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方法文章

从废水中增强提取低分子量DNA以全面评估抗菌素耐药性

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DOI：

10.3791/66899

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2024年7月19日

 ,  ,  ,  , 
1Ashoka University

本文内容

摘要

本文介绍一种通过提高低分子量细胞外DNA比例来评估环境抗菌素耐药性（AMR）的简便技术。预先使用20%-30%聚乙二醇（PEG）和1.2 M NaCl处理，可同时检测基因组来源及水平转移的AMR基因。该方案无需依赖试剂盒，且具备进一步优化的空间。

摘要

环境监测被认为是后疫情时代评估公共卫生的重要工具。特别是废水，已成为采样环境中病原体负荷的首选来源。来自开放排水沟和社区污水处理厂的废水是病原体和抗菌素耐药性（AMR）基因的储存库，并且经常与人类接触。尽管已有多种追踪水中AMR的方法， 但从成分复杂的样品中以高得率提取高质量DNA仍是一个挑战。为弥补这一问题，通常需要较大的样品体积，从而带来实际操作上的限制。此外，环境DNA常常发生片段化，而AMR的来源（质粒、噬菌体、线性DNA）本身即为低分子量DNA。然而，目前很少有提取方法专注于高效提取线性及低分子量DNA。本文报道了一种利用聚乙二醇（PEG）沉淀特性从小体积废水中高效提取线性DNA的简便方法。本研究提出，通过富集线性DNA的比例，可提高用于宏基因组分析的水样中总体DNA的得率。同时，增加低分子量DNA的回收量，有助于克服当前因侧重于高分子量和细胞内DNA而导致环境AMR被采样不足的问题。该方法在细胞外DNA存在但浓度较低的情况下（例如污水处理厂的出水）尤为适用。此外，该方法还可增强对通过水平基因转移传播的AMR基因片段的环境监测能力。

引言

SARS-CoV-2 及其后续影响凸显了环境监测在监控和预测传染病暴发中的重要性1,2。尽管病毒性大流行显而易见，但抗菌素耐药性（AMR）的上升常被称为一种隐匿的大流行，是全球范围内首要的公共卫生问题之一3,4。因此，迫切需要协调一致的策略来理解 AMR 的演化与传播。水体以及废水均可作为病原体和抗菌素耐药性的储存库5,6,7,8。共用的水源因此成为人类之间疾病传播的重要途径，尤其是在卫生条件差且人口过度密集的低收入和中等收入国家（LMIC）9,10,11。对水源的检测长期以来被用于评估社区健康状况12,13,14。最近，城市污水处理厂的废水被证明是临床 COVID 病例的良好先行指标1,2,15,16,17,18。

与特定疾病的监测相比，环境中抗菌素耐药性（AMR）的检测与追踪面临更为复杂的问题。大量使用的抗生素、多样的耐药基因、不同的局部选择压力以及细菌间的水平基因转移，使得准确评估真实的AMR负担十分困难，即使完成评估，也难以将其与临床观察结果相关联19,20,21,22。因此，尽管全球多个组织正在协同开展临床AMR的监测工作3,23,24，环境中的AMR监测仍处于起步阶段，相关进展已在文献19,25,26中进行了综述。

近年来，已有多种用于追踪环境中抗生素耐药性的方法被报道5,27，经审阅见于28,29大多数研究的起点是从具有异质性的环境样本中提取高质量的DNA，这本身就是一个挑战。此外，环境DNA通常因暴露于恶劣环境而发生片段化。长期以来，人们已认识到片段化的胞外DNA是抗菌素耐药基因的重要储存库（详见综述）30,31,32），并具有进入和离开细菌的潜力 通过 水平基因转移。因此，任何旨在测量环境中抗菌素耐药性负担的实验方案都应尽可能有效地采集线性和低分子量DNA。然而令人惊讶的是，目前针对高效提取线性和低分子量DNA的方法开发甚少：本研究旨在填补这一空白。

一种常见且简单的DNA沉淀方法是联合使用聚乙二醇（PEG）和氯化钠（NaCl）等盐类33。PEG是一种大分子拥挤剂，可用于实现DNA片段的大小特异性沉淀34,35。PEG浓度越低，能够有效沉淀的DNA分子量越高。许多研究在环境DNA和RNA提取过程中使用了PEG1,2（详见表117,33,36,37,38,39），或将其用于最终步骤33,36,37，或用于浓缩大量水样以提取病毒颗粒，例如SARS-CoV-215,40。在本研究中发现，先前用于环境DNA提取的PEG浓度（主要依据病毒监测方案确定）无法有效捕获低分子量的线性DNA。因此，这些方法会遗漏短片段DNA的采样，不适合准确评估耐药基因（AMR）含量。本研究利用聚乙二醇和氯化钠的特性，实现了对低分子量线性DNA片段的高效沉淀，获得高得率，未来有望发展为一种经济高效的DNA提取方法。该方法可用于富集复杂自然样品中片段化和低分子量DNA的比例，从而更准确地反映环境中的耐药基因（AMR）状况。经过进一步优化，该技术易于实施且成本低廉，可被地方市政机构及其他政府部门用作监测工具，且仅需极少的技术培训。

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方案

1. 废水采样

  1. 将一个500 mL聚丙烯烧杯浸入开放的排水沟或污水处理厂（STP）储水池中，采集约300 mL废水样品。
  2. 将约250 mL样品转移至一个250 mL已灭菌的聚丙烯瓶中。
  3. 拧紧瓶盖，并用塑料薄膜密封。将瓶子直立放置于密闭袋中。
  4. 将样品置于密闭容器中，直立运输，保持室温。
  5. 在进行DNA提取前，将样品于70 °C热风烘箱中加热灭活4小时。

2. 从废水中提取 DNA

  1. 待废水样品冷却后，以最大速度涡旋振荡样品，静置使残渣/污泥沉淀。
  2. 将27.5 mL废水转移至50 mL离心管中，加入13.5 g PEG-8000（终浓度30%）和3 g NaCl（终浓度1.2 M），充分混匀至完全溶解。
  3. 在4 °C下孵育样品过夜（约16–18 h）。
  4. 在4 °C下以15,500 × g离心30 min。
  5. 弃去上清液。
    注意：30% PEG-8000黏度较高，弃上清时沉淀可能被冲起。应缓慢、小心地倾倒上清，确保沉淀不丢失。步骤2.6至2.23使用土壤DNA提取试剂盒，按照说明书操作并进行了若干修改。
  6. 将沉淀溶解于800 µL试剂盒裂解液中，将溶液加入含混合氧化锆珠的离心管中。
    注意：若处理较大体积样品，应合并所需数量离心管中的沉淀。例如，若处理160 mL样品，则有四个含PEG和NaCl的50 mL离心管。将四个离心管在4 °C下以15,500 × g离心30 min后，弃去全部上清。向每管中加入200 µL CD1溶液，重悬沉淀，并将所有沉淀合并至同一珠管中。
  7. 将珠管水平固定于涡旋振荡器上，以最大速度涡旋20–30 min。
    注意：延长涡旋时间可确保样品完全裂解和均质化，从而提高DNA得率。
  8. 以8,000 × g离心15 s，使珠子沉至管底，去除泡沫，并将上清液完全转移至1.5 mL微量离心管中。此步骤中可能有少量珠子被转移。
  9. 将上清液在15,000 × g下离心1 min。
  10. 将上清液转移至洁净的2 mL微量离心管中。上清液中可能仍含有少量悬浮颗粒。
  11. 加入200 µL沉淀剂溶液，以最大速度涡旋5 s，在4 °C下孵育5 min。
    注意： 在4 °C下孵育可提高蛋白质和细胞碎片的沉淀效率，而DNA保留在溶液中。本步骤可暂停最多2 h，对提取DNA的得率和质量无明显影响。
  12. 在室温（RT）下以15,000 × g离心1 min。避免触碰沉淀，将澄清上清液转移至洁净的2 mL微量离心管中。
  13. 每700 µL上清液加入600 µL结合缓冲液，以最大速度涡旋5 s。
  14. 将700 µL裂解液上样至硅胶柱，孵育2 min，然后在15,000 × g下离心1 min。
    注意：裂解液在硅胶柱上的孵育可增强DNA与柱的结合，从而提高DNA得率。
  15. 弃去穿流液，重复步骤2.14，直至所有裂解液均通过离心柱。
  16. 小心将离心柱放入洁净的2 mL收集管中，确保无穿流液溅至离心柱上。
  17. 向离心柱中加入500 µL洗涤缓冲液，并在15,000 × g下离心1 min。
  18. 弃去穿流液，将离心柱放回同一2 mL收集管中。
  19. 向离心柱中加入500 µL乙醇洗涤缓冲液，在15,000 × g下离心1 min。
  20. 弃去穿流液，将离心柱放入新的2 mL收集管中。
  21. 在16,000 × g下离心2 min以去除残留乙醇，将离心柱转移至新的1.5 mL离心管中。
  22. 向白色滤膜中心加入100 µL预热至55 °C的洗脱缓冲液，孵育5 min。
    注意：加热的洗脱缓冲液结合膜上孵育可提高DNA洗脱效率，尤其是高分子量DNA。
  23. 在15,000 × g下离心1 min，弃去离心柱。
  24. 向洗脱的DNA中加入10 µL 3 M NaCl（DNA洗脱液体积的1/10）和250 µL预冷的无水乙醇（DNA洗脱液体积的2.5倍）。颠倒混匀，以8,000 × g离心15 s。
  25. 将DNA-乙醇混合物在-20 °C下孵育至少1 h。
    注意：DNA-乙醇混合物的孵育时间可延长至16 h，对提取DNA的得率和质量无明显影响。
  26. 在4 °C下以19,000 × g离心30 min，通过倾倒弃去上清液。
  27. 向沉淀中加入500 µL预冷的70%乙醇。
  28. 在4 °C下以19,000 × g离心15 min，通过倾倒弃去上清液。
  29. 将离心管倒置并轻敲于纸巾上，通过毛细作用去除残留乙醇。
  30. 将离心管敞口置于37 °C加热块上5–10 min，直至乙醇完全蒸发，使DNA沉淀彻底干燥。
  31. 将DNA沉淀重悬于30–50 µL灭菌双蒸水（ddH2O）中，在37 °C下孵育5–10 min。
  32. 以8,000 × g离心15 s，使DNA沉至管底。
  33. 在Nanodrop分光光度计中，选择核酸设置下的dsDNA检测程序。
    1. 使用无绒纸巾和水清洁样品台，用ddH2O进行仪器调零，然后将2 µL DNA样品加至样品台上。
    2. 测定浓度及吸光度比值（A260/280和A260/230），以评估纯度。
  34. 将DNA样品于-20 °C保存。

3. 通过沉淀聚合酶链式反应（PCR）扩增的线性DNA以检测不同分子量范围内的DNA回收情况

  1. 使用大肠杆菌（E. coli）MG155 的基因组 DNA，通过 PCR 扩增基因片段，获得来自以下基因的线性片段混合物：fusA, lacZ, gapA, rpsD, 16S rRNA, marR（引物序列和 PCR 条件见表 2）。
  2. 使用 PCR 纯化试剂盒纯化 PCR 产物，并将所有 PCR 产物混合在一起。
  3. 将混合后的扩增产物等体积分装至 1.5 mL 微量离心管中，其中一管标记为“Input DNA”。
  4. 除标记为“Input DNA”的管外，向其余各管中加入按实验设计所需的 PEG 和 NaCl（9%、20%、30% PEG-8000；0.3 M、1.2 M NaCl），并用溶液补足至终体积 1 mL。
  5. 在 4 °C 下孵育过夜（约 16–18 小时）。
    注意：从本步骤至步骤 3.16 的所有操作中，“Input DNA”样品始终保持未处理状态并存放于冰箱中。
  6. 将各管样品在台式微量离心机中于 4 °C 下以设定转速（15,000 × g 或 20,000 × g）离心 1 小时。
  7. 使用移液器从沉淀对侧小心移除 900 µL 上清液。
  8. 第一次乙醇洗涤：向沉淀中加入 900 µL 预冷的 70% 乙醇，通过轻轻颠倒离心管进行混匀。
  9. 以与步骤 3.6 相同的转速（15,000 × g 或 20,000 × g）在 4 °C 下离心 30 分钟。
  10. 通过倾倒法去除上清液。
  11. 第二次乙醇洗涤：向沉淀中加入 500 µL 预冷的 70% 乙醇。
  12. 以与步骤 3.6 相同的转速（15,000 × g 或 20,000 × g）在 4 °C 下离心 30 分钟，然后通过倾倒法弃去上清液。
  13. 将离心管倒置并轻敲于纸巾上，利用毛细作用去除残留乙醇。
  14. 将离心管敞口置于 37 °C 加热块上干燥 5–10 分钟，直至乙醇完全蒸发，确保 DNA 沉淀彻底干燥。
  15. 用 20 µL 经高压灭菌的双蒸水重悬沉淀。
  16. 使用 Nanodrop 分光光度计或荧光计测定不同条件下沉淀的 DNA 及“Input DNA”的浓度。
  17. 将沉淀的 DNA 加样至 1% 琼脂糖凝胶，进行 DNA 可视化分析。

  

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结果

建立从废水样本中高效提取DNA的方案
采用一种经改进的已有方案，用于从水样中提取高质量的DNA和RNA17。样本来源于印度北部德里国家首都辖区（Delhi-NCR）的开放排水沟及污水处理厂。经过聚乙二醇（PEG）和氯化钠（NaCl）预处理后（图1），使用土壤与水体DNA提取试剂盒对样本进行处理。在所有情况下，均观察到一条明显的高分子量条带，可能对应于胞内细菌DNA，以及典型的环境样本背景弥散条带37,（图2）。

从污水处理厂（STP）出水中难以高效提取DNA
尽管从开放排水沟和污水处理厂进水中获得了较为合理的总DNA产量（

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讨论

抗生素耐药性（AMR）是世界卫生组织列出的当今十大健康威胁之一，全球普遍认为环境监测在AMR防控中是一项重要工具。如引言所述，全面记录环境中的AMR需涵盖小分子量、片段化及胞外DNA。本文报道的预处理方案采用高浓度聚乙二醇（PEG）与盐结合（30% PEG和1.2 M NaCl），可在不影响高分子量DNA（主要为基因组DNA和质粒DNA）提取的前提下，富集小分子量DNA的比例。相比之下，以往使用较低浓度PEG进行浓缩或直接采用试剂盒方案（无预处理步骤）的方法因需处理大量样本而操作繁琐。使用较低浓度PEG进行预处理在回收小分子量DNA方面效率低下（此处“小”指小于600 bp的DNA条带）。若预处理过程中不使用PEG，则DNA提取效果差，仅能回收约10%的输入DNA，而使用PEG和NaCl时回收率可达70%图8）。除了添加 PEG 和 NaCl 外，另一个重要步骤是在从试剂盒中提取 DNA 后去除残留的乙醇，以获得可用于下游实验的纯净 DNA。确定洗脱时所需初始加水量非常重要，需确保在 30–50 mL 体积中获得至少约 300 ng 至 5 mg 的总 DNA 量。相比之下，通...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢洛克菲勒基金会（洛克菲勒基金会资助编号 2021 HTH 018）为印度 APSI 团队（病原体监测创新联盟 https://data.ccmb.res.in/apsi/team/）提供的资金支持。同时，我们感谢 Axis 银行为本研究提供的财政援助，以及阿育王大学特里维迪生物科学学院提供的设备和其他支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
24孔微型离心机Eppendorf Centrifuge 5425 REP5406000046
无水乙醇（Emsure ACS，ISO，Reag. Ph Eur 分析用无水乙醇）Supelco100983-0511
琼脂糖Invitrogen16500500
台式冷冻离心机Eppendorf 离心机 5920 REP5948000131
ChemiDoc 成像系统BioRad12003153
DNeasy PowerSoil Pro 试剂盒Qiagen47014
DNeasy PowerWater Pro 试剂盒Qiagen14900-100-NF
dNTP（dNTP混合物，各10 mM，0.2 mL，R0191）赛默飞世尔科技R0191
DreamTaq DNA聚合酶，5 U/μLµL + 10x DreamTaq 缓冲液*赛默飞世尔科技EP0702
E-Gel 1 Kb Plus Express DNA LadderInvitrogen10488091
Maxiamp PCR 管 0.2 mL塔尔逊斯510051
用于PCR的分子生物学级水HiMediaML065-1.5ML
NanoDrop OneC 微量紫外-可见分光光度计赛默飞世尔科技13400519
Parafilm贝米斯S37440
PEG-8000SRL54866
QIAquick PCR &和凝胶回收试剂盒Qiagen28506
Qubit 4 荧光仪（带 WiFi）赛默飞世尔科技Q33238
Qubit 检测管赛默飞世尔科技Q32856
Qubitt dsDNA 宽范围检测试剂盒赛默飞世尔科技Q32853（500次检测）
氯化钠HiMediaTC046M-500G
SYBR Safe DNA凝胶染料InvitrogenS33102
T100热循环仪伯乐（BioRad）1861096
Thermo Cycler（ProFlex 3 x 32孔PCR系统）应用生物系统公司4484073
Wizard 基因组DNA纯化试剂盒PromegaA1125

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