本实验方案描述了用于研究和表征小麦植株中细胞壁相关酶（主要是β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶）的方法。这些酶的活性水平在小麦与禾谷缢管蚜（RWA）互作过程中升高，并通过增强细胞壁参与植物防御反应，从而抑制蚜虫取食。
方法文章
阐明小麦细胞壁防御机制中针对麦长管蚜（Diuraphis noxia）侵害的β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶的理化特性
本文内容
摘要
摘要
受俄罗斯麦蚜（RWA）侵染的小麦植株会诱导一系列防御反应，包括超敏反应（HR）以及病程相关（PR）蛋白的诱导表达，例如β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶（POD）。本研究旨在表征细胞壁结合型POD和β-1,3-葡聚糖酶的理化性质，并确定其在RWASA2与小麦互作过程中对细胞壁修饰的协同作用。感病品种Tugela、中度抗性品种Tugela-Dn1和抗性品种Tugela-Dn5经预萌发后在温室条件下种植，种植后14天施加肥料，并每隔3天灌溉一次。在三叶期，每株接种20只来自同一RWASA2克隆的孤雌生殖个体，并于接种后1至14天采集叶片。通过真空过滤法提取胞间液（IWF），并于-20 °C保存。叶片残渣被研磨成粉末，用于分离细胞壁组分。POD活性测定及性质分析采用5 mM愈创木酚作为底物并加入H2O2，监测470 nm处吸光度的变化。β-1,3-葡聚糖酶活性及其最适pH和温度条件通过DNS试剂测定水解产物中的总还原糖来确定，所用底物为β-1,3-葡聚糖和β-1,3-1,4-葡聚糖，在540 nm处测定吸光度，并利用葡萄糖标准曲线进行定量。最适pH范围设定为pH 4至9，最适温度范围为25至50 °C，热稳定性测试范围为30 °C至70 °C。β-1,3-葡聚糖酶的底物特异性在25 °C和40 °C下使用curdlan（凝结多糖）和大麦β-1,3-1,4-葡聚糖作为底物进行测定。此外，通过使用从龙胆二糖到龙胆五糖的寡糖底物确定β-1,3-葡聚糖酶的作用方式。寡糖水解产物的图谱通过薄层色谱法（TLC）进行定性分析，并通过高效液相色谱法（HPLC）进行定量分析。本研究所提出的方法展示了一种可靠的小麦接种RWA、从细胞壁区域提取过氧化物酶和β-1,3-葡聚糖酶并对其进行全面生化表征的技术流程。
引言
俄罗斯麦蚜（RWA）侵害小麦和大麦，导致显著的产量损失或籽粒品质下降。小麦在受到侵害时会诱导多种防御反应：在抗性品种中，β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶的活性水平升高，而在感性品种中，这些酶的活性在侵害初期则会降低1,2,3,4。β-1,3-葡聚糖酶和POD在小麦植株中的关键功能包括在RWA侵害期间调节抗性品种中胼胝质的积累，以及在细胞壁和质外体区域清除活性氧（ROS）1,3,5,6,7。Mafa 等人6证明，在RWASA2侵害下，抗性小麦品种中POD活性的增加与木质素含量的升高之间存在显著相关性。此外，木质素含量的增加表明受侵害的抗性小麦品种的细胞壁得到加强，从而减少了RWA的取食。
大多数研究团队在小麦/大麦与俄罗斯麦蚜（RWA）互作过程中提取并研究了质外体中的β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶（POD）；此外，这些研究中的大多数声称这些酶会影响受RWA侵染的小麦植株的细胞壁，但却未检测酶在细胞壁区域的存在。仅有少数研究利用显微技术表明β-1,3-葡聚糖酶活性水平与胼胝质调控相关7,8,9，或提取主要的细胞壁组分以证明POD活性与抗性植株中细胞壁修饰之间的关联6,10。目前缺乏对β-1,3-葡聚糖酶和POD与细胞壁关联性的深入探究，表明有必要开发可直接测定细胞壁结合酶的方法。
目前的方法认为，在提取细胞壁结合酶之前，有必要从叶片组织中去除质外体液。用于提取细胞壁结合酶的叶片组织必须重复进行两次质外体液提取步骤。该过程可减少质外体酶与细胞壁区域酶之间的污染和混淆。因此，在本研究中，我们提取了细胞壁结合的过氧化物酶（POD）、β-1,3-葡聚糖酶以及MLG特异性的β-葡聚糖酶，并对其进行了生物化学表征。
方案
本研究经自由州大学环境与生物安全研究伦理委员会批准并获得许可（UFS-ESD2022/0131/22）。试剂和设备的详细信息列于材料表中。
1. 植物生长条件
- 分别在不同的培养皿中萌发每种小麦品种的250粒种子，即感病型Tugela、中等抗病型Tugela-Dn1 和抗病型Tugela-Dn5。
- 每个培养皿中加入5 mL蒸馏水，用石蜡膜密封后置于25 °C的萌发培养箱中培养2天。
- 将已萌发的各品种种子移栽至盛有土壤与泥炭藓混合物（体积比1:1）的15 cm花盆中，在可控温室条件下培养（每盆15株植物）。
- 设置夜间温度为18 °C，白天温度为24 °C。
- 每隔3天用自来水灌溉一次，并在萌发后14天施加2 g/L的肥料。
- 将植株置于由网罩封闭的笼子中，使其生长至第三片叶阶段2,6（每个品种设四个生物学重复）。
2. 小麦品种感染 RWASA2
- 根据 Jimoh 等11 和 Mohase 与 Taiwe12 的方法，用 RWASA2 侵染 Tugela、Tugela-Dn1 和 Tugela-Dn5 小麦品种。
- 将植株分为两组，分别置于加装网罩的培养室中；其中一组每盆每株接种 20 头相同 RWASA2 克隆的孤雌生殖个体，并用网罩覆盖；另一组小麦植株置于单独的房间内，在培养室中使用洁净网罩覆盖，作为对照组。
注意：将两种处理分别放置在不同的房间，并将植株置于加装网罩的笼子中。若研究中使用两种不同的 RWA 生物型，则应尽可能将接种一种 RWA 生物型的植株与接种另一种生物型的植株分开，或分别放置在不同房间的加网罩培养室中，以避免 RWASA2 可能发生的交叉污染。 - 采样时，在两个不同的时间阶段选取第二和第三片叶：短期取食期（1、2 和 3 天）和长期取食期（7 和 14 天），并将叶片用湿润的纸巾包裹。
- 立即将采集的叶片转移至装有冰块的盒子中，以降低叶片代谢，随后进行胞间洗涤液（IWF）提取。
3. 从质外体提取细胞间洗涤液（IWF）
- 将三种小麦品种的收获叶片切成约7 cm的片段。
- 用蒸馏水冲洗叶片片段两次，以去除切口处可能存在的胞质污染6,13。
- 将叶片片段插入厚壁玻璃管中，并将样品浸入提取缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.8）中。
- 使用水流抽气泵进行5分钟的真空渗透，使叶片充分浸润提取缓冲液。
- 随后，将叶片片段从玻璃管中取出，并用纸巾吸干表面液体。
- 将干燥后的叶片片段垂直插入配有穿孔圆盘的预冷离心管中，在4 °C条件下以500 x g离心10分钟。
- 使用100 µL移液器将上清液收集至预冷的1.5 mL微量离心管中。
- 使用相同的叶片材料重复整个提取过程。
- 合并收集的上清液，并在−20 °C下保存。
注意：上清液分装后视为质外体内容物或IWF来源。本研究未使用IWF，但在提取细胞壁结合的β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶（POD）之前，必须将其从叶片组织中去除。
4. 提取细胞壁相关的β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶
注意：提取IWF后剩余的叶片残渣用于提取总细胞壁蛋白。
- 使用研钵和研杵，在液氮中将叶片残渣研磨成细粉。
- 取约 200 mg 粉碎后的叶片组织，转移至含有 4 mL 提取缓冲液（50 mM 磷酸钠，含 1% (w/v) 聚乙烯聚吡咯烷酮 (PVPP)；pH 5.0）的研钵中，用研杵研磨成均匀糊状，然后转移至微量离心 管中。
- 将混合物置于冰上孵育 3 分钟，随后在 4 °C 条件下以 10,000 x g 离心 15 分钟。
- 收集上清液（总蛋白提取物）至微量离心管中（每份 2 mL），并将其作为本研究中 β-1,3-葡聚糖酶和 POD 的来源使用。
5. 蛋白质标准品的测定
- 采用Bradford法测定提取物的总蛋白浓度14。
- 用50 mM磷酸钠缓冲液配制浓度分别为0.0 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL和1.0 mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）溶液，用于制备蛋白标准品。
- 向96孔微孔板中加入10 µL每种BSA溶液，并加入190 µL（0.25% v/v）Bradford试剂（见材料表），制备标准品。
- 在25 °C孵育20分钟，使用微孔板读数仪在595 nm处测定吸光度，并利用吸光度值绘制标准曲线以定量蛋白浓度。
- 定量蛋白浓度
- 取10 µL提取的酶液（步骤4），加入96孔微孔板中，再加入190 µL（0.25% v/v）Bradford试剂，每个样品设三个重复。
- 在室温（25 °C）孵育20分钟。
- 使用配备微孔板读数仪的分光光度计在595 nm处测定吸光度，并利用BSA作为蛋白标准品（步骤5.4中制备）的吸光度值确定蛋白浓度。
6. 准备用于β-1,3-葡聚糖酶活性测定的葡萄糖标准品
- 用葡萄糖溶于蒸馏水中，配制浓度介于 0.00 mg/mL 至 1.0 mg/mL 之间的标准溶液（0.0 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL、1.0 mg/mL）。
- 将每种葡萄糖溶液 300 µL 与 600 µL 的 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂按 1:2 的比例加入 1.5 mL 微量离心管中，并在 100 °C 下孵育反应 5 分钟（DNS 试剂详见材料表）（Miller 等15）。
- 将混合物在室温下冷却，然后使用分光光度计在 540 nm 处测定其吸光度。
- 利用平均吸光度值绘制标准曲线，用于测定 β-1,3-葡聚糖酶活性。
7. 测定 β-1,3-葡聚糖酶活性实验
注意：采用 Miller 等人描述的改进方法15，通过测定水解 0.5% (w/v) 混合连接的 β-1,3-1,4-葡聚糖（MLG）和 0.4% (w/v) β-1,3-葡聚糖底物所释放的总还原糖量，来确定从 Tugela、Tugela-Dn1 和 Tugela-Dn5 中提取的细胞壁结合型 β-1,3-葡聚糖酶的酶活性。含有蛋白等分试样的离心管须始终置于冰上。若样品曾冷冻保存，需在冰上解冻，并在解冻后立即进行后续操作。
- 向1.5 mL微量离心管中加入200 µL酶提取液（除非另有说明，所有反应中蛋白浓度应保持在20 µg/mL至90 µg/mL之间）和300 µL溶于50 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 5.0）中的底物。
注意：对所有底物均需平行设置不含酶提取液的空白对照反应（第一空白），以及不含底物的酶空白对照（第二空白）。第一空白中以缓冲液替代底物，第二空白中以缓冲液替代酶提取液。 - 将反应体系在37 °C孵育24小时，随后于100 °C加热5分钟以终止反应，然后在4 °C下以10,000 x g离心10分钟。
- 取300 µL上清液与600 µL DNS试剂（1:2比例）混合至新的1.5 mL微量离心管中，并在100 °C煮沸5分钟。
- 让溶液冷却至室温，使用分光光度计在540 nm处测定吸光度。
注意：若混合物中总还原糖浓度较高，将产生深棕色溶液，难以用分光光度计准确读数。因此，在测定吸光度前需对样品进行进一步稀释。 - 利用上述步骤6.4中建立的葡萄糖标准曲线，确定酶活性的标准曲线国际单位（SI单位）。
- 为将酶活性转换为以µmol葡萄糖/h/mg蛋白表示的比活性，请使用以下公式：
比活性 = [(酶活性/180.16)*1000]/反应时间/蛋白浓度
注意：需将酶活性单位从mg/mL转换为g/mL；180.16 g/mol为葡萄糖的分子量，1000是将摩尔浓度（M）换算为微摩尔的换算系数，反应时间为反应持续时间，蛋白提取液浓度以mg/mL表示。一个单位的β-1,3-葡聚糖酶活性定义为在1小时反应时间内从底物释放出1 µmol葡萄糖的酶量。
8. 测定过氧化物酶（POD）活性
注意：通过定量单位时间内由愈创木酚生成的四愈创木酚量来测定Tugela、Tugela-Dn1和Tugela-Dn5小麦品种中细胞壁结合型过氧化物酶活性16。
- 在25 °C条件下，向比色皿中加入30 µL酶提取液、30 µL 1% (v/v) H2O2 和970 µL 5 mM愈创木酚。
注意：设置不含酶提取液的空白反应（第一空白），以及不含底物的酶样品空白（第二空白）。在第一和第二空白中，分别用50 mM磷酸钠缓冲液替代酶或底物样品。 - 使用分光光度计的动力学模式监测470 nm处吸光度的变化。
- 确定曲线呈线性部分的斜率，并将其作为吸光度值。
- 计算平均吸光度，并用于过氧化物酶（POD）活性的计算。
- 利用愈创木酚的摩尔消光系数（26.6 mM-1cm-1）计算过氧化物酶活性，并以µmol四愈创木酚/min/mg蛋白表示活性。
- 使用Mafa等6所采用的公式计算POD活性：
POD活性 = [(ΔABS × DF) ÷ 蛋白质浓度] × 26.6 mM-1cm-1 × 1 cm
注意：其中ΔABS = 平均吸光度；DF = 稀释倍数；26.6 mM-1cm-1 = 愈创木酚消光系数。
9. POD 的表征
注意：POD 表征分析使用感虫后 3 天（dpi）的 Tugela、Tugela-Dn1 和 Tugela-Dn5 酶提取物进行，实验方法与第 8 步所述相似，仅在反应缓冲液和温度上略有调整。实验过程中，酶样品始终置于冰上。每个反应设四个重复，并平行设置空白对照反应。
- 为获得最佳 pH 检测结果，请执行以下步骤。
- 将愈创木酚底物溶解于 50 mM 缓冲液中：柠檬酸钠缓冲液（pH 4 和 5）、磷酸钠缓冲液（pH 6 和 7）以及 Tris-HCl 缓冲液（pH 8 和 9）（参见 材料表）。
- 按照步骤 8 所述，在 25 °C 下进行反应。
- 为获得最佳温度检测结果，请执行以下步骤。
- 分别在 25 °C、30 °C、40 °C 和 50 °C 下进行反应。
- 使用溶解于 pH 5（最适 pH）缓冲液中的愈创木酚底物，并按照步骤 8 所述进行反应。
- 为进行热稳定性检测，请执行以下步骤。
- 在开始反应前，将酶在 37 °C、50 °C 和 70 °C 下分别孵育 30 分钟。
- 使用 50 mM 柠檬酸钠缓冲液（pH 5）并在 40 °C（最适温度）下，按照步骤 8 所述方法进行反应。
10. β-1,3-葡聚糖酶的表征
注意：采用第7步所述方法，使用3 dpi的酶提取物进行表征分析，但需对反应缓冲液和反应温度进行部分修改。每个底物设置四重重复反应，并平行设置相应的空白对照反应。
- 进行最适 pH 值测定实验时，操作步骤如下：
- 将 MLG 和 β-1,3-葡聚糖底物分别溶解于 50 mM 缓冲液中：柠檬酸钠缓冲液（pH 4 和 5）、磷酸钠缓冲液（pH 6 和 7）以及 Tris-HCl 缓冲液（pH 8 和 9）。
- 按照步骤 7 所述条件进行反应。
- 进行最适温度测定实验时，操作步骤如下：
- 分别在 25 °C、30 °C、40 °C 和 50 °C 条件下进行反应。
- 使用溶解于 50 mM 柠檬酸钠缓冲液（pH 5）中的 MLG 和 β-1,3-葡聚糖底物（该 pH 值为步骤 10.1 中确定的最适 pH），并按照步骤 7 所述条件进行反应。
- 进行热稳定性测定实验时，操作步骤如下：
- 在开始反应前，将酶分别于 37 °C、50 °C 和 70 °C 下孵育 30 分钟。
- 使用溶解于 50 mM 柠檬酸钠缓冲液（pH 5）的底物进行反应，并在 25 °C 和 40 °C 下孵育 24 小时。
11. 评估β-1,3-葡聚糖酶在不同葡聚糖底物上的作用机制
注意：葡聚糖底物的骨架中含有相同的葡萄糖残基，但吡喃葡萄糖单元之间的糖苷键具有多样性，可呈现 α 或 β 构型17。糖苷键可在葡萄糖分子的多个碳原子之间形成，从而决定其化学结构，例如 β-1,3-葡聚糖、β-1,4-葡聚糖以及混合连接的 β-1,3-1,4-葡聚糖（MLG）18,19,20。β-1,3-葡聚糖酶的作用机制通过使用受 RWASA2 侵染的 Tugela、Tugela-Dn1 和 Tugela-Dn5 样品（酶来源）以及以下底物进行测定：β-1,3-葡聚糖（CM-热凝胶）、MLG（来自大麦）和 β-1,4-葡聚糖（AZO-CM-纤维素）。该作用机制在最佳检测条件下（25 °C 和 40 °C，pH 5.0）测定，所用底物浓度分别为 0.1%（w/v）β-1,4-葡聚糖、0.4%（w/v）β-1,3-葡聚糖或 0.5%（w/v）MLG。
- 将底物溶解于 50 mM 柠檬酸钠缓冲液（pH 5）中。
- 向 1.5 mL 微量离心管中加入 200 µL 酶提取物和 300 µL 底物。
- 将反应体系分别在 25 °C 和 40 °C 下孵育 8 小时。
- 通过在 100 °C 加热终止反应。
- 将 β-1,3-葡聚糖和 MLG 的反应混合物在 4 °C 下以 10,000 x g 离心 10 分钟，并按步骤 7.3 所述进行后续操作。
- 对于 β-1,4-葡聚糖，在 100 °C 终止反应后，用 800 µL 无水乙醇稀释混合物，并在 4 °C 下以 10,000 x g 离心 10 分钟。
- 将上清液转移至比色皿中，使用分光光度计在 590 nm 处测定吸光度，并根据制造商的操作程序（见材料表）计算 β-1,3-葡聚糖酶在 β-1,4-葡聚糖上的活性，以单位每毫克蛋白（Units/mg protein）表示活性。
12. 确定β-1,3-葡聚糖酶的作用方式
注意：采用聚合度（DP）在5至2之间的昆布寡糖（LAMs）检测受RWASA2侵染的Tugela、Tugela-Dn1和Tugela-Dn5诱导的β-1,3-葡聚糖酶作用模式。使用薄层色谱法（TLC）、液相色谱-质谱联用法（LC-MS）以及葡萄糖氧化酶-过氧化物酶（GOPOD）试剂盒，测定β-1,3-葡聚糖酶水解底物所需的聚合度。TLC用于定性分析，LC-MS用于定量分析，以确定反应后水解产物中寡糖的浓度21。
- 准备β-1,3-葡聚糖酶作用模式的反应
注意：使用10 kDa离心浓缩膜滤器制备浓缩的蛋白质提取物，从而获得用于实验的浓缩和非浓缩RWASA2侵染蛋白质提取物。- 为浓缩从各品种中提取的酶，将5 mL提取物转移至10 kDa离心浓缩膜滤器中。
- 在4 °C条件下，以15,000 x g离心含有提取物的膜滤管30分钟。
- 将Laminaripentaose（LAM5）、Laminaritetraose（LAM4）、Laminaritriose（LAM3）和Laminaribiose（LAM2）（见材料表）溶解于50 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 5）中，配制成10 mg/mL的溶液。
- 启动反应时，加入20 µL蛋白质提取物和40 µL的Laminaripentaose（LAM5）、Laminaritetraose（LAM4）、Laminaritriose（LAM3）及Laminaribiose（LAM2）。
- 在40 °C孵育反应16小时，然后于100 °C煮沸5分钟终止反应。
- 进行薄层色谱分析（TLC）
- 将4块硅胶板切割成10 cm2大小，并在板表面画一条线，距离一端底部边缘1 cm。
- 在线上标记点样位置，根据不同品种和Laminarin寡糖的聚合度（DP）进行标注，各点间距1 cm。取2块硅胶板用于浓缩蛋白质提取物，另2块用于非浓缩提取物。
- 将3 µL反应混合物重复点样3至5次于硅胶板上对应的标记位置，每次点样后需待斑点完全干燥再进行下一次点样。
- 轻轻将硅胶板放入含有流动相（正丁醇:乙酸:水 = 2:1:1 v/v/v）的TLC展开槽中，确保样品点所在的一侧朝下。
- 让流动相从板的底部向上迁移。
注意：此步骤可能需要约2小时。样品分离过程中请勿移动或扰动展开槽。 - 将硅胶板从流动相中取出，并在室温下自然晾干。
- 将染色液倒入小容器中，轻轻将硅胶板浸入含0.3%（w/v）α-萘酚的95%（v/v）乙醇溶液中，再加入5%（v/v）硫酸，浸泡5秒后取出，并在室温下晾干。
注意：在此步骤中，开启加热板或烘箱，并将温度设定为100 °C。 - 将干燥后的硅胶板置于加热板上，在100 °C加热7–10分钟，直至出现蓝紫色斑点。拍摄显示蓝紫色斑点的硅胶板照片并记录结果。
- 定量分析Laminarin寡糖水解产物的浓度
注意：将对浓缩和非浓缩蛋白质提取物中的LAM水解产物浓度进行定量21。- 将每种样品各20 µL注入C18（碳水化合物柱，4.6 × 250 mm）色谱柱，在流速为500 µL/min条件下进行分离；采用水（溶剂A）与乙腈（溶剂B）梯度洗脱，初始为100% B，10分钟内降至60% B，随后进行柱再平衡，总运行时间为20分钟。
- 在质谱离子源中以负离子电喷雾模式电离洗脱的分析物，加热器温度设为400 °C以蒸发多余溶剂，雾化气压力30 psi，加热气压力30 psi，帘气压力20 psi。
- 设定去簇电压为350 V。
- 在质谱仪上以Q1全扫描模式分析洗脱的分析物，扫描范围为150 Da至1000 Da，驻留时间为3秒。
- 将分析物的浓度记录在电子表格中。
- 定量分析葡萄糖浓度
- 按照制造商说明书22,23，使用GOPOD试剂测定Laminarin水解所产生的葡萄糖浓度。
- 在分光光度计的固定模式下测定510 nm处的吸光度。
13. 数据收集与分析
- 对所有实验进行随机化处理，以避免在侵染或样品采集过程中产生偏差，并以四重复进行分析。
- 除非另有说明，图表和表格中展示的数据均以均值 ± 标准差表示，数据来源于收集的实验结果。
- 使用 Microsoft Excel 对所有数据进行分析并生成图表。
- 使用兼容的软件进行统计分析。
注意：采用多因素方差分析（ANOVA）检验处理间的显著性差异，并在 α = 0.05 水平下使用 Fisher 最小显著性差异法（LSD）检验同质性分组。
结果
在三叶生长期，对小麦品种（Tugela、Tugela-Dn1 和 Tugela-Dn5）的四个生物学重复样本接种 RWASA2。接种后，分别在 1、2、3、7 和 14 天采收叶片。对照处理组不接种 RWASA2，以使实验结果与未受胁迫的小麦植株具有可比性。实验设置四个重复，结果以平均值表示。
使用牛血清白蛋白（BSA）作为蛋白质标准品，对受RWASA2侵染和对照组提取物的蛋白质浓度进行了定量。这有助于确定β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶（POD）的酶活性，并确保每个反应中所用各样品的蛋白质浓度均明确可知；各组间的差异可忽略不计。数据可以以图形或表格形式呈现。第一种图形形式用于表示酶特异性活性（y轴）随侵染后天数（x轴）的变化，适用于酶活性及酶学特性分析结果。在受RWASA2侵染的抗性品种Tugela-Dn5样品中，β-1,3-葡聚糖酶、MLG特异性β-葡聚糖酶和POD的特异性活性升高，表明这些酶参与了防御反应（图1 和 图2）。此外，在易感品种Tugela受RWASA2侵染后，这两种酶的活性随时间显著下降。
通过以相对活性百分比或比酶活性表示酶活性，分别采用折线图和柱状图展示了细胞壁相关β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶（POD）的生化特性（图3）。结果表明，β-1,3-葡聚糖酶和POD均在相似的pH最适条件下（pH 5）表现出最高活性，这与细胞壁的酸性环境相一致（图3）。值得注意的是，特异性降解混合连接β-葡聚糖（MLG）的β-葡聚糖酶在pH 5时也表现出较高的酶活性。然而，该酶在碱性条件下比β-1,3-葡聚糖酶更稳定，后者在相同条件下相对活性损失高达80%。上述结果证实，基于最适pH条件，能够成功从细胞壁区域提取出催化MLG和β-1,3-葡聚糖底物的两种酶。该结论得到了热稳定性实验结果的验证（图4），结果显示β-1,3-葡聚糖酶仅能耐受至50 °C的温度，在70 °C时相对活性损失超过80%（POD表现出相似的趋势）。相比之下，MLG特异性β-葡聚糖酶在25 °C时活性最高，随后随温度升高活性逐渐下降，但在50 °C和70 °C时仍保持超过50%的相对活性。这些观察结果表明，与从Tugela、Tugela-Dn1和Tugela-Dn5中提取的β-1,3-葡聚糖酶和POD相比，MLG特异性β-葡聚糖酶具有独特的生化特性。
通过聚合度（DP）介于5至2之间的昆布多糖寡糖（分别称为LAM5至LAM2）验证了β-1,3-葡聚糖酶的作用方式。薄层色谱（TLC）结果显示，感病的Tugela、Tugela-Dn1和Tugela-Dn5均含有β-1,3-葡聚糖酶，该酶主要水解较长的寡糖（LAM5和LAM4），相较于较短的寡糖（LAM3）更为显著。TLC板上显现出的蓝紫色斑点强度表明，在抗病和中度抗病品种中，LAM5和LAM4的条带较弱，随后是LAM3条带（图5）。而感病品种Tugela显示，β-1,3-葡聚糖酶对LAM5的水解能力优于其他寡糖（LAM4-LAM2），表现为更强的条带信号。该作用方式还通过水解产物的浓度加以体现，以热图形式呈现在表格中，显示该酶对高聚合度的昆布寡糖具有高效的水解能力，而在水解较短寡糖（LAM3和LAM2）时表现出中等活性（Table 1）。
图1：感染RWASA2后14天，Tugela（A）、Tugela-Dn1（B）和Tugela-Dn5（C）中提取的过氧化物酶的比活性。 实验重复四次；数值和误差线分别表示均值 ± 标准差。U/mg 蛋白质中的 U 表示 µmol 四甲氧基联苯胺/min。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：在受RWASA2虫害的Tugela、Tugela-Dn1和Tugela-Dn5品种中测得的β-1,3-葡聚糖酶特异性活性。 酶活性测定使用了两种化学性质不同的葡聚糖底物，即混合连接的β-1,3-1,4-葡聚糖（A-C）和酵母葡聚糖（D-F）。实验重复四次；数值和误差线分别表示均值±标准差。U/mg蛋白中的U表示µmol/h。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：接种RWASA2后3天，从受侵染的Tugela、Tugela-Dn1和Tugela-Dn5中提取的β-1,3-葡聚糖酶的最适pH测定结果。 实验使用混合连接β-1,3-1,4-葡聚糖（A-C）和酵母葡聚糖（D-F）作为底物。实验重复四次；数值和误差线分别表示均值±标准差。U/mg蛋白中的U表示µmol/h。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：热稳定性测定。 感染RWASA2后3天，Tugela、Tugela-Dn1 和 Tugela-Dn5 中来源的β-1,3-葡聚糖酶在β-1,3-1,4-葡聚糖（A-C）和β-1,3-葡聚糖（D-F）上的热稳定性测定结果。实验重复四次；数值与误差线分别表示均值±标准差。U/mg蛋白中的U表示µmol/h。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：β-1,3-葡聚糖酶在岩藻聚糖寡糖上作用模式的分析。 岩藻聚糖寡糖用 L5、L4、L3 和 L2 表示，分别相当于岩藻聚戊糖（LAM5）、岩藻聚四糖（LAM4）、岩藻聚三糖（LAM3）和岩藻聚二糖（LAM2）。红色箭头指示葡萄糖（GLU），蓝色箭头指示无寡糖存在时酶的图谱。请点击此处查看该图的放大版本。
表1：用感染RWASA2三天的小麦品系提取的浓缩β-1,3-葡聚糖酶处理产生的昆布寡糖。 水解产物中寡糖的浓度通过液相色谱-质谱法（LC-MS）测定。LAM5、LAM4、LAM3、LAM2和GLU分别代表昆布五糖、昆布四糖、昆布三糖、昆布二糖和葡萄糖。请点击此处下载该表格。
讨论
小麦和大麦是常受蚜虫侵害的谷类作物，其中包括俄罗斯麦蚜（Diuraphis noxia）7,24。抗性小麦植株在整个侵染期间会诱导过氧化物酶（POD）和β-1,3-葡聚糖酶活性上调，作为防御反应，通过调控胼胝质和木质素的积累来改变细胞壁结构6,25,26,27。需要指出的是，大多数研究从质外体中提取POD和β-1,3-葡聚糖酶3,12,28，因此这些酶在细胞壁中的功能仍具有高度推测性。本研究建立了一种方法，可将细胞壁结合型β-1,3-葡聚糖酶、麦醇溶蛋白特异性β-葡聚糖酶以及POD作为总蛋白的一部分进行提取。在抗性小麦品种中，这些酶的活性显著高于对照组，而在感病品种中其活性则出现延迟。实验中使用对照有助于理解侵染对细胞壁结合酶活性水平的影响。对受侵染样本和对照样本采集第三叶和第二叶组织非常重要，这有助于保持实验一致性。此外，受侵染样本与对照样本应采用相同的采样周期，因为POD、β-1,3-葡聚糖酶和麦醇溶蛋白特异性β-葡聚糖酶的活性会随着小麦幼苗的生长而增加。
本研究中使用的可得兰（curdlan）底物在化学结构上与胼胝质相似，后者是在小麦与禾谷缢管蚜（RWA）互作过程中沉积于细胞壁区域的一种多聚物7,24。大麦混合链葡聚糖（MLG）底物代表了大多数单子叶植物中相对于木聚糖含量较低的细胞壁半纤维素组分。这些底物溶解于pH 5的柠檬酸钠缓冲液中，以模拟植物细胞壁区域的酸性环境29。如果β-1,3-葡聚糖酶和MLG特异性β-葡聚糖酶随胞间液（IWF）被去除，则从剩余叶片组织中提取的总蛋白将不会对MLG和可得兰底物表现出酶活性。此外，如果蛋白提取物来源于细胞质区域，则其应在中性pH范围内表现出活性。有趣的是，总蛋白提取物中均检测到这两种酶的存在，因其能够成功水解MLG和可得兰底物。相应酶对MLG和可得兰的水解反应生成了还原糖，后者通过改良的Mafa等人的DNS试剂法进行检测6。当样品中还原糖总浓度较高时，DNS试剂颜色由黄色变为深棕色；而当还原糖浓度较低时，颜色则由黄色变为浅棕色（呈深橙色外观）。
使用愈创木酚作为底物来测定过氧化物酶（POD）活性。由于POD具有很高的催化效率，我们采用分光光度计的动力学模式来测定其活性。在底物（愈创木酚）存在的情况下，低浓度的H2O2可激活POD。该酶的活性将愈创木酚转化为四愈创木酚，后者是一种呈棕橙色的化合物。四愈创木酚的生成表明POD能够交联酚类化合物形成寡聚物，或将酚类化合物整合到木质素中。在受RWASA2侵染的抗性品种Tugela-Dn5中，POD活性水平最高，其次是中度抗性的Tugela-Dn1，均高于对照组。然而，在感病型Tugela植株中，随着侵染时间延长，POD活性水平显著下降。本研究结果支持已有观点，即受RWASA2侵染的抗性小麦品种通过POD介导的木质素或木质素-半纤维素之间的交联作用来增强细胞壁结构6。POD发挥功能需要H2O2的参与，这表明其可通过调控细胞壁区域H2O2的水平，减少细胞壁结构碳水化合物的氧化或漂白作用。
采用不同的pH值和温度条件，以确定这些细胞壁结合酶的生化最适反应条件。结果显示，这些酶在酸性pH范围（pH 5）内具有最高活性，表明它们与细胞壁区域相关。β-1,3-葡聚糖酶在水解β-1,3-1,4-葡聚糖和β-1,3-葡聚糖底物时，其最适温度分别为25 °C和40 °C。该结果证实，在麦长管蚜（RWASA2）侵染期间，抗性小麦品种细胞壁区域诱导产生的β-1,3-葡聚糖酶与MLG特异性β-葡聚糖酶是两种不同的酶。尽管生化表征是发现或鉴定具有相似底物的不同酶的一种有前景的方法，我们仍建议使用其他更为繁琐但准确的技术，包括蛋白质印迹（western blotting）和酶谱分析（zymogram assays）。最后，由于缺乏MLG寡糖，我们未能定量分析MLG特异性β-葡聚糖酶的酶活性模式。然而，从受RWASA2侵染的Tugela-Dn5和Tugela-Dn1中提取的β-1,3-葡聚糖酶在LAM5、LAM4和LAM3上的活性更高，而来自感病型Tugela的酶则在LAM5和LAM4上表现出更高的活性。这证实，研究酶活性模式也有助于发现抗性与感病小麦品种在麦长管蚜侵染后所诱导产生的β-1,3-葡聚糖酶之间的细微差异。
本研究详细描述了从小麦叶片组织中提取细胞壁结合酶的方法。提取后，我们鉴定了三种细胞壁结合酶，分别为β-1,3-葡聚糖酶、MLG特异性β-葡聚糖酶和过氧化物酶（POD）。这些酶在感染RWASA2后表现出中度抗性的Tugela-Dn1和抗性品种Tugela-Dn5中的活性水平显著高于对照组。结果证实，细胞壁结合酶参与了抗性品种的防御反应。特性分析结果表明，细胞壁POD与β-1,3-葡聚糖酶在相同条件下发挥作用，提示二者在小麦与RWASA2互作过程中可能协同增强细胞壁结构。
目前已发现一些局限性，会影响本研究所讨论的现有方案。小麦植株数量不足可能导致可用于提取酶样品的叶片材料受限。如果在提取细胞壁酶之前未能成功从叶片样品中提取出质外体的内渗出液（IWF），则可能导致质外体酶与细胞壁酶混合。IWF与细胞壁区域酶的混合会使得难以研究那些结合在细胞壁中的细胞壁结合酶。在当前方案中未发现其他局限性。
披露
作者声明本工作中不存在利益冲突。
致谢
M. Mafa 获得了 NRF-Thuthuka（参考编号：TTK2204102938）的资助。S.N. Zondo 获得了南非国家研究基金会研究生奖学金，用于其理学硕士学位研究。作者感谢农业研究理事会—小粒谷物研究所（ARC-SG）为本研究提供了种子材料。本文所表达的观点、发现和建议均为作者（们）的观点，因此，资助方对此不承担任何责任。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 kDa 离心浓缩膜装置 | Sigma-Aldrich | R1NB84206 | 仅用于研究用途，不可用于诊断程序。用于生物溶液的浓缩与纯化。 |
| 2 g 壳二糖 | Megazyme（爱尔兰威克洛） | O-LAM2 | 高纯度龙胆二糖，用于科研、生物化学酶学检测及体外诊断分析。 |
| 3 g 壳三糖 | Megazyme（爱尔兰威克洛） | O-LAM3 | 高纯度龙胆三糖，用于科研、生物化学酶学检测及体外诊断分析。 |
| 3,5-二硝基水杨酸 | Sigma-Aldrich | D0550 | 用于还原糖的比色测定 |
| 4 g 层粘连蛋白四糖 | Megazyme（爱尔兰威克洛） | O-LAM4 | 用于研究、生化酶学检测及体外诊断分析的高纯度层四糖。 |
| 5 克层析五糖 | Megazyme（爱尔兰威克洛） | O-LAM5 | 高纯度龙胆五糖，用于科研、生物化学酶学检测及体外诊断分析。 |
| 95% 绝对乙醇 | Sigma-Aldrich | 107017 | 分析纯无水乙醇 |
| 乙酸 | Sigma-Aldrich | B00063 | 分析纯冰乙酸100%（含乙酸） |
| 偶氮-CM-纤维素 | Megazyme（爱尔兰威克洛） | S-ACMC | 多糖与雷马素艳蓝R染色，每约20个糖残基结合一个染料分子。 |
| β-葡聚糖（大麦） | Megazyme（爱尔兰威克洛） | G6513 | 一种水溶性较低的粉末状底物，用于测定 β-1,3-葡聚糖酶活性 |
| Bio-Rad 蛋白检测试剂 | 伯乐生命科学，南非 | 500-0006 | 用于Bio-Rad蛋白质测定试剂盒I和II的比色测定染料浓缩液 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Gibco 欧洲 | 810-1018 | 仅限实验室使用 |
| 柠檬酸 | Sigma-Aldrich | C0759 | 仅用于生命科学研究，不可用于诊断程序。 |
| CM-葡聚糖 | Megazyme（爱尔兰威克洛） | P-CMCUR | 用于测定的粉末状底物 β-1,3-葡聚糖酶活性。不溶于水。 |
| D-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270 | 仅用于生命科学研究，不可用于诊断程序。 |
| 愈创木酚 | Sigma-Aldrich | G5502 | 氧化指示剂。用于测定过氧化物酶活性。 |
| 过氧化氢 | BDH 实验室用品公司，英国 | 10366 | 强氧化剂 |
| Mikskaar 专业基质 | Mikskaar（爱沙尼亚） | NI | 基于泥炭藓的育苗基质 |
| 多元素复合肥（5.2.4（43）） | 多通道进样经典款 | B1908248 | 一种水溶性肥料，适用于对磷（P）需求较高的幼嫩生长期植物和幼苗，以确保根系的最佳发育。 |
| 萘酚 | 德国默克 | N2780 | 在催化剂存在下发生氢化反应。 |
| 苯酚 | Sigma-Aldrich | 33517 | 对光敏感。适用于 R&仅供研发使用，不可用于药品、家庭或其他用途。安全数据表（SDS）可提供 |
| 四水合酒石酸钾钠（罗谢尔盐） | Sigma-Aldrich | S2377 | 用于制备3,5-二硝基水杨酸溶液，该溶液用于还原糖的测定。 |
| 硅胶板（TLC 硅胶 60 F254) | Sigma-Aldrich | 60778-25EA | 硅胶基质，含254 nm荧光指示剂 |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | S8045 | 对于 R&仅供研发使用，不可用于药物、家庭或其他用途。 |
| 亚硫酸氢钠 | Sigma-Aldrich | 31448 | 在制备3,5-二硝基水杨酸溶液过程中作为抗氧化剂添加。 |
| 七水合磷酸氢二钠 | Sigma-Aldrich | S9390 | 在生物研究中用作缓冲溶液，以维持 pH 值恒定。 |
| 磷酸二氢钠七水合物 | Sigma-Aldrich | 71500 | 一种可溶于水的无机化合物，用作硅酸盐基灌浆材料开发中的试剂。 |
| 统计分析软件 | TIBCO Statistica | 版本 13.1 | |
| 硫酸 | 默克，德国达姆施塔特 | 30743 | 硫酸 95-97%，用于汞分析，ACS 级试剂 |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 10812846001 | 孵育混合物中的缓冲剂 它还被用作裂解缓冲液和TE（Tris-EDTA）缓冲液的组分。仅用于生命科学研究，不适用于诊断程序。 |
| 紫外–可见分光光度计 | GENESYS 120 | ||
| NI = 未鉴定。 |
参考文献
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