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大鼠咀嚼肌在容积性肌肉缺损失伤（VML）手术构建后的体内功能评估

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DOI：

10.3791/66902

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2024年11月15日

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Virginia, 2Myologica LLC, 3Department of Orthopedic Surgery, University of Virginia

本文内容

摘要

体积性肌肉丧失（VML）损伤超出了机体自身的再生能力，导致永久性功能缺损。目前的 VML 研究主要集中在四肢和躯干肌肉。为了将 VML 的机制研究扩展到颅面肌肉，本文描述了一种用于在 VML 损伤前后对咬肌功能进行纵向评估的 in vivo 方法。

摘要

体积性肌肉丧失（Volumetric Muscle Loss, VML）在民用和军用人群中均较为常见，属于一种超出机体自然再生能力的严重骨骼肌损伤。此类损伤不仅破坏肌纤维，还累及神经、血管以及细胞外基质，超出骨骼肌的再生能力，导致显著的纤维化以及肌肉结构与功能的永久性缺陷。目前的临床治疗手段存在诸多局限，因此研究人员正在积极开发更有效的治疗策略。然而值得注意的是，现有的VML前临床研究主要集中于四肢和躯干肌肉，对颅面肌的研究则较为有限。颅面肌与四肢/躯干肌肉在发育生物学和再生能力方面存在差异，这些差异可能为开发更具损伤特异性的VML治疗方案提供关键线索。此外，功能恢复的评估对于确定治疗效果至关重要。在此背景下，通过经皮神经刺激进行肌肉收缩的体内测试是一种微创方法，可在同一动物个体中于研究过程中进行多次重复的功能评估。基于上述考虑，本文介绍了一种用于评估大鼠咬肌在VML损伤前后体内肌肉功能的方法。该方案是首个公开发表的、详细描述在大鼠中建立具有生物学相关性的颅面VML损伤并进行功能评价的实验流程。

引言

涉及深层骨骼肌的软组织创伤和手术损伤，对平民和伤员的组织重建而言仍是最大的挑战之一1。事实上，近20%的战场伤情也发生在伤员的颅颌面区域（头面部）2。总体而言，在近期冲突中，四肢创伤和头颈部损伤占战伤总数的>80%2。尽管骨骼肌在损伤后具有明确的修复、再生和重塑能力，但这些更为严重的损伤——即伴有大量肌肉组织缺失的情况——无法自行愈合，被称为“容积性肌肉损失”（Volumetric Muscle Loss, VML）损伤。根据定义，VML会导致受损肌肉或肌肉功能单元永久性的外观和功能缺陷3。

有趣的是，尽管颅面部位的VML损伤相当常见2,4，但迄今为止的大部分研究集中于肢体5,6,7,8和躯干9,10,11肌肉，关于颅面肌肉VML损伤的报道仅有少数几项12,13,14。这凸显出一个潜在的重要转化研究空白，因为现有文献表明，颅面肌肉与肢体及躯干肌肉在发育生物学和再生能力方面均存在显著差异15,16。事实上，面部每侧拥有超过20块肌肉——这反映了颅面区域参与多种基本功能，如眨眼、吞咽和咀嚼15。此外，即使在颅面肌肉内部，其再生能力也存在差异。例如，眼外肌的再生速度似乎快于肢体肌肉17。相比之下，咬肌的再生反应比胫骨前肌（TA）更慢18。这些差异可能至少部分归因于肌肉的起源是鳃弓源性还是体节源性——从而导致卫星细胞数量不同，以及驻留卫星细胞群体的基因表达谱存在差异19。考虑到颅面肌肉之间以及相对于肢体和躯干肌肉的独特特征，可能为开发针对特定肌肉VML损伤的定制化治疗方案提供重要的机制性见解。这些肌肉特异性的差异也可能解释为何类似背阔肌等片状肌肉作为头颈部重建手术中供体肌肉组织移植的选择时存在已知的局限性20,21,22。

无论VML损伤的位置如何，目前尚无能够完全恢复其形态和功能的治疗方法。临床治疗的金标准包括自体组织移植和康复训练；然而，前者通常无法改善肌肉力量，并可能导致供体部位出现并发症3,23，而后者虽可改善关节活动范围，但对肌肉功能恢复或收缩力量的重建作用有限1,6。基于上述原因，目前仍在持续开展研究，以开发更有效的治疗策略，促进VML损伤后功能性肌肉组织的再生。最近一项分析强调了在VML损伤的大鼠模型中开展临床前研究对于推动再生技术在VML修复中应用的关键重要性1。

如先前研究5,8,9,10,24,25所述，评估VML损伤后的功能恢复对于判断治疗干预措施的有效性至关重要。具体而言，尽管伤口愈合和体积恢复是VML修复的关键特征，但测量损伤及治疗后的力量恢复有助于揭示导致VML功能缺陷的多尺度生物力学机制，以及驱动功能恢复的相关机制。因此，建立组织修复、体积恢复与肌肉力量增强之间的关联，是确定最有效的VML再生修复方案的必要前提9。

在这方面，进行这些功能测量主要有三种方法：(1) in vitro（体外）、(2) in situ（原位）和 (3) in vivo（体内）测试——每种方法各有优缺点8。例如，in vitro 测试是在活体外检查分离的肌肉功能，可更直接或特异性地使用多种影响肌肉兴奋性和收缩的药物与化学物质来调控肌肉刺激26。尽管该方法有助于深入研究肌肉功能与恢复的细胞与分子机制27，但其切断了血液供应和神经支配，从而限制了对真实肌肉功能的准确模拟8,26。in situ 测试则在肌肉仍处于自然解剖位置但与周围组织分离的情况下评估其功能25,28。该方法虽保留了神经支配和血液供应，但肌肉的分离仍可能限制研究结果向 in vivo 环境的外推。此外，也许更重要的是，in situ 和 in vitro 测试均为终末性操作，无法进行纵向测试，因而不能在同一只动物上追踪随时间变化的功能恢复情况。相比之下，in vivo 测试在肌肉所处的天然环境中评估其功能，从而能够在生理背景下更全面地理解肌肉表现29。in vivo 研究也是侵入性最小的技术，可在研究过程中重复进行29。通过经皮电神经刺激，可在保持肌腱、血管和神经支配完整的同时，获取特定肌肉的功能测量数据30。这些纵向评估可在同一只动物上揭示愈合不同阶段发生的细微但重要的变化。该方法常用于小型啮齿类动物模型8,31,32,33；但也在猪30和犬34等较大动物模型中得到应用。

目前已有三项关于颅面部位VML损伤后功能恢复评估的已发表研究。Rodriguez 等人报道了一种修复绵羊颧大肌颅面VML损伤模型的方法。该方法详细描述了 原位 只能在研究终点实施的检测方案，因此无法对单个动物进行纵向评估13Kim 等人描述了一种利用纳米膜电子器件持续追踪小鼠在发生 VML 损伤后咀嚼肌肌电图数据的方法。他们报告指出，与对照组小鼠相比，损伤组小鼠的信号显著降低；然而，他们也注意到运动伪影影响了信号分析，且小鼠偶尔会试图抓挠去除电路。此外，该研究使用了无胸腺裸鼠，以确保纳米膜能够牢固地附着于皮肤，但这一要求目前限制了该方法在更常用且成本较低的动物模型中的广泛应用。12最后，Zhao 等人描述了一种在小鼠咬肌中建立的临界尺寸VML缺损模型，该模型导致动物营养状况受损，表现为体重增长显著下降，以此作为功能学评价指标。14. 基于上述研究，本文介绍了一种多功能且创伤最小的实验方法 体内 通过皮下电极刺激三叉神经，在大鼠颌部发生VML损伤前后对其收缩功能进行纵向评估。随着测试过程中刺激频率逐步增加（20–200 Hz），换能器将测量肌肉产生的力量。这些测量数据可用于确定肌肉刚度、最大强直收缩力等参数。以下方案旨在评估创伤性VML损伤后同侧咬合力的功能恢复情况，因此还包括建立已验证VML损伤的手术操作流程。该方法可广泛应用于多种大鼠和小鼠模型，且在适当调整设备后，亦适用于更大的动物模型及VML损伤研究。 关键词：VML损伤，三叉神经刺激，咬合力，收缩功能，纵向评估，肌肉刚度，最大强直收缩，大鼠，小鼠，功能恢复30.

方案

所有动物操作和实验程序均经弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并遵循其指南进行。实验所用大鼠为12至14周龄的雄性Lewis大鼠，手术时体重为324.8 g ± 12.72 g。所用试剂和设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 咬肌的VML损伤

  1. 设备准备
    1. 手术前，确保所有所需器械均已适当灭菌：手术巾、手术刀、镊子、显微剪、止血钳、缝合线和纱布。
    2. 打开加热平台电源，并将其温度设置为 37 ˚C。
    3. 在两只眼睛上涂抹无菌眼用软膏，以防止麻醉期间眼睛干燥。将动物放入麻醉诱导室，并输送2%-3%异氟烷（遵循机构批准的方案）。
  2. VML损伤的外科制备
    1. 确保动物在移出麻醉舱前已充分麻醉。
      注：如果动物对脚趾夹捏无反应，则可确定。
    2. 将动物称重后置于手术板上，使其左侧卧，鼻部固定于鼻罩中，以持续给予异氟烷。
    3. 通过给予适当的镇痛剂、剃除面部右侧毛发，并使用碘伏和酒精棉片交替擦拭三次对术区进行消毒，为动物手术做好准备。本研究中使用缓释型布托啡诺作为镇痛剂（0.65 mg/kg 体重）。
    4. 手术开始时，在大鼠颊部区域做一条长约2厘米的切口，切口方向应与动物的鼻部和耳部成一直线。采用钝性分离法分离皮肤与筋膜。
    5. 沿筋膜做一相似切口，并小心将其从下方的咬肌上分离。
    6. 定位颊神经和边缘神经（图1A）。使用无菌外科标记笔和直尺标记需切除的区域。该区域应为位于暴露的咬肌中心、面神经之间的10 mm × 5 mm矩形区域。图1B).
    7. 使用显微剪仔细开始切除组织。确保最终损伤深度约为 4 mm，并切除约 150 mg 组织。图1C去除的组织将包含浅层咬肌的全层厚度，并部分深入至深层咬肌。
      注意：这些实验中切除组织的平均质量为 146.1 mg ±1.16 mg。
    8. 使用可吸收缝线（6-0）间断缝合筋膜，不可吸收缝线（5-0）间断缝合皮肤。
  3. 清理与监测
    1. 缝合后，关闭麻醉气体，将动物留在加热表面上，监测其意识恢复情况。当大鼠开始恢复意识时，将其放回笼中，并持续监测直至完全清醒并能自主活动。
    2. 术后3天内，每天观察动物，评估其是否有疼痛或不适的迹象。
    3. 术后7天内，为动物提供软质食物以减轻下颌负担，并确保动物充分饮水和进食。
    4. 术后7-10天拆除间断缝线，拆线前需确保伤口已完全闭合。
    5. 在研究的最终时间点结束后，根据IACUC指南对动物实施安乐死。取出咬肌组织，并通过浸入液氮或液氮冷却的异戊烷中进行速冻。
      注意：冷冻组织样本可于 -80 °C 长期保存，以备将来进行组织学评估。

2. 体内 下颌功能评估

  1. 设备准备
    1. 检查并确保所有设备正确连接。
    2. 依次开启：(1) 计算机，(2) 双相刺激器，(3) 双模式杠杆系统，最后 (4) 加热平台，将其预热至 37 °C。
      注意：用户手册指出，刺激器和杠杆系统需要 1 分钟的预热时间，以确保读数准确。此外，在测试任何动物之前，应预留 10–15 分钟使平台完全加热。
    3. 在动物双眼涂抹无菌眼膏，以防止麻醉期间眼睛干燥。将待测动物放入麻醉诱导舱，并通入 2%–3% 异氟烷。
    4. 将聚四氟乙烯涂层电极头浸入 70% 乙醇中进行消毒。
    5. 找到并打开 Dynamic Muscle Control (DMC) 软件。该软件将用于执行功能评估。
  2. 软件设置
    1. 在 DMC 软件中，于“设置”菜单中找到 Instant Stim ，并将参数调整为所需数值。本研究中未更改任何预设参数（图 2A）。
    2. 在 设置 菜单下，创建并选择一个 自动保存 文件夹以存储数据。
    3. 在软件界面底部附近，找到标题为 Autosave Base 的输入框。将其更改为与待测动物相对应的特定名称，例如 "rat#-timepoint"（图 2B）。
    4. 点击软件界面顶部的 Sequencer 。在新打开的窗口中，点击界面底部的 Open Sequence。在弹出的文件浏览器中选择预设序列。这将使序列窗口中填充一系列参数，如刺激频率、持续时间和休息时间（图 2C）。
      1. 点击 Load Sequence，然后点击 Close Window。
        注意：本方案中使用的序列为包含 9 个步骤（单次刺激、20 Hz、40 Hz、50 Hz、60 Hz、80 Hz、100 Hz、150 Hz、200 Hz）的程序，每步之间间隔 20 秒。除单次刺激外，其余各步持续时间为 500 毫秒。序列方案应根据各实验室的具体测试目标进行调整。
    5. 为打开新窗口并启用实时数据采集的查看功能，请选择 文件 > 实时数据监控。
    6. 在 实时数据监控 窗口中，手动设置 时间尺度、y 轴最小值 和 y 轴最大值，或勾选自动缩放框以启用自动缩放功能。
  3. 动物准备
    1. 在将动物从麻醉诱导舱中取出前，确保其已达到适当的麻醉深度。
    2. 将动物仰卧放置，鼻部固定于鼻罩中，以便持续给予异氟烷。将固定环套在大鼠上颌的上半部分，以确保其鼻部稳固地固定在平台上。
    3. 剃除动物实验侧下颌区域的颈部和面部毛发。
    4. 通过在其双臂和胸部放置并固定一条绑带，以固定动物上半身。
    5. 使用设备平台附近的三个旋转旋钮调节咬合杠杆的位置，以控制 X、Y 和 Z 三个方向（图 3A）。使用顶部旋钮将咬合杠杆向下移动靠近动物，并使用另外两个旋钮调整杠杆末端，使其正好位于动物下巴上方。
    6. 使用镊子将悬挂环钩住动物的下排牙齿，以固定头部并防止其移动（图 3B）。
      注意：该悬挂环穿过距离力传感器 3 cm 处咬合杠杆上的钻孔。系统在首次使用前应进行校准。
    7. 调节杠杆高度以增加下颌张力。本实验中采用的可重复基线张力约为 0.5 N。
  4. 电极放置
    1. 触诊动物下颌，定位下颌骨后角。将电极以约 2–3 mm 的间距皮下植入该角两侧，插入深度为 3–5 mm。使用鳄鱼夹和支架固定电极位置。
    2. 在 实时数据监控 窗口中，点击标有 Instant Stim 的大橙色按钮以启动刺激。
    3. 监控界面应在每次刺激时开始显示向上的尖峰。根据需要使用旋钮调整电极位置和杠杆臂位置。仅应观察到同侧下颌的激活（图 4）。
    4. 在高功率双相刺激器上，中心附近有两个标有 "Range" 和 "Adjust" 的旋钮。开始旋转 Range 旋钮以调节电流强度。随着电流增加，即时刺激峰值将逐渐增大，直至达到平台期——即连续三次刺激产生相同的收缩反应时的水平。
      1. 避免将电流调得过高，即不应超过最大峰值所对应电流的 20% 以上，否则可能导致邻近肌肉被募集，从而造成力值读数不准确。
    5. 旋转 Adjust 旋钮，以调节用于刺激下颌的电流占当前 "Range" 的百分比。可能需要增加或减少电流以优化单次收缩反应。
    6. 确认电极仍牢固固定后，停止 instant stim。
    7. 在实时数据监控界面中，橙色 "Instant Stim" 按钮下方，找到灰色的 Start Sequence 按钮并点击。
    8. 在整个刺激程序期间持续监测曲线变化。随着刺激频率升高，产生的最大力值也将增加。当达到强直收缩时，力值曲线将趋于平稳（图 5A）。
  5. 清理工作
    1. 完成功能刺激序列后，取下电极并用 70% 乙醇擦拭清洁。若此为最后一只待测动物，可将电极放回保护套中。
    2. 关闭麻醉气体，但将动物保留在加热平台上以监测其苏醒过程。当大鼠开始恢复意识时，将其放回笼中，并持续观察直至动物完全清醒并能自主活动。
    3. 关闭用于数据采集的设备，并擦拭所有表面。

3. 数据分析

注意：此方法先前已被描述为用于记录大鼠胫骨前肌（TA）体内功能测试的方法8。数据分析旨在确定本研究的目的，具体方案可根据使用者的目标进行调整。

  1. 找到并打开 Dynamic Muscle Analysis 软件。
  2. 点击 High Throughput 菜单，选择 Force Frequency Analysis 以同时分析多个样品。
  3. 选择 Pick Files，并选中所有需要分析的数据文件。如果文件系统中的样品命名清晰，也可使用 "Pick Folder" 按钮。
  4. 勾选 Remove Baseline 复选框。此操作将自动从每次试验记录的最大力值中扣除基线力，从而得到绝对最大值。
  5. 点击 Analyze 按钮，然后点击 Export Table to Excel ，将数据保存为电子表格。请确保 "Start Cursor" 和 "End Cursor" 的数值准确涵盖刺激的时间点。如有需要，可手动设置这些数值。
  6. 打开已保存的电子表格。
    注：利用 "Maximum" 列，用户可计算出所有频率下的最大力值。此外，还可生成力-频率曲线（图 5）。

结果

如先前发表的研究所述，强直收缩曲线可用于区分最佳结果与次优结果8。当肌肉被刺激至其最大力量，并在整个强直收缩期间维持该最大力量时，即可获得理想结果。单个单收缩融合形成强直收缩曲线通常在100 Hz时或之后开始出现。图5A展示了这一点：在150 Hz下的理想曲线在刺激开始时迅速上升，在最大力量值处呈现平坦的平台期且振荡极小，刺激停止后则迅速垂直下降。非理想的强直收缩曲线可能在平台期出现振荡，并表现出负向或正向的斜率（图5C、D）。

该功能性测试方案的结果可根据研究人员的目标和研究的实验设计以不同方式呈现。在本方案中，从所有刺激频率下实测得到的绝对最大力，并在每个测试时间点进行绘图。这使得能够将基线最大力输出与咬肌VML损伤建立后每4周的最大力输出进行比较（图1D）。作为对照，每时间点也对一组未受伤动物（n = 4）进行了测试（图1E）。同时比较了各时间点动物的体重（图1F）。在VML术后4周、8周和12周时，大鼠产生的平均最大力分别为7.958 N ±1.797 N、7.183 N ±1.450 N和7.823 N ±0.626 N。采用Fisher最小显著性差异（LSD）法进行事后两两比较的单因素重复测量方差分析（ANOVA）结果显示，VML损伤后各时间点之间的这些数值均无统计学显著差异；然而，所有时间点的数值均与基线平均力10.031 N ±0.564 N存在显著差异。

颊神经解剖结构、力测量图和体重趋势；动物研究分析。
图1：VML损伤咬肌的手术示意图及功能结果。 切除的咬肌显示了解剖方向以及用于制造损伤的神经标志（A）。动物在手术过程中，VML损伤制造前（B）和制造后（C）。所有图像中的肌肉方向均与（A）一致。黄色虚线表示将被切除的肌肉区域。接受咬肌VML损伤的大鼠（n = 9）在基线及随时间变化的最大力量输出（D），以及未受损伤的年龄匹配对照组大鼠（n = 4）的结果（E）。大鼠随时间变化的体重变化图（F）。（D）采用单因素重复测量方差分析，事后两两比较使用Fisher's LSD检验，其中 **= p < 0.01，***= p < 0.001，****= p < 0.0001。（A）和（C）中的标尺单位为厘米，刻度为毫米。请点击此处查看该图的放大版本。

瞬时刺激方案分析设置；带有时间和频率参数的序列编辑器。
图 2：功能测试的软件初始化。 DMC 软件的参数设置。设置 Instant Stim 至所需数值（A）。软件图形用户界面及 AutoSave Base 设置框的位置（B）。用于测试的 9 步协议序列的选择（C）。此处显示的数值为本研究中使用的示例值，但可能需要根据其他具体应用场景进行优化和调整。请点击此处查看该图的放大版本。

测量动物组织中力的实验装置；包括力传感器、电极和固定装置。
图3：功能测试装置的运动轴线与动物正确摆放位置。 示意图展示了功能测试装置上三个调节旋钮各自对应的杠杆臂运动轴线（A）。大鼠进行功能测试时的实际图像，显示动物在平台上的正确仰卧体位以及其他关键装置组件（B）。 请点击此处查看该图的放大版本。

大鼠实验中150 Hz下的双侧与单侧刺激及力测量图。
图4：测试期间单侧与双侧下颌激活的示例。 （A）显示刺激前大鼠下颌处于静息状态。电极放置不当可能导致双侧下颌收缩，如黄色箭头所示（B）；而正确放置的电极将引起预期的同侧收缩（C）。黄色箭头指示下颌收缩的位置。同时展示了150 Hz下双侧（D）和单侧（E）肌肉激活的典型力-时间曲线。 请点击此处查看此图的放大版本。

肌肉力量-频率响应；在不同频率（Hz）下力量（N）随时间（ms）变化的对比图。
图 5：可接受与不可接受试验的代表性刺激-反应曲线。 在 40、80 和 150 Hz 下的刺激曲线示例（A），用于说明在强直性收缩前后应观察的现象。随着刺激频率的增加，记录到的峰值张力也更高，这可以在力量-频率曲线（B）中观察到，该曲线显示了损伤动物（n = 9）在基线水平和VML 损伤后 8 周的平均值。（C,D）展示了由于强直不充分而需要调整电极时力量反应形态的代表性示例。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方案描述了一种简便且可靠的 体内 对大鼠下颌产生的同侧咬合力进行功能测试。同时描述了一种在大鼠咬肌中通过手术建立VML损伤的方法。结合使用，这些方法提供了一个具有生物学相关性的动物模型，可用于在创伤性颅面损伤前后对功能恢复进行纵向评估。尽管其他测试方法，如 体外 和 原位，也可提供有价值的信息，但需要分离肌腱并将其组织从原始环境中移除，从而限制了其在深入理解中的应用 体内 功能结果8,25,26,27,28经过适当的训练和练习，研究人员将能够快速固定动物以进行测试，并做出必要的调整，以实现最大肌肉力量的产生。

为确保电极放置和刺激的准确性，需要针对每只动物验证一些技术细节。首先，应固定上切牙，使大鼠头部完全接触加热平台，这也有助于将大鼠的鼻子保持在鼻罩内，以持续给予吸入麻醉剂。如果头部未保持在正确位置，基础张力会发生偏移，导致力值读数不一致。此外，动物体位应为仰卧位，脊柱应保持平直。保持正确的体位有助于电极的准确定位并维持在目标位置。最后，电极的放置可能较为困难，因为必须将其置于适当的深度和间距，以仅刺激下颌的实验侧。仔细操作和反复练习对于熟练掌握电极放置、获得可重复且可靠的结果至关重要。电极会很快变钝，因此需要频繁更换。电极放置不当的典型表现包括：副肌被激活、力值读数呈正/负斜率（刺激过程中电极移位），或出现非融合/振荡的强直收缩波形8（图 5C、D）。

此外，该方法存在一些局限性，在未来应用该系统时需要加以说明和考虑。首先，尽管本研究所采用的测量方法已足够，但用于固定上颌的环状结构可能并非最理想的刚性固定系统。相比之下，使用耳杆的立体定位方法可能更有效地固定大鼠的上颌。另外，本方法以被动张力值作为测试的设定位置，而这一位置可能无法使肌肉产生最大收缩力，因为肌肉未处于其最佳长度（Lo）。事实上，可通过本文所述方式安置动物，然后以较小的增量（0.5–1 mm）调节下颌咬合位置，同时进行单次电刺激，从而确定Lo；Lo即为产生最大单收缩力时的最优测试位置。然而，咬肌具有相当独特的几何结构和运动方式35,36，因此其工作长度范围远比例如肢体肌肉（通常在Lo附近工作）更广。但与咬合动作相比，咀嚼动作发生的长度范围较窄。因此，目前尚无完美的解决方案。尽管设定基础张力并非唯一可行的方法，但这样做具有合理的科学依据，因为下颌肌肉的最佳长度超出了下颌的自然张开范围。无论如何，在特定被动张力下测得的最大收缩力仍能提供有关肌肉功能的重要信息——即使该值不同于在Lo时测得的最大收缩力。显然，有必要进一步研究咬肌的力-长度关系。最后，本方法针对大鼠三叉神经的刺激进行观察，该神经分为三个分支：V1–V3。其中只有V3（即下颌神经）含有运动成分，但它同时支配多个肌肉，包括咬肌、颞肌、翼状肌和下颌舌骨肌37。这一点非常重要，意味着本方法测得的力并非仅来源于咬肌，这在其他研究中可能具有相关性。

尽管存在这些技术层面的问题和局限性，该方法仍被证明是稳健且可靠的。本文仅描述了同侧测试，但该方案可轻松修改以增加对下颌另一侧的额外测试。对咬肌收缩/功能进行双侧测试，将允许在单个动物体内进行健康侧与损伤侧的比较，或许能揭示损伤侧和/或对照侧（未损伤侧）重要的代偿性变化。总体而言，该模型为以微创方式评估肌肉功能的纵向变化以及功能恢复提供了强有力的工具。因此，该系统适用于研究伴随VML（体积性肌肉损失）所致功能缺陷的生物力学机制，也可用于测试各种治疗手段在颅面区域VML损伤修复中的有效性。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

Myologica LLC 提供用于功能评估的设备。本出版物所报告的研究由美国牙科与颅面研究所资助 & 美国国立卫生研究院资助项目编号 U24 DE029463。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
200 proof 乙醇Decon Labs用去离子水稀释至 70%
25 mm x 27 G 单极针状电极Chalgren Enterprises111-725-24TP用于功能测量
酒精棉片BD326895用于消毒/清洁
鳄鱼夹及支架/辅助手焊接辅助工具Eclipse Enterprise115584固定电极位置
珠式灭菌器18000-45用于手术（在不同动物间重新灭菌器械）
双相电刺激器Aurora Scientific701C在功能测试期间向动物传递电脉冲
咬合杠杆Custom 定制 3D 打印（详情请与作者联系）
压缩氧气气体PraxairUN1072
棉签Fisher22363157用于手术
双模式肌肉杠杆系统Aurora Scientific309C用于功能测量
动态肌肉数据采集与分析系统Aurora Scientific615A用于收集和分析功能测量数据
面罩High FiveAM101用于手术
镊子Integra Miltex6-100 用于手术
纱布MedlinePRM21408C用于手术
毛发修剪器PhillipsMG3750去除毛发
发网VWR75829-204用于手术
异氟烷Covetrud29405
异氟烷蒸发器漏斗加注装置Vet Equip911103
异氟烷挥发器Kent ScientificVetFlo-1231用于麻醉给药
大型啮齿类/小型动物装置Aurora Sceintific807B与 309C 电机配合用于功能测量
显微剪刀FST91500-09用于手术
持针器FST1200-13用于手术
聚维酮碘MedlineMDS093943用于消毒/清洁
普理灵缝线 5-0Ethicon8698G缝合皮肤
手术刀Personna Medical73-8030用于手术
手术刀片Glass Van1834用于手术
手术单 - ACT 材料N/AN/A裁剪为 8 x 11 英寸，并在手术前进行高压灭菌
外科手套Encore5711103PF用于手术
手术服VWR414004-467用于手术
T/Pump 加热/冷却泵Braintree Scientific, IncTP-700为手术和功能测试中的动物平台提供加热——设置为连续治疗模式，温度为 38/100
VaporGuard 活性炭过滤器Vet Equip931401
薇乔缝线 6-0EthiconJ492G缝合筋膜

参考文献

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