从废水中增强提取低分子量DNA以全面评估抗菌素耐药性

摘要

本文介绍一种通过提高低分子量细胞外DNA比例来评估环境抗菌素耐药性（AMR）的简便技术。预先使用20%-30%聚乙二醇（PEG）和1.2 M NaCl处理，可同时检测基因组来源及水平转移的AMR基因。该方案无需依赖试剂盒，且具备进一步优化的空间。

摘要

环境监测被认为是后疫情时代评估公共卫生的重要工具。特别是废水，已成为采样环境中病原体负荷的首选来源。来自开放排水沟和社区污水处理厂的废水是病原体和抗菌素耐药性（AMR）基因的储存库，并且经常与人类接触。尽管已有多种追踪水中AMR的方法， 但从成分复杂的样品中以高得率提取高质量DNA仍是一个挑战。为弥补这一问题，通常需要较大的样品体积，从而带来实际操作上的限制。此外，环境DNA常常发生片段化，而AMR的来源（质粒、噬菌体、线性DNA）本身即为低分子量DNA。然而，目前很少有提取方法专注于高效提取线性及低分子量DNA。本文报道了一种利用聚乙二醇（PEG）沉淀特性从小体积废水中高效提取线性DNA的简便方法。本研究提出，通过富集线性DNA的比例，可提高用于宏基因组分析的水样中总体DNA的得率。同时，增加低分子量DNA的回收量，有助于克服当前因侧重于高分子量和细胞内DNA而导致环境AMR被采样不足的问题。该方法在细胞外DNA存在但浓度较低的情况下（例如污水处理厂的出水）尤为适用。此外，该方法还可增强对通过水平基因转移传播的AMR基因片段的环境监测能力。

引言

SARS-CoV-2 及其后续影响凸显了环境监测在监控和预测传染病暴发中的重要性^1,2。尽管病毒性大流行显而易见，但抗菌素耐药性（AMR）的上升常被称为一种隐匿的大流行，是全球范围内首要的公共卫生问题之一^3,4。因此，迫切需要协调一致的策略来理解 AMR 的演化与传播。水体以及废水均可作为病原体和抗菌素耐药性的储存库^5,6,7,8。共用的水源因此成为人类之间疾病传播的重要途径，尤其是在卫生条件差且人口过度密集的低收入和中等收入国家（LMIC）^9,10,11。对水源的检测长期以来被用于评估社区健康状况^12,13,

方案

1. 废水采样

1. 将一个500 mL聚丙烯烧杯浸入开放的排水沟或污水处理厂（STP）储水池中，采集约300 mL废水样品。
2. 将约250 mL样品转移至一个250 mL已灭菌的聚丙烯瓶中。
3. 拧紧瓶盖，并用塑料薄膜密封。将瓶子直立放置于密闭袋中。
4. 将样品置于密闭容器中，直立运输，保持室温。
5. 在进行DNA提取前，将样品于70 °C热风烘箱中加热灭活4小时。

2. 从废水中提取 DNA

1. 待废水样品冷却后，以最大速度涡旋振荡样品，静置使残渣/污泥沉淀。
2. 将27.5 mL废水转移至50 mL离心管中，加入13.5 g PEG-8000（终浓度30%）和3 g NaCl（终浓度1.2 M），充分混匀至完全溶解。
3. 在4 °C下孵育样品过夜（约16–18 h）。
4. 在4 °C下以15,500 × g离心30 min。
5. 弃去上清液。
   注意：30% PEG-8000黏度较高，弃上清时沉淀可能被冲起。应缓慢、小心地倾倒上清，确保沉淀不丢失。步骤2.6至2.23使用土壤DNA提取试剂盒，按照说明书操作并进行了若干修改。
6. 将沉淀溶解于800 µL试剂盒裂解液中，将溶液加入....

结果

建立从废水样本中高效提取DNA的方案
采用一种经改进的已有方案，用于从水样中提取高质量的DNA和RNA¹⁷。样本来源于印度北部德里国家首都辖区（Delhi-NCR）的开放排水沟及污水处理厂。经过聚乙二醇（PEG）和氯化钠（NaCl）预处理后（图1），使用土壤与水体DNA提取试剂盒对样本进行处理。在所有情况下，均观察到一条明显的高分子量条带，可能对应于胞内细菌DNA，以及典型的环境样本背景弥散条带^37,（图2）。

从污水处理厂（STP）出水中难以高效提取DNA
尽管从开放排水沟和污水处理厂进水中获得了较为合理的总DNA产量（

讨论

抗生素耐药性（AMR）是世界卫生组织列出的当今十大健康威胁之一，全球普遍认为环境监测在AMR防控中是一项重要工具。如引言所述，全面记录环境中的AMR需涵盖小分子量、片段化及胞外DNA。本文报道的预处理方案采用高浓度聚乙二醇（PEG）与盐结合（30% PEG和1.2 M NaCl），可在不影响高分子量DNA（主要为基因组DNA和质粒DNA）提取的前提下，富集小分子量DNA的比例。相比之下，以往使用较低浓度PEG进行浓缩或直接采用试剂盒方案（无预处理步骤）的方法因需处理大量样本而操作繁琐。使用较低浓度PEG进行预处理在回收小分子量DNA方面效率低下（此处“小”指小于600 bp的DNA条带）。若预处理过程中不使用PEG，则DNA提取效果差，仅能回收约10%的输入DNA，而使用PEG和NaCl时回收率可达70%图8）。除了添加 PEG 和 NaCl 外，另一个重要步骤是在从试剂盒中提取 DNA 后去除残留的乙醇，以获得可用于下游实验的纯净 DNA。确定洗脱时所需初始加水量非常重要，需确保在 30–50 mL 体积中获得至少约 300 ng 至 5 mg 的总 DNA 量。相比之下，通.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔微型离心机	Eppendorf Centrifuge 5425 R	EP5406000046
无水乙醇（Emsure ACS，ISO，Reag. Ph Eur 分析用无水乙醇）	Supelco	100983-0511
琼脂糖	Invitrogen	16500500
台式冷冻离心机	Eppendorf 离心机 5920 R	EP5948000131
ChemiDoc 成像系统	BioRad	12003153
DNeasy PowerSoil Pro 试剂盒	Qiagen	47014
DNeasy PowerWater Pro 试剂盒	Qiagen	14900-100-NF
dNTP（dNTP混合物，各10 mM，0.2 mL，R0191）	赛默飞世尔科技	R0191
DreamTaq DNA聚合酶，5 U/μLµL + 10x DreamTaq 缓冲液*	赛默飞世尔科技	EP0702
E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder	Invitrogen	10488091
Maxiamp PCR 管 0.2 mL	塔尔逊斯	510051
用于PCR的分子生物学级水	HiMedia	ML065-1.5ML
NanoDrop OneC 微量紫外-可见分光光度计	赛默飞世尔科技	13400519
Parafilm	贝米斯	S37440
PEG-8000	SRL	54866
QIAquick PCR &和凝胶回收试剂盒	Qiagen	28506
Qubit 4 荧光仪（带 WiFi）	赛默飞世尔科技	Q33238
Qubit 检测管	赛默飞世尔科技	Q32856
Qubitt dsDNA 宽范围检测试剂盒	赛默飞世尔科技	Q32853（500次检测）
氯化钠	HiMedia	TC046M-500G
SYBR Safe DNA凝胶染料	Invitrogen	S33102
T100热循环仪	伯乐（BioRad）	1861096
Thermo Cycler（ProFlex 3 x 32孔PCR系统）	应用生物系统公司	4484073
Wizard 基因组DNA纯化试剂盒	Promega	A1125