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使用泥蛉幼虫作为非常规生物监测器评估地表水与环境健康状况

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DOI：

10.3791/66911

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2024年7月26日

 ,  ,  , 
1Posgrado en Hidrociencias, Colegio de Postgraduados, 2Instituto Politécnico Nacional, Laboratorio de Evaluación de la Salud de los Ecosistemas Acuáticos, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, 3Instituto Politécnico Nacional, Coordinación Politécnica para la Sustentabilidad

本文内容

摘要

本方案描述了利用生物标志物对水生生态系统中有害影响进行早期检测的方法。这些生物标志物与哨兵性状密切相关，其变化有助于识别早期预警性损伤。

摘要

Corydalus 属的鱼蛉幼虫，通常被称为地狱虫（Hellgrammites），以其显著的体型、广泛的分布范围以及长达一年的不成熟期而著称。已明确的是，地狱虫对污染和栖息地结构变化具有敏感性。鉴于这些独特特征，采用 Corydalus texanus 幼虫作为可靠的生物监测工具，可用于评估水生生态系统的生态完整性。本实验方案旨在提供对 C. texanus 进行评估所需的必要工具，并通过一个案例研究展示其有效性。研究结果具有实际意义，表明 C. texanus 幼虫对采矿污染具有早期预警响应能力，能够大量生物富集锌（Zn）、铁（Fe）和铝（Al）等重金属。C. texanus 种群的存在或缺失可作为识别生态系统健康潜在问题的有效指标。这种非常规方法已在受采矿影响的地点显示出污染的早期预警信号，凸显了及时采取环境保护措施的必要性。鉴于其独特的生物学特性，强烈建议将 C. texanus 幼虫作为一种可靠的非常规生物指示物种加以利用。

引言

鱼蛉幼虫是脉翅目（Megaloptera，Latreille，1802）的昆虫幼虫，成虫阶段被称为斑鱼蛉或鱼蛉。这类水生生态系统中的顶级捕食性昆虫幼虫种类较少但分布广泛1。鱼蛉物种出现在明确的生物地理区域中，因此即使不具备较高的分类学知识，也相对容易进行物种鉴定。其中，齿蛉科（Corydalidae）幼虫是脉翅目中体型最显著的物种（体长20–90 mm）2，使得鱼蛉幼虫肉眼清晰可见。

泥蛉幼虫在水生生态系统中作为捕食者发挥着关键作用，其强大的存在感源于发达的大颚，显示出显著的掠食性形态特征。其身体背腹扁平，体侧具有7至8对丝状鳃，头部囊壳每侧有六个单眼，这些特征使泥蛉幼虫成为昆虫学家和爱好者感兴趣的研究对象3。齿蛉科成虫因体型显著而令人印象深刻，容易引起人们的注意；然而，它们完全无害。值得注意的是，泥蛉幼虫在其幼虫阶段能够在水生环境中长期存活。

泥蛉幼虫的表型特征使其在突出其水生生态系统作用方面具有独特优势；然而，对水生生态学家而言，其指示生物潜力才是最受关注的特性。大量研究强调了泥蛉幼虫作为生物指示剂的潜力，因为它们的出现通常与栖息地良好的生态健康状况相关，这源于它们对地表水中有机污染的高度敏感性4,5,6,7,8。

大多数齿角蛉科（Corydalidae）的广翅目幼虫生活在以砾石和卵石为主要基质的急流生境中，如 riffles（浅滩急流），但泥蛉幼虫（hellgrammites）也出现在具有残枝和沙质基质的缓坡溪流中，以及湖泊等静水生境中3,9,10。其广泛的分布范围反映了作为顶级捕食者的关键特征，以及通过有效的生活史策略成功定殖多种生境的能力11。泥蛉幼虫的生物学特征与水生生态系统的动态密切相关；因此，除腹部成对的气管鳃外，还具备通过气门进行空气呼吸的适应性机制，这正是齿角蛉科典型的生存策略之一10。

齿蛉幼虫栖息于特定生态系统中，并对偏离既定模式的变化表现出快速响应，因而可作为早期预警系统7。这些野生动物的反应可被用作评估污染物对水生生态系统影响的有效工具，尤其适用于非靶标污染物混合物的情况。尽管生态系统中某些化学物质的单一毒性已导致对生物体的有害效应被识别，但污染物混合物的影响仍需进一步明确。齿蛉幼虫提供的早期预警反应可能有助于识别有害效应，即使在污染物单独作用时仅达到无可观察效应浓度（NOEC），或在多种污染物共同作用下产生影响时，仍可为评估污染物混合物的生态影响提供参考依据12。

已有多种模式生物被用于急性和慢性实验测试；然而，这些生物通常在受控条件下进行培养和维持13。受控条件使它们难以识别所接触的多种污染物的非靶标效应。此外，由于污染物混合物的复杂性，无观察效应浓度（NOEC）常难以确定。因此，在过去几十年中，具有非靶标效应的非模式本地物种被认可用于筛选系统，这对开展生态毒理学研究至关重要14。因此，泥蛉幼虫似乎可用于评估污染对水生生态系统的有害影响。其生物学、遗传学和生理学等特征使非模式生物成为生态系统影响评估的合适对象14。

本方案旨在利用一种非模式生物建立一种新型生物监测工具，以检测非靶向污染物混合物引起的早期预警信号。为了获得最佳结果，在分析中已全面考虑并整合了模式物种C. texanus幼虫所表现出的生物学特征15。

方案

包含样本采集和环境分析在内的七步生物监测流程图。
图 1：使用非常规生物监测物种 Corydalus texanus 在水生生态系统中实施监测的快速分步指南。 请点击此处查看此图的放大版本。

1. 野外工作

  1. 确定位于污染源上游和下游的研究点位，这些点位存在疑似或明显的污染影响（即点源或非点源排放）。
    注：本方案共包含四条主要河流中的15个研究点位：1）埃克斯特拉兹河（点位 PB、EZ、RQ、BC）；2）埃斯卡内拉-哈尔潘河（ES、EN、AH、JL、PI、PA）；3）阿尤特拉河（AY）；4）圣玛丽亚河（SM、AT）。
  2. 寻找并确定至少一个参考点位（即受干扰极小或无干扰的地点），并将其定义为研究点位。
    注：在本研究中，点位 BC、ES、SM、AY 和 AT 被视为参考点位。
  3. 识别某些有助于提高发现 C. texanus 个体概率的生境特征，包括砾石底质、坡度较陡的岩石生境、高速水流、溶氧充足的水体、高冠层密度，以及高原和低地生境。
  4. 封闭一段100米长的溪流，以识别适合生物监测的生境16。
  5. 进入溪流中采集样本。
  6. 在急流区、卵石区、清水区域及碎屑堆积处等生境中，使用孔径为500 µm的踢网，采集至少六只 C. texanus 个体。
  7. 沿水流方向翻动石块，并将幼虫转移至网中。
  8. 小心操作装有采集幼虫的踢网，并将其转移至指定的临时存放瓶中。操作时应谨慎，将网边向内折叠，以防幼虫丢失。
  9. 使用游标卡尺测量所采集幼虫的头宽，以鉴定其为九至十一龄幼虫（头宽范围为6 mm至10 mm）。
  10. 将幼虫浸入装有溪水的瓶中，静置30分钟，进行肠道净化。
  11. 将样本放入带有清晰标签的塑料瓶中，随后通过浸入液氮（-75 °C）的低温罐中实施安乐死。
  12. 将样本妥善运输并在实验室超低温冰箱中于-45 °C条件下保存。
  13. 使用聚乙烯瓶采集200 mL溪水样本，加入1 mL硝酸，并在4 °C条件下保存，用于后续实验室中重金属含量的定量分析。

2. 样品幼虫的解剖与组织分离

  1. 将塑料解剖托盘置于冰上，待其温度降至 4 °C，使用温度计进行确认。
  2. 从超低温冰箱中取出样品，放置于解剖托盘上，开始进行解剖。
  3. 选取目标组织：肌肉、分支组织、神经管和外骨骼。
  4. 使用陶瓷刀切除头部，并小心分离各组织。沿纵轴切开身体，去除两侧的鳃组织。
  5. 使用较小的陶瓷刀分离外骨骼，并清除多余组织。将外骨骼放入烘箱中，在 80 °C 下干燥 48 小时。
  6. 达到规定时间后，将干燥的外骨骼保存，以备后续分析。
  7. 在低温条件下持续清洗软组织，用于后续的微量分析。
  8. 使用小型陶瓷刀从脂肪中提取软组织。将来自同一采样点的个体样本中各目标组织分别分离并合并。
  9. 将每种类型的组织分别储存于 2 mL 微量离心管中，整个过程需保持低温条件。
  10. 为制备每种目标组织，称取 100 mg 组织，加入 1 mL pH 为 7.4 的 PBS 溶液。使用单手组织匀浆器对每种组织进行匀浆。通常，软组织需进行三个循环，每个循环 10 秒。
  11. 在 4 °C 条件下，以 1,000 x g 离心 5 分钟。将上清液转移至 1 mL 微量离心管中。
  12. 进行生物标志物微量分析。

3. 重金属定量

  1. 使用分析天平称取至少六个处于指定发育阶段的标本的干燥外骨骼，总重量为 250 mg。
  2. 将外骨骼置于玻璃研钵中研磨，直至成为细粉。向粉末反应容器中加入 250 mL 超纯硝酸。
  3. 将样品转移至消解微波系统中，在 180 °C 下加热 30–45 分钟以完成消解。
    注意：应根据微波炉品牌选用合适的微波安全容器，以确保样品加热的安全性和有效性。不同品牌的微波炉对组织样品的消解时间有所差异，通常为 30–45 分钟。部分品牌提供标准化的消解程序。
  4. 按照 EPA3015A 方法对水样进行微波消解，取 45 mL 水样并加入 5 mL 硝酸。
  5. 采用电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-OES）测定消解后样品（水样和组织样品）中的重金属和类金属，包括 Hg、Cu、Pb、Zn、Fe、Cr、Cd、Mn、Ba 和 As。
    注意：使用纯度为 5 级的氩气及各金属和类金属的标准溶液绘制校准曲线。

4. 氧化应激与生物标志物评估的微量检测方法

  1. 配制试剂
    1. 混合6 g NaH2PO4 用1000 mL超纯水溶解，配制成50 mM磷酸一氢缓冲液。置于2–8 °C烧瓶中长期保存。
    2. 配制8.1% SDS溶液：将450 mg十二烷基硫酸钠（SDS）溶于5 mL超纯水中，现用现配。
    3. 将2 mL三氯乙酸（TCA）溶于8 mL超纯水中（根据需要现配现用）。
    4. 将100 mg四丁基铵（TBA）溶解于10 mL超纯水中（根据需要现配现用）。
    5. 配制50 mM PBS pH 7.8，需溶解97 mg Na2HPO4 和 59 mg 的 NaH2PO4 在10 mL超纯水中，然后使用NaOH调节pH至7.8以升高pH，或使用HCl降低pH。
    6. 将8 mg牛过氧化氢酶溶解于40 µL超纯水中，配制成200 µg/mL的溶液（根据需要新鲜配制）。
    7. 配制50 mM TRIS/5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）溶液：将6.05 g三（羟甲基）氨基甲烷（TRIS）和0.073 g EDTA加入45 mL超纯水中，用HCl调节pH至7.6，4 °C保存备用。
    8. 对于0.1 M还原型谷胱甘肽（GSH）（用于45个重复样品），称取0.0184 g GSH，溶于600 µL 10 mM HCl中。
    9. 配制10 mM HCl，将0.5 µL浓盐酸加入599.5 µL超纯水中。
    10. 向 1.4 mL 的 0.1 M TRIS/HCl 0.5 mM EDTA pH 8.0 溶液中加入 28.5 µL 谷胱甘肽还原酶。
    11. 将 1.211 g TRIS 和 0.0146 g EDTA 与 90 mL 超纯水混合，配制 pH 8.0 的 0.1 M TRIS/HCl 和 0.5 mM EDTA 溶液。如需调节 pH，可加入 HCl。该溶液可在 2–8 °C 长期保存。
    12. 称取 0.075 g NADPH，加入 2.25 mL 1% NaHCO₃ 溶液3 1 mM EDTA
    13. 将1 g NaHCO₃与3 将0.0282 g EDTA溶于100 mL超纯水中，配制1% NaHCO₃和1 mM EDTA溶液。将该溶液储存于4–8 °C，保存时间不限。
    14. 将2 µL叔丁基过氧化氢与2 mL超纯水混合，配制成7 mM溶液。临用前立即混合。
    15. 将1 g牛血清白蛋白（BSA）与1 mL超纯水混合，配制成1 µg/µL的储存液。
  2. 硫代巴比妥酸反应物（TBARS）（脂质过氧化，LPO）17
    1. 向1 mL微量离心管中加入5 µL组织上清液，再加入45 µL 50 mM PBS（新鲜配制的储存液）。
    2. 加入12.5 µL 新鲜配制的8.1% SDS。加入93.5 µL 新鲜配制的20% TCA（pH 3.5）。
    3. 加入93.5 µL 1% TBA（现配），再加入50.5 µL超纯水定容。盖紧管盖，涡旋振荡30秒。
    4. 用针头刺穿微量离心管管盖，并在沸水中孵育10分钟。
    5. 将离心管于室温（RT）冷却，然后在1000 x g条件下离心 g 10 分钟。
    6. 向96孔微孔板中的一个孔加入150 µL上清液，使用微孔板分光光度计在530 nm处测定吸光度。
    7. 为定量脂质过氧化物，使用丙二醛双（二甲基缩醛）按所述方法绘制8点TBARS标准曲线（0–160 µM） 表1根据组织类型或预期损伤程度调整丙二醛（MDA）标准曲线。
    8. 以 nmol MDA eq·mg 表示结果−1 蛋白
  3. 超氧化物歧化酶抗氧化酶微量测定（SOD）18
    1. 使用96孔板。取两孔加入147 µL 1 M TRIS/5 mM HCl EDTA pH 8作为空白对照。其余各孔分别加入144 µL 1 M TRIS/5 mM HCl EDTA pH 8，每组设两个复孔。
    2. 从上清液中取 3 µL 加入样本孔中。轻轻吹打数次以混匀板内液体。
    3. 在30秒内向每孔加入3 µL 10 mM焦性没食子酸。立即轻轻混匀。
    4. 在 420 nm 和 25 °C 条件下，测定 T0（时间 = 0 s）和 T10（时间 = 10 s）时的吸光度。
    5. 使用以下公式，通过计算样品中对邻苯三酚抑制的百分比来测定SOD：
      Absorbance calculation formula, spectroscopic analysis, x% equation, diagram, educational use.
      何处
      x% = 样品中SOD对焦性没食子酸氧化的抑制百分率；因此，焦性没食子酸的氧化程度等于100 - x%
      注意：SOD 活性的计算基于 1 IU 定义为抑制 50% 焦性没食子酸氧化反应的体积，具体方法如下所述：
      Mathematical formula for calculating y, illustrating percentage calculation in data analysis context.
      何处
      y 样品体积（毫升）（抑制50%的焦棓酚）
      50% = 焦性没食子酸抑制率等于1单位SOD
      0.003 = 样品的体积（单位：毫升）
      100 - x% = 样品对焦性没食子酸的抑制率（百分比）
    6. 最后，利用以下公式测定SOD活性：
      SOD calculation formula; equation for enzyme activity; biochemistry analysis; formula diagram.
      SOD = 每微克蛋白质中SOD的国际单位活性
      Y = 抑制50%焦性没食子酸反应的样品体积
      100 = 从分升转换为毫升的换算系数。
      蛋白 Bradford 定量法测得的蛋白浓度以微克每毫升表示；需除以 10 转换为克每分升
  4. 过氧化氢酶抗氧化酶微量测定（CAT）19,20
    1. 使用96孔微孔板。每孔加入20 µL样品上清液（设两个复孔）。
    2. 加入20 µL新鲜的过氧化氢酶（200 µg/mL）至标准品孔（设复孔）。向样品孔和空白孔中各加入100 µL 50 mM pH 7.8的PBS。
    3. 加入 100 µL 90 mM (30%) H2O2 加入孔中以启动反应。加入 H2O2，于240 nm处每15秒读取一次吸光度，持续2.5分钟。
    4. 使用以下公式计算活性：
      Equation of slope calculation for absorbance change over time; absorption kinetics analysis.
      Static equilibrium formula; units of enzyme activity; calculations; slope/min over 43.6 times I.
      Protein quantification formula, U·mg^−1 calculation equation.
      Dilution factor equation, U·mL⁻¹ = U x dilution factor, relevant to chemical analysis calculations.
      Catalase activity equation in enzyme kinetics; formula for determining CAT (U·CAT·mg⁻¹).
  5. 谷胱甘肽过氧化物酶微量测定法（GPx）21
    1. 使用96孔微孔板。
    2. 将240 µL 0.1 M GSH溶液、1 200 µL 10 U/mL GSH-Rd溶液和1 200 µL 4 mM NADPH混合。将溶液置于冰上保存。
    3. 向各孔中加入 100 µL 50 mM TRIS/HCl 5 mM EDTA pH 7.6。每个样品取 1 µL 上清液，重复加入两份。轻敲微孔板并轻轻混匀。
    4. 加入50 µL混合溶液（步骤4.5.2），轻轻混匀。
    5. 向孔中加入 20 µL 7 mM 的叔丁基过氧化氢溶液以启动反应（在 16 个重复样品中，反应启动时间约为 15 秒）。迅速混匀微孔板。
    6. 在25 °C下，于340 nm波长处每隔1分钟监测一次吸光度，持续5分钟。
    7. 使用以下公式计算 GPx 活性：
      Enzyme activity formula for GPx involving absorption rate at 340 nm; biochemical analysis.
      何处
      GPx = 每微克蛋白质每分钟毫摩尔的活性
      ΔAbs340/分钟= delta 中的平均吸光度
      103 摩尔浓度到毫摩尔浓度的换算
  6. mg prot = 根据Bradford法测定的蛋白浓度，单位为微克每微升
    1. 考马斯亮蓝法蛋白质定量分析22
    2. 使用牛血清白蛋白（BSA）溶液进行标准曲线测定，从1 µg/µL的储备液配制系列浓度，如下所示 表 2.
    3. 使用96孔微孔板。在样品孔和标准品孔中各加入190 µL Bradford试剂。
    4. 在标准孔中每孔加入10 µL BSA，设复孔。在样品孔中每孔加入10 µL上清液，设复孔。
    5. 用移液枪头轻轻混匀。
    6. 在595 nm处读取吸光度。利用标准曲线定量蛋白质浓度。

结果

研究结果表明，重金属（特别是铝（Al）、铁（Fe）和锌（Zn））对环境具有不利影响，如图2所示。在所有采样点采集的组织和水样中均检测到高水平的重金属，导致了不良后果。在采矿活动密集的区域（如Extoraz河的PB、EP、RQ和BC点位，见图3），发现异常值，其生物富集因子（BAF）高达600。值得注意的是，在某些锌浓度异常高的研究点位（如PB点位），未能找到C. texanus的样本，这表明其生物富集阈值可能已被超过。

比较金属铝、铁、锌的生物浓缩因子（BAF）的箱线图；数据分布分析。
图 2：在15个研究样点采集的 Corydalus texanus 个体中测定的生物富集因子（BAF）箱线图。 铝、铁和锌的生物富集因子（BAF）是根据水样和 C. texanus 个体外骨骼的分析结果计算得出的。请点击此处查看该图的放大版本。

由于SGBR是受保护的自然区域，必须确保不会发生可能影响哨兵生物的环境变化。然而，氧化应激生物标志物的响应呈现出梯度差异（图3）。根据评估，细胞膜损伤程度最低的采样点为EN、SM和CN，其脂质过氧化（LPO）水平较低。这些位点的超氧化物歧化酶（SOD）活性也处于较低水平，而SOD是机体抵御氧化应激的主要酶类。这表明这些区域的氧化应激程度极低，因此可考虑实施不影响哨兵生物的干预措施。相比之下，在EP、RQ、BC和ES等位点，谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性显著降低，且这些位点记录到较高的LPO水平。该结果提示，该生物正响应主要由采矿活动引起的胁迫环境。通过对该特定生物体内早期预警标志物的评估，发现某些位点受到的影响程度较低，而另一些位点则较高。这些发现充分展示了利用该物种作为非传统哨兵生物的有效性。

肺蛋白位点；Kruskal-Wallis 检验 p 值：脂质氧化、SOD、GPX；箱形图。
图 3：在旱季和雨季期间，墨西哥盆地（ Sierra Gorda 生物圈保护区）三条主要河流的15个采样点采集的Corydalus texanus样本中所评估的生物标志物反应的箱形图。 通过三种生物标志物测量反应：（A）脂质过氧化水平（LPO），反映细胞早期损伤；（B）一线细胞防御抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）的抗氧化反应；以及（C）谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）介导的细胞防御抗氧化反应。红色箭头表示未采集到生物监测个体或样本数量极少的情况，该情况仅出现一次。请点击此处查看该图的放大版本。

试管200 µM MDA 双体 (µL)超纯水 (µL)MDA 双体浓度 (µM)
1010000
212.5987.52.5
3259755
45095010
510090020
620080040
740060080
8800200160

表1：构建MDA浓度曲线所需的MDA浓度。

浓度 (µg/µL)储存液 (µL)超纯水 (µL)
0050
0.1545
0.21040
0.42030
0.84010
1500

表2：用于蛋白质定量曲线的BSA浓度。

讨论

尽管使用C. texanus是进行评估的最佳选择，但仍需考虑其使用与采集过程中的若干方面。所选研究地点往往因多种因素而具有挑战性，例如不利的天气条件、地理上的难以接近、高干旱水平，或所选区域安全措施不足。上述限制和局限性在开展野外工作时常会带来困难。在评估特定区域，尤其是热带溪流区域时，获取样本可能较为困难。尽管为此遵循了Barbour23的指导原则，但由于某些生态系统的独特特征，适应性调整方案仍可能存在障碍。如前所述，在热带流水环境中采集样本会因区域性和局部性因素而面临多种挑战。这些因素包括环境异质性高、基质变异大、集水区特征、河道宽度、深度、水流速度、河岸植被，以及广泛的理化条件差异24。因此，获得大小一致的样本个体往往具有挑战性，因为其自然生长受到上述因素范围的影响，尤其对季节性变化具有响应。因此，标准化其个体大小可能是一项复杂的工作。野外工作顺利完成之后，后续的实验室操作将得以顺利开展，从而支持进一步的分析。

C. texanus 的早期预警评估实施已证明其在反映水生生态系统影响方面的可行性。在此方面，将水生大型无脊椎动物识别为人类活动影响的可靠指标已被证实是一种切实可行的方法25,26。本研究表明，C. texanus 是一种高效且非传统的模型，可用于快速评估环境状况。在本研究中，C. texanus 表现出对采矿活动所致重金属污染的不同响应。栖息地改变的叠加效应进一步表明 C. texanus 具有高度敏感性。尽管研究区域存在采矿活动的证据，但传统的污染指标（如 Rico-Sanchez 等人27计算的多样性指数）未能识别出核心区域或保护区域中重金属污染的影响。然而，在位于核心区域的 BC 或 SM 等地区已观察到变化。尽管自然保护区在保护方面具有成效，但关于 C. texanus 的研究结果表明，损害的早期预警信号已在未被察觉的情况下发生。应倡导将非常规且本土的动物类群纳入各国的研究方案及未来法规中，特别是在热带地区，那里的河流生态系统与温带地区存在显著差异28。使用 C. texanus 等非常规生物监测物种有助于提高研究结果的准确性和相关性，并加强针对这些重要物种及其栖息地的保护工作。

研究表明，Corydalus sp. 对人类活动造成的多种影响（例如土地利用变化和农药使用等农业影响）具有高度敏感性，这一点在菲洛博博斯河（位于墨西哥湾流域方向）中已有观察证实7。该研究强调了钙在诱导Corydalus sp. 产生应激反应中的重要作用，原因是在菲洛博博斯河异常硬化的水体条件下，脂质过氧化（LPO）水平显著升高。这些发现与本研究结果共同证实了Corydalus属在评估热带间带水域生态系统中的有效性。然而，在对特定水生生态系统进行评估之前，必须事先了解研究区域的基本情况。通过开展全面分析，应确定最优的研究地点，以获取最广泛且完整的数据。

实验工作的有效性在很大程度上依赖于采用适当的采集技术。在进行解剖时，采集较大的标本可能更有利，因为可获得更丰富的软组织和外骨骼用于分析。然而需要注意的是，季节性变化可能影响脂肪组织的积累，从而在时间序列研究中增加软组织与外骨骼分离的难度。在此类情况下，建议重点关注每个个体的鳃组织及可获取的肌肉组织。获取足够数量的个体可能构成一项关键挑战。由于上述变异因素的存在，获得足量组织以评估重金属含量及生物标志物反应可能更加困难。本研究即展示了这一情况的实例：由于无法对来自SGBR的样品进行过氧化氢酶（catalase）的检测。在本实验方案之前，过氧化氢酶的检测需要大量组织；然而，本方案所提出的方法显著降低了过氧化氢酶检测所需的最小组织量。

本实验方案提供了一种利用水生生态系统中常见的泥龙幼虫对生态完整性进行可行评估的适宜机会。该方法可为识别点源污染或人类活动的间接有害影响提供关键信息，从而及时向利益相关者、生态学家及水生科学研究人员提供数据支持。尽管当前方案的成本已显著降低，但由于需要多种试剂和专用设备，其费用仍然相对较高。此外，对专用设备的需求也限制了能够开展完整检测的地点数量。

披露

作者声明其工作中不存在利益冲突。

致谢

作者谨向CONAHCyT致以诚挚的谢意，感谢其提供FONINS P 1931项目资助，该资助极大地促进了本研究工作的开展。同时，作者也感谢墨西哥国立理工学院研究与研究生事务秘书处（Secretaría de Investigación y Posgrado at Instituto Politécnico Nacional）通过SIP项目资助（20200577）所提供的宝贵支持。此外，第一作者特别感谢CONAHCyT提供的慷慨的研究生奖学金，使研究团队得以开展野外考察并收集关键数据。最后，作者谨向María Teresa García Camacho在实验室中提供的不可或缺的帮助表示衷心感谢，若无她的协助，本项目将无法完成。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
220 克分析天平OhausPR224/E该天平适用于称量从样本中提取的组织。
涉水裤LaCrosse700152M我们建议在采样时使用涉水裤。或者，您也可以使用带橡胶高腰靴的靴子进行采样。
砧板TrueTRUE915121建议使用白色塑料砧板。
镊子DR Instruments112建议使用由不锈钢制成的 12 英寸镊子。
电感耦合等离子体-光学发射光谱系统Perkin Elmer7300 DV一种利用光谱法定量重金属的设备。
踢网LaMotte0021-P制作踢网的另一种方法是使用厚度为 500 微米的网眼材料手工制作。
液氮 NANANA
液氮杜瓦静态低温容器BestEquipDF0504建议使用带罐体的铝制储罐。
研钵和研杵套装Cole-ParmerEW-63100-54该瓷制研钵和研杵用于研磨干燥组织。
Multiwave GO PlusAnton PaarC93IP001EN-EMultiwave 是用于消解多个样品的有用工具。
干燥用烘箱Fisher scientific506G培养烘箱，也称为干燥组织烘箱，对于在至少 80°C 的温度下干燥组织至关重要。
精密手术刀Xcelite by Weller037103-48768建议使用铝制手术刀。
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超低温立式冷冻柜REVCOCA89200-384许多公司提供冷冻柜，但建议选择储存温度至少为 -40°C 的型号。
广口塑料瓶United Scientific81900强烈建议使用带有宽盖和广口的聚丙烯瓶。

参考文献

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