safe-Lock 离心管 2.0 cc 无色 1000 个装 |
| 5 mL 安全锁扣管 | Eppendorf | .0030119401 | 5.0 cc 无色安全锁扣管，200 支，用于离心 |
| 生理盐水 NaCl 0.9% | Aguettant，里昂，法国 | 600502 | 0.9% 氯化钠溶液 500 mL |
| SDS-PAGE | Sigma-Aldrich | ||
| Surflash IV 导管 16 G | Terumo | SR*FF1651 | |
| Surgicel | Ethicon - 强生公司 | 止血可吸收纱布 | |
| 缝合器械套装 n°12 | Hartmann | 4701762 | 缝合无菌包，内含粘性敷料、剪刀、Adson 镊子、持针器 |
| SYBR Green KIT Light Cycler 480 SYBR Green I Master | 罗氏 | 4707516001 | SYBR Green |
| TBST-0.1% 吐温缓冲液 | Sigma-Aldrich | ||
| Epoc 测试卡 24 张 13 项参数 | 西门子医疗 | ||
| Tissue TEK | Sakura Finetec | 冷冻保存液 | |
| TRIzol试剂 Invitrogen | Thermo Fisher Scientific，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德 | 15596026 | TRIzol试剂 |
参考文献
- Johnston, K. W., Rutherford, R. B., Tilson, M. D., Shah, D. M., Hollier, L., Stanley, J. C. Suggested standards for reporting on arterial aneurysms. Subcommittee on Reporting Standards for Arterial Aneurysms, Ad Hoc Committee on Reporting Standards, Society for Vascular Surgery and North American Chapter,....
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