本文介绍一种通过提高低分子量细胞外DNA比例来评估环境抗菌素耐药性（AMR）的简便技术。预先使用20%-30%聚乙二醇（PEG）和1.2 M NaCl处理，可同时检测基因组来源及水平转移的AMR基因。该方案无需依赖试剂盒，且具备进一步优化的空间。
本文内容
摘要
摘要
环境监测被认为是后疫情时代评估公共卫生的重要工具。特别是废水，已成为采样环境中病原体负荷的首选来源。来自开放排水沟和社区污水处理厂的废水是病原体和抗菌素耐药性（AMR）基因的储存库，并且经常与人类接触。尽管已有多种追踪水中AMR的方法， 但从成分复杂的样品中以高得率提取高质量DNA仍是一个挑战。为弥补这一问题，通常需要较大的样品体积，从而带来实际操作上的限制。此外，环境DNA常常发生片段化，而AMR的来源（质粒、噬菌体、线性DNA）本身即为低分子量DNA。然而，目前很少有提取方法专注于高效提取线性及低分子量DNA。本文报道了一种利用聚乙二醇（PEG）沉淀特性从小体积废水中高效提取线性DNA的简便方法。本研究提出，通过富集线性DNA的比例，可提高用于宏基因组分析的水样中总体DNA的得率。同时，增加低分子量DNA的回收量，有助于克服当前因侧重于高分子量和细胞内DNA而导致环境AMR被采样不足的问题。该方法在细胞外DNA存在但浓度较低的情况下（例如污水处理厂的出水）尤为适用。此外，该方法还可增强对通过水平基因转移传播的AMR基因片段的环境监测能力。
引言
SARS-CoV-2 及其后续影响凸显了环境监测在监控和预测传染病暴发中的重要性1,2。尽管病毒性大流行显而易见，但抗菌素耐药性（AMR）的上升常被称为一种隐匿的大流行，是全球范围内首要的公共卫生问题之一3,4。因此，迫切需要协调一致的策略来理解 AMR 的演化与传播。水体以及废水均可作为病原体和抗菌素耐药性的储存库5,6,7,8。共用的水源因此成为人类之间疾病传播的重要途径，尤其是在卫生条件差且人口过度密集的低收入和中等收入国家（LMIC）9,10,11。对水源的检测长期以来被用于评估社区健康状况12,13,14。最近，城市污水处理厂的废水被证明是临床 COVID 病例的良好先行指标1,2,15,16,17,18。
与特定疾病的监测相比，环境中抗菌素耐药性（AMR）的检测与追踪面临更为复杂的问题。大量使用的抗生素、多样的耐药基因、不同的局部选择压力以及细菌间的水平基因转移，使得准确评估真实的AMR负担十分困难，即使完成评估，也难以将其与临床观察结果相关联19,20,21,22。因此，尽管全球多个组织正在协同开展临床AMR的监测工作3,23,24，环境中的AMR监测仍处于起步阶段，相关进展已在文献19,25,26中进行了综述。
近年来，已有多种用于追踪环境中抗生素耐药性的方法被报道5,27，经审阅见于28,29大多数研究的起点是从具有异质性的环境样本中提取高质量的DNA，这本身就是一个挑战。此外，环境DNA通常因暴露于恶劣环境而发生片段化。长期以来，人们已认识到片段化的胞外DNA是抗菌素耐药基因的重要储存库（详见综述）30,31,32），并具有进入和离开细菌的潜力 通过 水平基因转移。因此，任何旨在测量环境中抗菌素耐药性负担的实验方案都应尽可能有效地采集线性和低分子量DNA。然而令人惊讶的是，目前针对高效提取线性和低分子量DNA的方法开发甚少：本研究旨在填补这一空白。
一种常见且简单的DNA沉淀方法是联合使用聚乙二醇（PEG）和氯化钠（NaCl）等盐类33。PEG是一种大分子拥挤剂，可用于实现DNA片段的大小特异性沉淀34,35。PEG浓度越低，能够有效沉淀的DNA分子量越高。许多研究在环境DNA和RNA提取过程中使用了PEG1,2（详见表117,33,36,37,38,39），或将其用于最终步骤33,36,37，或用于浓缩大量水样以提取病毒颗粒，例如SARS-CoV-215,40。在本研究中发现，先前用于环境DNA提取的PEG浓度（主要依据病毒监测方案确定）无法有效捕获低分子量的线性DNA。因此，这些方法会遗漏短片段DNA的采样，不适合准确评估耐药基因（AMR）含量。本研究利用聚乙二醇和氯化钠的特性，实现了对低分子量线性DNA片段的高效沉淀，获得高得率，未来有望发展为一种经济高效的DNA提取方法。该方法可用于富集复杂自然样品中片段化和低分子量DNA的比例，从而更准确地反映环境中的耐药基因（AMR）状况。经过进一步优化，该技术易于实施且成本低廉，可被地方市政机构及其他政府部门用作监测工具，且仅需极少的技术培训。
方案
1. 废水采样
- 将一个500 mL聚丙烯烧杯浸入开放的排水沟或污水处理厂（STP）储水池中，采集约300 mL废水样品。
- 将约250 mL样品转移至一个250 mL已灭菌的聚丙烯瓶中。
- 拧紧瓶盖，并用塑料薄膜密封。将瓶子直立放置于密闭袋中。
- 将样品置于密闭容器中，直立运输，保持室温。
- 在进行DNA提取前，将样品于70 °C热风烘箱中加热灭活4小时。
2. 从废水中提取 DNA
- 待废水样品冷却后，以最大速度涡旋振荡样品，静置使残渣/污泥沉淀。
- 将27.5 mL废水转移至50 mL离心管中，加入13.5 g PEG-8000（终浓度30%）和3 g NaCl（终浓度1.2 M），充分混匀至完全溶解。
- 在4 °C下孵育样品过夜（约16–18 h）。
- 在4 °C下以15,500 × g离心30 min。
- 弃去上清液。
注意：30% PEG-8000黏度较高，弃上清时沉淀可能被冲起。应缓慢、小心地倾倒上清，确保沉淀不丢失。步骤2.6至2.23使用土壤DNA提取试剂盒，按照说明书操作并进行了若干修改。 - 将沉淀溶解于800 µL试剂盒裂解液中，将溶液加入含混合氧化锆珠的离心管中。
注意：若处理较大体积样品，应合并所需数量离心管中的沉淀。例如，若处理160 mL样品，则有四个含PEG和NaCl的50 mL离心管。将四个离心管在4 °C下以15,500 × g离心30 min后，弃去全部上清。向每管中加入200 µL CD1溶液，重悬沉淀，并将所有沉淀合并至同一珠管中。 - 将珠管水平固定于涡旋振荡器上，以最大速度涡旋20–30 min。
注意：延长涡旋时间可确保样品完全裂解和均质化，从而提高DNA得率。 - 以8,000 × g离心15 s，使珠子沉至管底，去除泡沫，并将上清液完全转移至1.5 mL微量离心管中。此步骤中可能有少量珠子被转移。
- 将上清液在15,000 × g下离心1 min。
- 将上清液转移至洁净的2 mL微量离心管中。上清液中可能仍含有少量悬浮颗粒。
- 加入200 µL沉淀剂溶液，以最大速度涡旋5 s，在4 °C下孵育5 min。
注意： 在4 °C下孵育可提高蛋白质和细胞碎片的沉淀效率，而DNA保留在溶液中。本步骤可暂停最多2 h，对提取DNA的得率和质量无明显影响。 - 在室温（RT）下以15,000 × g离心1 min。避免触碰沉淀，将澄清上清液转移至洁净的2 mL微量离心管中。
- 每700 µL上清液加入600 µL结合缓冲液，以最大速度涡旋5 s。
- 将700 µL裂解液上样至硅胶柱，孵育2 min，然后在15,000 × g下离心1 min。
注意：裂解液在硅胶柱上的孵育可增强DNA与柱的结合，从而提高DNA得率。 - 弃去穿流液，重复步骤2.14，直至所有裂解液均通过离心柱。
- 小心将离心柱放入洁净的2 mL收集管中，确保无穿流液溅至离心柱上。
- 向离心柱中加入500 µL洗涤缓冲液，并在15,000 × g下离心1 min。
- 弃去穿流液，将离心柱放回同一2 mL收集管中。
- 向离心柱中加入500 µL乙醇洗涤缓冲液，在15,000 × g下离心1 min。
- 弃去穿流液，将离心柱放入新的2 mL收集管中。
- 在16,000 × g下离心2 min以去除残留乙醇，将离心柱转移至新的1.5 mL离心管中。
- 向白色滤膜中心加入100 µL预热至55 °C的洗脱缓冲液，孵育5 min。
注意：加热的洗脱缓冲液结合膜上孵育可提高DNA洗脱效率，尤其是高分子量DNA。 - 在15,000 × g下离心1 min，弃去离心柱。
- 向洗脱的DNA中加入10 µL 3 M NaCl（DNA洗脱液体积的1/10）和250 µL预冷的无水乙醇（DNA洗脱液体积的2.5倍）。颠倒混匀，以8,000 × g离心15 s。
- 将DNA-乙醇混合物在-20 °C下孵育至少1 h。
注意：DNA-乙醇混合物的孵育时间可延长至16 h，对提取DNA的得率和质量无明显影响。 - 在4 °C下以19,000 × g离心30 min，通过倾倒弃去上清液。
- 向沉淀中加入500 µL预冷的70%乙醇。
- 在4 °C下以19,000 × g离心15 min，通过倾倒弃去上清液。
- 将离心管倒置并轻敲于纸巾上，通过毛细作用去除残留乙醇。
- 将离心管敞口置于37 °C加热块上5–10 min，直至乙醇完全蒸发，使DNA沉淀彻底干燥。
- 将DNA沉淀重悬于30–50 µL灭菌双蒸水（ddH2O）中，在37 °C下孵育5–10 min。
- 以8,000 × g离心15 s，使DNA沉至管底。
- 在Nanodrop分光光度计中，选择核酸设置下的dsDNA检测程序。
- 使用无绒纸巾和水清洁样品台，用ddH2O进行仪器调零，然后将2 µL DNA样品加至样品台上。
- 测定浓度及吸光度比值（A260/280和A260/230），以评估纯度。
- 将DNA样品于-20 °C保存。
3. 通过沉淀聚合酶链式反应（PCR）扩增的线性DNA以检测不同分子量范围内的DNA回收情况
- 使用大肠杆菌（E. coli）MG155 的基因组 DNA，通过 PCR 扩增基因片段，获得来自以下基因的线性片段混合物：fusA, lacZ, gapA, rpsD, 16S rRNA, marR（引物序列和 PCR 条件见表 2）。
- 使用 PCR 纯化试剂盒纯化 PCR 产物，并将所有 PCR 产物混合在一起。
- 将混合后的扩增产物等体积分装至 1.5 mL 微量离心管中，其中一管标记为“Input DNA”。
- 除标记为“Input DNA”的管外，向其余各管中加入按实验设计所需的 PEG 和 NaCl（9%、20%、30% PEG-8000；0.3 M、1.2 M NaCl），并用溶液补足至终体积 1 mL。
- 在 4 °C 下孵育过夜（约 16–18 小时）。
注意：从本步骤至步骤 3.16 的所有操作中，“Input DNA”样品始终保持未处理状态并存放于冰箱中。 - 将各管样品在台式微量离心机中于 4 °C 下以设定转速（15,000 × g 或 20,000 × g）离心 1 小时。
- 使用移液器从沉淀对侧小心移除 900 µL 上清液。
- 第一次乙醇洗涤：向沉淀中加入 900 µL 预冷的 70% 乙醇，通过轻轻颠倒离心管进行混匀。
- 以与步骤 3.6 相同的转速（15,000 × g 或 20,000 × g）在 4 °C 下离心 30 分钟。
- 通过倾倒法去除上清液。
- 第二次乙醇洗涤：向沉淀中加入 500 µL 预冷的 70% 乙醇。
- 以与步骤 3.6 相同的转速（15,000 × g 或 20,000 × g）在 4 °C 下离心 30 分钟，然后通过倾倒法弃去上清液。
- 将离心管倒置并轻敲于纸巾上，利用毛细作用去除残留乙醇。
- 将离心管敞口置于 37 °C 加热块上干燥 5–10 分钟，直至乙醇完全蒸发，确保 DNA 沉淀彻底干燥。
- 用 20 µL 经高压灭菌的双蒸水重悬沉淀。
- 使用 Nanodrop 分光光度计或荧光计测定不同条件下沉淀的 DNA 及“Input DNA”的浓度。
- 将沉淀的 DNA 加样至 1% 琼脂糖凝胶，进行 DNA 可视化分析。
结果
建立从废水样本中高效提取DNA的方案
采用一种经改进的已有方案，用于从水样中提取高质量的DNA和RNA17。样本来源于印度北部德里国家首都辖区（Delhi-NCR）的开放排水沟及污水处理厂。经过聚乙二醇（PEG）和氯化钠（NaCl）预处理后（图1），使用土壤与水体DNA提取试剂盒对样本进行处理。在所有情况下，均观察到一条明显的高分子量条带，可能对应于胞内细菌DNA，以及典型的环境样本背景弥散条带37,（图2）。
从污水处理厂（STP）出水中难以高效提取DNA
尽管从开放排水沟和污水处理厂进水中获得了较为合理的总DNA产量（表3），但无法从最终处理后的出水中提取到任何DNA；此前的研究也报道了产量过低的问题41（图3）。经过包括废水氯化处理、在某些情况下还包括紫外线（UV）和超滤处理在内的后续处理后42，微生物负荷预期已显著降低，任何残留的DNA（包括游离DNA和片段化DNA）也会被稀释。样品浓缩和核酸沉淀过程中最初使用的聚乙二醇（PEG）浓度较低，可能导致低分子量DNA未能有效沉淀。换句话说，片段化的DNA可能在初始浓缩步骤中即已丢失。
PEG 和 NaCl 浓度的增加会导致低分子量 DNA 的沉淀
为了测试提高 PEG 浓度是否有助于富集低分子量 DNA，实验制备了一组不同长度 PCR 片段的实验室标准品，从而获得一系列线性 DNA 片段（图 4）。该标准品接受了四种不同的沉淀处理条件——9% PEG-8000 + 0.3 M NaCl（原始组合）、9% PEG-8000 + 1.2 M NaCl（仅提高盐浓度）、30% PEG-8000 + 0.3 M NaCl（仅提高 PEG 浓度）以及 30% PEG-8000 + 1.2 M NaCl（同时提高盐和 PEG 浓度）。这些条件的选择依据是当前用于 SARS-CoV-2 监测的标准方案17，以及一项关于环境样品 DNA 提取模块化方法研究中报道的条件33。根据不同离心速度对 DNA 沉淀效果的影响43，实验采用了两种不同的离心速度——15,000 × g 和 20,000 × g。当 PEG 和 NaCl 浓度分别提高至 30% 和 1.2 M 时，DNA 总回收率提高了约 70%，并且小至 150 个碱基对（bp）的 DNA 片段也能有效沉淀（图 5）。离心速度的差异对回收产量影响不大（图 6A），这可能是由于使用了较长的离心时间所致。由于原始 PEG/NaCl 组合的总 DNA 回收率较低，可能存在低分子量条带，但其浓度低于可视化检测限。为验证这一点，实验增加了用于沉淀的输入 DNA 量，并将每种处理对应的过量 DNA（1.5 mg）上样至琼脂糖凝胶以进行可视化分析。只有 30% PEG 处理组显示出良好的最低分子量 DNA（即 150 bp 条带）回收效果（图 6B）。
环状 DNA（细菌基因组 DNA 和质粒 DNA）的沉淀并不遵循相同的规律
采用不同浓度的 PEG 和 NaCl 对 E. coli MG155 基因组 DNA 和质粒（pRSV，约 4 kb）进行沉淀实验。与线性 DNA 不同，提高 PEG 和 NaCl 浓度并未产生显著影响（图 7），表明环状且高分子量的 DNA（通常为细胞内 DNA）的得率不受 PEG 浓度升高的影响。这与早期关于蛋白质沉淀的研究结果形成对比44，在那些研究中，蛋白质的溶解度随 PEG 浓度升高而急剧下降。鉴于 PEG 具有分子拥挤效应，推测大分子可用于相互作用的表面积在其作为沉淀剂的有效性中起着重要作用。对于线性 DNA，随着分子尺寸增大，可用于相互作用的表面积也随之增大的假设是合理的。而对于环状 DNA，可能在较低的 PEG 浓度下分子表面已接近饱和，进一步提高浓度可能无法增加有效的相互作用表面积。
在废水DNA提取过程中，若省略PEG与NaCl预处理沉淀步骤，则DNA得率较低
为验证预处理废水是否对DNA提取至关重要，取20 mL经热灭活（70 °C，4 h）的废水，加入10 mg预先制备的线性标准品，并在4 °C过夜孵育：(a) 不添加PEG + NaCl；(b) 添加9% PEG + 0.3 M NaCl（原始组合）；(c) 添加20% PEG + 1.2 M NaCl（提高PEG与盐浓度）。随后按照实验方案，使用土壤DNA提取试剂盒对样品进行处理。结果表明，与未进行预处理的样品相比，经9% PEG + 0.3 M NaCl预处理后，提取的DNA得率提高了60%（图8），说明PEG与NaCl的预处理沉淀步骤对于从废水中获得高得率DNA至关重要。值得注意的是，当使用较高浓度的PEG和盐进行沉淀时，总体DNA得率（包括高分子量基因组DNA（gDNA））有所降低，但低分子量DNA的比例相对富集（图8）。提高PEG和盐浓度导致总体得率下降，可能是由于PEG具有高度黏性，导致在去除上清液时DNA沉淀物损失。这一结果进一步支持所提出的分步DNA提取方法（图9）：首先使用低浓度PEG和NaCl沉淀提取高分子量DNA，然后对剩余上清液再进行一轮高浓度PEG和NaCl的预处理，以高效回收在第一轮沉淀中未被提取的低分子量DNA。
图1：废水样品的预处理。 从样品采集到DNA提取的工作流程示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：从废水样本中提取DNA的典型凝胶图谱。 从不同位点采集的50–100 mL废水（如图所示）在70 °C孵育4小时以进行热灭活。随后加入9% PEG和0.3 M NaCl，在4 °C过夜孵育，然后使用土壤或水试剂盒提取DNA。将约150 ng总DNA与1千碱基对（kb）DNA标记一同上样至1%琼脂糖凝胶，并进行电泳（90 V，30分钟）。使用SYBR SAFE染料在紫外（UV）光下观察DNA。右侧表格详细列出了每条泳道对应的样本来源、处理的废水体积以及用于DNA提取的试剂盒。（STP：污水处理厂；UVR：紫外辐射） 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：污水处理厂出水样品的总DNA得率较低。 分别采集40 mL污水处理厂进水和出水废水样品，于70 °C孵育4小时以进行热灭活。随后加入9% PEG和0.3 M NaCl，在4 °C下过夜孵育，再使用土壤DNA提取试剂盒、水样DNA提取试剂盒或细菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。将约150 ng提取的总DNA与1 kb DNA标准品一同上样至1%琼脂糖凝胶，进行电泳（90 V，30分钟）。使用SYBR SAFE染料在紫外（UV）光下观察DNA条带。出水样品提取的DNA浓度低于1 ng/mL废水，因此无法观察到可见条带。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：制备线性 DNA 分子量标准品以检测低分子量 DNA 沉淀效率。 使用大肠杆菌（E. coli，菌株 MG1655）基因组 DNA 作为模板，按照表 2中所述引物和反应条件，通过 PCR 扩增获得五种不同大小的 DNA 片段。将使用 PCR 纯化试剂盒纯化的 DNA（约 1 µg）与 1 kb DNA 标准 Marker 一同上样至 1% 琼脂糖凝胶，进行电泳（90 V，40 分钟）。使用 SYBR SAFE 染料在紫外（UV）光下观察 DNA。泳道根据扩增片段所对应的基因名称及预期扩增片段大小进行标注。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：仅在最高浓度（30%）PEG条件下，低分子量DNA才能被高效回收。 来自先前制备的大小标准品的输入DNA（3.34 µg）按照图中所示的不同PEG和NaCl组合处理，并根据实验方案详细步骤进行提取。离心速度为15,000 × g。对于Input（第3泳道）和1.2 M NaCl + 30% PEG（第7泳道），上样量为0.8 µg DNA。其余样品由于总产量较低，将16 µL提取产物中的全部DNA上样，并在1%琼脂糖凝胶中加入1 kb DNA标准片段作为大小标记，进行电泳（80 V，45分钟）。使用SYBR SAFE染料在紫外（UV）光下观察DNA。白色方框标示出150 bp的最弱条带。请点击此处查看该图的放大版本。
图 6：低分子量 DNA 的回收由高 PEG 浓度决定，而非高盐浓度。（A）使用图中所示的不同 PEG 和 NaCl 组合处理来自大小标准品的输入 DNA（14 µg），并按照方案中所述采用乙醇沉淀法进行提取。离心速度如图所示，分别为 15,000 × g 和 20,000 × g。将全部输入 DNA 和提取后的 DNA 连同 1 kb DNA 标准参照物一起上样至 1% 琼脂糖凝胶，进行电泳（90 V，30 分钟）。使用 SYBR SAFE 染料在紫外光（UV）下观察 DNA。（B）使用图中所示的不同 PEG 和 NaCl 组合处理先前制备的大小标准品输入 DNA（15.67 µg），并按照方案中所述方法进行提取。所用离心速度为 15,000 × g。将提取后的 DNA（1.5 µg）上样至各泳道，同时将 1 kb DNA 标准参照物作为大小标记上样至 1% 琼脂糖凝胶，并进行电泳（80 V，45 分钟）。使用 SYBR SAFE 染料在紫外光（UV）下观察 DNA。白色框标示出 150 bp 的最弱条带。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：提高PEG和NaCl浓度对基因组DNA和质粒DNA的回收率无显著影响。 将输入DNA（9 µg；含4.5 µg质粒DNA和4.5 µg基因组DNA）按照图中所示的不同PEG与NaCl组合进行处理，并依照本方案详细步骤进行提取。离心速度为15,000 × g。将全部输入DNA、提取后的DNA以及1 kb DNA ladder上样至1%琼脂糖凝胶，进行电泳（90 V，45 min）。使用SYBR SAFE染料在紫外（UV）光下观察DNA条带。白色框标示基因组DNA和质粒DNA。请点击此处查看该图的放大版本。
图8：聚乙二醇（PEG）和氯化钠（NaCl）预处理沉淀对从废水中高产率提取DNA至关重要。将20 mL经热灭活（70 °C，4 h）的废水加入10 mg预先制备的线性标准品，并在4 °C下过夜孵育，孵育条件分别为无PEG和NaCl，或如图所示的不同浓度的PEG和NaCl。随后使用土壤DNA提取试剂盒进行DNA提取。上样时，用于加标的输入DNA（4 µg，第1泳道）以及经9% PEG + 0.3 M NaCl预处理步骤提取的DNA（4 µg，第3泳道）分别上样至1%琼脂糖凝胶。对于其余条件，由于提取产量较低，将全部提取的DNA上样至凝胶。同时上样1 kb DNA标记物作为大小参照。凝胶在70 V电压下电泳2小时。使用SYBR SAFE染料在紫外（UV）光下观察DNA条带。请点击此处查看该图的放大版本。
图9：从废水中提取高分子量和低分子量DNA的分步方法示意图。流程图展示了一种从废水中提取DNA的两步法，首先使用低浓度PEG和NaCl进行预处理。第一步所得上清液再经第二轮预处理沉淀，提高PEG和NaCl浓度，从而有效从废水中同时提取高分子量和低分子量DNA。请点击此处查看该图的放大版本。
表1. 聚乙二醇（PEG）和氯化钠（NaCl）在从环境样本中提取DNA的研究中的先前应用。 请点击此处下载该表格。
表2. 标准品制备所用引物序列及PCR条件。 请点击此处下载该表格。
表3. 2023年连续两个月从废水样本中获得的DNA产量和质量。 请点击此处下载该表格。
讨论
抗生素耐药性（AMR）是世界卫生组织列出的当今十大健康威胁之一，全球普遍认为环境监测在AMR防控中是一项重要工具。如引言所述，全面记录环境中的AMR需涵盖小分子量、片段化及胞外DNA。本文报道的预处理方案采用高浓度聚乙二醇（PEG）与盐结合（30% PEG和1.2 M NaCl），可在不影响高分子量DNA（主要为基因组DNA和质粒DNA）提取的前提下，富集小分子量DNA的比例。相比之下，以往使用较低浓度PEG进行浓缩或直接采用试剂盒方案（无预处理步骤）的方法因需处理大量样本而操作繁琐。使用较低浓度PEG进行预处理在回收小分子量DNA方面效率低下（此处“小”指小于600 bp的DNA条带）。若预处理过程中不使用PEG，则DNA提取效果差，仅能回收约10%的输入DNA，而使用PEG和NaCl时回收率可达70%图8）。除了添加 PEG 和 NaCl 外，另一个重要步骤是在从试剂盒中提取 DNA 后去除残留的乙醇，以获得可用于下游实验的纯净 DNA。确定洗脱时所需初始加水量非常重要，需确保在 30–50 mL 体积中获得至少约 300 ng 至 5 mg 的总 DNA 量。相比之下，通常从废水中提取 DNA 时处理的水样体积为 1 L 或更多27,41，研究发现，采用此处提出的预处理步骤，仅需27.5–40 mL样品即可获得适用于下游处理的高质量DNA。废水中还含有颗粒物和有机质，其中可能吸附有细菌细胞和游离DNA。因此，细胞和DNA的解吸附过程伴随细胞裂解，是提高DNA得率的重要步骤。如前所述，高浓度聚乙二醇（PEG）会使样品黏稠，从而阻碍DNA提取过程中的裂解和解吸附步骤。为避免这一问题，已提出一种分步DNA提取方法，流程图如下所示（图9）。该方法将有助于提取细胞内高分子量DNA（图7以及细胞外低分子量的片段化和环状DNA。
该方案在成本方面的一个当前局限性在于，富集后的低分子量DNA仍需通过试剂盒进行后续处理以提高质量。这一局限性可能通过其他DNA纯化方法（如苯酚-氯仿抽提法）加以规避。另一个实际局限性在于高浓度聚乙二醇（PEG）的处理，因为溶液黏度过高可能导致沉淀丢失。目前采用的方法是先用PEG和NaCl进行预处理，再结合现有试剂盒方案的改良版本，即最终DNA纯化步骤仍依赖试剂盒。一种无需试剂盒的DNA纯化方法正在优化中，该方法可获得较高的DNA得率，但纯度较低（本文未报告），旨在提升提取DNA的整体质量。由于PEG溶液具有较高黏性，应力求确定一个最佳PEG浓度，既能获得完整范围的DNA片段大小，又便于操作。将PEG浓度降低至20%（图6B）所得到的提取效率介于低浓度（9%）和高浓度（30%）PEG之间；这一结果值得在后续研究中进一步探索。
聚乙二醇（PEG）在从环境样品中提取DNA的不同步骤中被常规使用。然而，在耐药性监测（AMR surveillance）背景下，PEG在DNA提取中的应用尚未实现标准化。废水监测涉及在多种不同生境中检测抗菌耐药性，包括污水处理厂（进水和出水）以及开放和封闭的排水管道8,27。虽然进水中的耐药性信息可提供社区中耐药性传播的关键数据，但出水中耐药基因的存在同样重要，可用于评估甚至预测耐药暴发的可能性。由于处理过程中大多数细胞已被杀灭，出水样品通常微生物载量较低，导致细胞DNA得率极低。然而，出水中含有游离的细胞外DNA，包括高分子量的基因组DNA以及低分子量的质粒、噬粒和片段化DNA。存在于低分子量DNA（包括片段化DNA以及质粒/噬粒）中的耐药基因可能转移至出水中残存的活细胞，从而导致耐药性的传播30,41,45。因此，检测废水中低分子量的细胞外DNA至关重要。目前在评估耐药性时用于废水DNA提取的其他方法通常无法确保对低分子量DNA进行初始富集。这种废水DNA提取方法可用于提供关于环境全面耐药组（resistome）的信息。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢洛克菲勒基金会（洛克菲勒基金会资助编号 2021 HTH 018）为印度 APSI 团队（病原体监测创新联盟 https://data.ccmb.res.in/apsi/team/）提供的资金支持。同时，我们感谢 Axis 银行为本研究提供的财政援助，以及阿育王大学特里维迪生物科学学院提供的设备和其他支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔微型离心机 | Eppendorf Centrifuge 5425 R | EP5406000046 | |
| 无水乙醇（Emsure ACS，ISO，Reag. Ph Eur 分析用无水乙醇） | Supelco | 100983-0511 | |
| 琼脂糖 | Invitrogen | 16500500 | |
| 台式冷冻离心机 | Eppendorf 离心机 5920 R | EP5948000131 | |
| ChemiDoc 成像系统 | BioRad | 12003153 | |
| DNeasy PowerSoil Pro 试剂盒 | Qiagen | 47014 | |
| DNeasy PowerWater Pro 试剂盒 | Qiagen | 14900-100-NF | |
| dNTP（dNTP混合物，各10 mM，0.2 mL，R0191） | 赛默飞世尔科技 | R0191 | |
| DreamTaq DNA聚合酶，5 U/μLµL + 10x DreamTaq 缓冲液* | 赛默飞世尔科技 | EP0702 | |
| E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder | Invitrogen | 10488091 | |
| Maxiamp PCR 管 0.2 mL | 塔尔逊斯 | 510051 | |
| 用于PCR的分子生物学级水 | HiMedia | ML065-1.5ML | |
| NanoDrop OneC 微量紫外-可见分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | 13400519 | |
| Parafilm | 贝米斯 | S37440 | |
| PEG-8000 | SRL | 54866 | |
| QIAquick PCR &和凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28506 | |
| Qubit 4 荧光仪（带 WiFi） | 赛默飞世尔科技 | Q33238 | |
| Qubit 检测管 | 赛默飞世尔科技 | Q32856 | |
| Qubitt dsDNA 宽范围检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | Q32853（500次检测） | |
| 氯化钠 | HiMedia | TC046M-500G | |
| SYBR Safe DNA凝胶染料 | Invitrogen | S33102 | |
| T100热循环仪 | 伯乐（BioRad） | 1861096 | |
| Thermo Cycler（ProFlex 3 x 32孔PCR系统） | 应用生物系统公司 | 4484073 | |
| Wizard 基因组DNA纯化试剂盒 | Promega | A1125 |
参考文献
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