使用离体工作大鼠心脏模型评估供体心脏保存策略

摘要

我们描述了一种 离体 用于评估供体心脏保存策略的离体工作大鼠心脏方案。本文描述了啮齿类动物供体心脏静态冷保存的实验方案；然而，该方案也可用于循环死亡后捐献和脑死亡后捐献所获取的供体心脏。

摘要

优化供体心脏保存液在器官获取、运输和移植过程中对减少供体心脏缺血-再灌注损伤具有关键作用。本实验室先前的研究表明，在供体心脏保存液中添加硝酸甘油和促红细胞生成素可显著改善长时间冷保存以及循环死亡后捐献心脏的心脏功能恢复。该补充方案已在澳大利亚、比利时和英国的移植中心投入临床使用。本文概述了一种利用离体心脏灌注模型测试保存液补充策略的实验方案 离体 离体工作大鼠心脏（IWRH）灌注回路。利用该方法，可在长时间冷静态保存、脑死亡后捐献及循环死亡后捐献等供体心脏保存情境下，测试不同的补充干预策略。通过主动脉流量、冠状动脉流量、心输出量、脉压和心率等指标评估心脏功能恢复情况，可用于判断特定保存策略是否能够减轻供体心脏的缺血-再灌注损伤。

引言

心脏移植的成功在很大程度上受到供体心脏保存方法的影响。供体心脏在器官获取、运输和移植过程中会经历缺血性损伤。通过选择合适的供体心脏保存策略，可以减轻供体器官所受的缺血性损害。冷静态保存（CSS）目前仍是供体心脏保存最可行且最常用的方法；然而，CSS并不一定适用于所有类型的心脏捐献途径。例如，通过循环死亡后捐献（DCD）途径获取的心脏需使用常温机械灌注进行维持和活力评估，而通过脑死亡后捐献（DBD）途径获取的心脏则可采用CSS或低温机械灌注进行保存。另一个影响保存策略选择的重要因素是心脏在器官获取和运输过程中所经历的热缺血时间（对于DCD）或冷缺血时间（对于DBD）的长短。

许多中心采用额外的药物补充方法来增强心脏保存液的效果，以提高心脏对缺血的耐受性并改善移植后的心脏功能。本实验室的啮齿类动物研究表明，在心脏停搏液中添加促红细胞生成素（erythropoietin）和硝酸甘油（glyceryl trinitrate）可显著改善供体心脏在长时间低温保存后的 cardiac functional recovery^1,2。这些研究随后推进至猪的供体心脏保存实验，为将促红细胞生成素和硝酸甘油加入通过常温机械灌注（normothermic machine perfusion）途径获取的DCD供心的心脏停搏液中提供了临床前基础³

方案

所有动物均按照澳大利亚国家卫生与医学研究委员会（National Health and Medical Research Council, Australia）的指导原则接受人道护理。所有动物实验程序均经加文医学研究所动物伦理委员会（Garvan Institute of Medical Research, 澳大利亚悉尼）批准。

1. 克雷布斯-亨塞莱特（KH）缓冲液的制备

1. 配制2 L含有2.36 M NaCl、0.094 M KCl、0.024 M MgSO₄、0.024 M KH₂PO₄的20x KH缓冲液母液。分装至50 mL离心管中，于-20 °C保存。
2. 实验前，准备两个2 L的锥形瓶，分别装有1x KH缓冲液，每瓶包含1900 mL去离子水、100 mL 20x储存液KH缓冲液、4.20 g NaHCO₃（25 mM）和3.96 g葡萄糖（11 mM）。
   1. 将缓冲液锥形瓶置于37 °C水浴中，通过气石（带滑入式进气滤器）以碳酰气（95%氧气，5%二氧化碳，流速设定为2 L/min）通气5分钟，然后加入2.8 mL 1 M CaCl₂（1.4 mM）。实验开始前继续持续鼓泡至少1小时。 使用气石有助于缓冲液均匀充氧。
   2. 取少量缓冲液....

结果

基础灌注的结果将决定初始实验（储存前）是否成功。在Langendorff模式下显示的主动脉流量应介于14 - 22 mL/min之间。由于主动脉为逆向灌注，流量计上显示的Langendorff流量为负值。可接受的Langendorff曲线示例见图4A。

切换至工作模式后，待心脏状态稳定，主动脉流量应至少达到30 mL/min。初始阶段流量短暂上升至约50 mL/min，随后下降至约25 mL/min，再回升至稳定的基线主动脉流量，此过程属于正常现象。当基线参数达到满意水平（主动脉流量 > 30 mL/min，冠状动脉流量10–20 mL/min，心率200–300次/分钟）时，即可进行心脏储存。良好的基线记录示例见图4B。

根据所测试的保存液不同，一些心脏在长时间低温静态保存后可能无法获得良好的恢复效果，即使其基线状态极佳。图4C展示了一个在工作模式.......

讨论

鉴于心脏基础功能的敏感性，必须注意保持灌注装置的清洁，并使用兼容的组件。例如，必须使用正确的PVC管路。某些管路材料（如硅胶）可能导致主动脉流量和收缩力降低，这可能是由于氧气通过管路流失所致。尽管市面上已有独立的离体工作大鼠心脏灌注回路，但大多数此类系统主要用于兰格多夫（Langendorff）灌注。通常，在兰格多夫灌注模型中，可通过将球囊导管插入左心室来获取左心室舒张末期压力（LVDP）的功能测量值。然而，在兰格多夫灌注系统中无法直接测量原始主动脉流量和心输出量。离体工作大鼠心脏（IWRH）方案的一个主要优势在于，无需对心脏进行额外干预（如插入球囊导管），即可获得主动脉流量和心输出量的功能测量数据。目前存在商用的大鼠工作心脏灌注系统，尽管这些系统可根据具体研究需求进行定制，但通常成本较高。

在灌注过程中，为确保啮齿类动物心脏的最佳基础功能，实验方案中存在若干关键步骤。KHB缓冲液的储备溶液配制时间不得超过4周。灌注管路在预充时必须完全排除任何气泡。插管左心耳时需格外小心。过度操作组织可能增加撕裂风险，同时也可能加重心脏的功能性应激反应。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 无色 Eppendorff 管，每盒 1000 个	Bio Strategy Pty Ltd	0030.125.150
15 mL 离心管（S）套/25 个聚丙烯箱/500 个	Sigma-aldrich Pty Ltd	CLS430791-500ea
血压换能器/电缆套件	ADInstruments	MLT1199	数据采集
桥式放大器	ADInstruments	FE221	数据采集
Carbogen 555G2	BOC	BOC002
Checktemp1 温度计	Hanna Instruments	HI98509	装置构建
夹钳，夹持直径 1/4-7/16 英寸，12 个/包	Thomas Scientific	2848Y40	装置构建
带延长杆中号夹钳	Thomas Scientific	8847T08	装置构建
带延长杆小号夹钳	Thomas Scientific	8847T02	装置构建
血管夹，60 g 压力	Coherent Scientific	14121	手术设备
封闭式连接器	Thomas Scientific	8847E25	装置构建
Covidien Sofsilk 2-0 黑色预剪 45 cm，每盒 24 根	Specialist Medical Supplies	S195	手术耗材
定制 250 mL 夹套式脱气装置	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	装置构建
定制 750 mL 储液罐	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	装置构建
D-(+)-葡萄糖无水物 SigmaUltra	Sigma-aldrich Pty Ltd	G7528-1Kg	用于配制 Krebs 缓冲液
双通道控制台	ADInstruments	TS402	数据采集
2 L 锥形瓶
微孔滤膜，GF/C 型玻璃纤维，47 mm，100 片	Bio-strategy Pty Ltd	1822047
镊子，15 cm，0.3 mm，弯型	Coherent Scientific	14114	手术设备
四爪夹钳，臂长 9 mm × 115 mm，用于夹持直径 2–70 mm 的物体，表面覆乙烯基	Met-App Australia Pty Ltd	1352	装置构建
加热循环器，数字固态控制（1020 瓦/240 伏）	Thermoline Scientific	TU3	装置构建
肝素 5000 U/5 mL，每盒 50 支，Pfizer 02112115	Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd	1258693	药品
Ilium Xylazil 20 注射液 50 mL	Cenvet Australia Pty Ltd	X5010	麻醉剂
约翰·霍普金斯 Bulldog 夹	Coherent Scientific	CS-WPI-14117
氯胺酮 100 mg/50 mL	Provet (NSW) Pty Ltd	KETAI1	麻醉剂
七水合硫酸镁 AR 级 500 g Chemsupply	Bio Strategy Pty Ltd	MA048-500g	用于配制 Krebs 缓冲液
公/母铰接式适配器	Thomas Scientific	8847V08	装置构建
Masterflex L/S 易装泵头，用于精密管路，PPS 材质，CRS 转子	John Morris	1015164	装置构建
梅岑鲍姆剪刀，11.5 cm 弯型	Coherent Scientific	WPI-501748	手术设备
梅岑鲍姆剪刀，14.5 cm 直型	Coherent Scientific	WPI-501252	手术设备
双头泵用不锈钢安装硬件	John Morris	1014414	泵头安装螺丝
开口式连接器	Thomas Scientific	8847E05	装置构建
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148-500G	样品处理
氯化钾（AnalaR NORMAPUR）500 g	VWR Chemicals	26764.26	用于配制 Krebs 缓冲液
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich Pty Ltd	P5379-500g	用于配制 Krebs 缓冲液
Powerlab 2/26，双通道记录仪 + Labchart 软件	ADInstruments	ML826	计算机硬件与软件
Precision XN 内联流量传感器，3.2 mm（1/8"）内径 ME4PXN-KR37 XF	ADInstruments	ME4PXN	装置构建
一次性手术刀柄及刀片 #11，10 个/包	BSN Medical (Aust) Pty Ltd	73252-36
Swinnex 47 mm 硅胶垫圈，5 个/包	Merck Millipore	SX0004701	装置构建
硅胶 O 型圈 5-329，10 个/包	Merck Millipore	XX1104707	装置构建
单 buret 夹	Thomas Scientific	8847T32	装置构建
插入式进液滤器，孔径 10 µm（鼓泡器）	Sigma-aldrich	59277	装置构建
小型 360° 旋转连接器	Thomas Scientific	8847E35	装置构建
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich Pty Ltd	S6297 - 250g	用于配制 Krebs 缓冲液
Swinnex 滤器支架，47 mm	Merck Millipore	SX0004700	装置构建
1 mL 注射器，每盒 100 支	Becton Dickinson Pty Ltd	302100
三爪夹钳，臂直径 9 mm，臂长 125 mm，带双螺钉，用于夹持 5–80 mm 物体	Met-App Australia Pty Ltd	1356	装置构建
管路流量计模块 TS410	ADInstruments	TS410	数据采集
PVC 管，内径 6.35 mm × 外径 9.52 mm，50 英尺卷（15.24 m），透明，不含 DEHP 邻苯二甲酸盐，食品级，符合 REAC 标准	Thermo Fisher	NAL 8701-0600	装置构建
PVC 管，内径 7.94 mm × 外径 11.1 mm，50 英尺卷（15.24 m），透明，不含 DEHP 邻苯二甲酸盐，食品级，符合 REAC 标准	Thermo Fisher	NAL 8701-0900	装置构建
PVC 管，内径 9.52 mm × 外径 12.7 mm，100 英尺卷	Thermo Fisher	NAL 8701-4120	装置构建
Vannas 剪刀，8.5 cm，直型，7 mm 刀片	Coherent Scientific	WPI-500-086	手术设备
30 升水浴锅，带悬浮托盘	Thermoline Scientific	TLWB-30	装置构建