本文介绍了通过使用针对鸡GSDME的N端片段（chGSDME-NT）和碘化丙啶（PI）的抗体进行双重染色后，利用流式细胞术鉴定发生焦亡的细胞。
本文内容
摘要
摘要
焦亡是一种由炎性介导的程序性细胞死亡，主要由Gasdermin（GSDM）家族蛋白经切割后产生的N端片段在细胞膜上形成孔道所驱动。通过Western Blot检测膜结合型GSDM-NT是评估焦亡最常用的方法。然而，该方法难以区分发生焦亡的细胞与其他形式的细胞死亡。在本研究中，采用传染性法氏囊病毒（IBDV）感染的DF-1细胞作为模型，利用针对鸡GSDME N端片段（chGSDME-NT）的特异性抗体结合碘化丙啶（PI）染色，通过流式细胞术定量分析发生焦亡的细胞比例。使用Alexa Fluor 647标记的抗chGSDME-NT抗体，可通过流式细胞术清晰检测到chGSDME-NT阳性的细胞。此外，IBDV感染细胞中chGSDME-NT/PI双阳性细胞的比例（约33%）显著高于模拟感染对照组（P < 0.001）。这些结果表明，通过流式细胞术检测膜结合型chGSDME-NT是鉴定细胞死亡过程中焦亡细胞的有效方法。
引言
焦亡是一种炎症性的程序性细胞死亡，主要依赖于哺乳动物中Gasdermin（GSDM）D在细胞膜上形成孔道1,2,3。由于鸡缺乏GSDMD基因4,5，鸡体内焦亡的机制仍不清楚。Gasdermin家族包含一系列保守蛋白，如GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME和DFNB593,6。已有研究报道，来自硬骨鱼类和鸭子的GSDME可被caspase-1/3/7或caspase-3/7切割，从而诱导焦亡性细胞死亡7,8。然而，GSDME介导的焦亡在鸡抵抗病原体感染的宿主反应中的作用仍有待阐明。
传染性法氏囊病（IBD）是由传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的一种急性、高度传染性且具有免疫抑制性的家禽疾病9传染性法氏囊病病毒（IBDV）是一种无包膜的双链RNA病毒，基因组分为两个片段，属于双RNA病毒科（Birnaviridae）禽双RNA病毒属（Avibirnavirus）。10先前其他研究团队及本实验室的研究表明，传染性法氏囊病病毒（IBDV）感染可诱导宿主细胞发生细胞死亡 通过 不同的通路11,12,13,14先前的研究结果表明，传染性法氏囊病病毒（IBDV）感染会引发乳酸脱氢酶（LDH）的释放，后者是溶细胞性细胞死亡的标志物6,15，表明IBDV感染可诱导宿主细胞发生裂解性细胞死亡。此外，数据还显示，IBDV感染的细胞表现出细胞焦亡的形态学特征，包括细胞肿胀、细胞膜表面形成大的泡状突起以及碘化丙啶（PI）染色阳性，提示IBDV感染可诱导细胞发生焦亡。
鉴于GSDM蛋白经切割后产生的N端片段（GSDM-NT）在焦亡细胞膜上形成孔道是焦亡的标志性特征，理论上可通过特异性抗体检测细胞膜上的GSDM-NT，利用流式细胞术来检测焦亡细胞。在禽类焦亡细胞中，鸡Gasdermin E蛋白的N端片段（chGSDME-NT）可在细胞膜上形成孔道，使碘化丙啶（PI）进入细胞并与DNA结合。因此，可通过流式细胞术检测焦亡细胞的比例，从而将焦亡与其他形式的细胞死亡（如凋亡和坏死）区分开来。然而，目前尚未见报道利用流式细胞术检测焦亡细胞的方法。本研究中，将DF-1细胞感染传染性法氏囊病毒（IBDV）后，采用针对chGSDME-NT片段（膜结合形式）的单克隆抗体（McAb）并结合PI染色，通过流式细胞术检测焦亡细胞。出乎意料的是，流式细胞术能够有效检测到焦亡细胞，且可对焦亡细胞的比例进行定量分析。这些发现为焦亡的判定提供了一种强大而有效的方法。
本文介绍了一种利用抗chGSDME-NT 单克隆抗体和PI染色，通过流式细胞术检测IBDV感染细胞中细胞焦亡的方法。该方法还可拓展至其他病原体感染的细胞，适用于检测发生焦亡的各种细胞类型，并将其与其他形式的细胞死亡区分开来。
方案
本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 样品细胞的制备
- 在六孔板中培养DF-1（永生化鸡胚成纤维细胞）细胞（每孔5 × 105个细胞），使用添加10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），于38 °C、5% CO2培养箱中培养。
- 当细胞融合度达到80%时，弃去含血清的细胞培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞三次，然后每孔加入2 mL无血清细胞培养基。
- 向每孔加入IBDV病毒液（含计算好的MOI），设置模拟感染对照组，加入与病毒液体积相等的DMEM培养基。
- 病毒吸附1小时后，弃去培养基，用PBS洗涤细胞三次，每孔加入2 mL添加2% FBS的DMEM，继续培养24小时。
- IBDV感染后24小时，进行胰蛋白酶处理（每孔500 µL，1分钟），随后用含10% FBS的DMEM（每孔2 mL）中和。之后收集细胞，制备单细胞悬液用于流式细胞术分析。
- 在2–8 °C条件下，以400 × g离心5分钟，用移液器弃去上清液。
- 用PBS重悬细胞沉淀，并轻轻涡旋振荡管子3秒。
- 按照步骤1.6所述条件（400 × g，2–8 °C，离心5分钟）再次离心细胞。
- 重复步骤1.7和1.8所述的细胞洗涤操作。
- 在显微镜下使用血细胞计数板进行细胞计数。然后将细胞重悬于适量的流式细胞术染色缓冲液中（使最终细胞浓度为1 × 107个细胞/mL），并轻轻涡旋混匀悬液。
2. 流式细胞术的细胞染色
- 将步骤1.10中获得的单细胞悬液各100 µL加入5 mL圆底聚苯乙烯管（12 mm × 75 mm）中。为抗-chGSDME-NT/CT 抗体染色准备模拟感染和IBDV感染的细胞，并以正常小鼠IgG作为同型对照。同时，使用IBDV感染的细胞制备空白对照管和单染管。
- 分别向IBDV感染管和模拟对照管中加入1 µg Alexa Fluor 647标记的抗-chGSDME-NT 单克隆抗体、抗-chGSDME-CT 单克隆抗体或正常小鼠IgG（作为同型对照）。随后，轻轻涡旋振荡管子3秒。
- 将染色后的细胞在2–8 °C或冰上避光孵育30分钟。每10分钟轻轻涡旋振荡一次。
- 用1 mL流式细胞术染色缓冲液重悬细胞，于2–8 °C以400 × g 离心5分钟进行洗涤。用移液器弃去上清液。
- 重复步骤2.4所述的细胞洗涤操作。
- 将细胞沉淀重悬于100 µL流式细胞术染色缓冲液中。
- 用10 µg/mL的碘化丙啶（PI）对IBDV感染组、模拟感染组以及PI单染管的细胞在室温下染色10分钟，随后加入400 µL流式细胞术染色缓冲液，用于流式细胞术检测。
3. 进行流式细胞术检测
- 启动流式细胞仪以初始化仪器并打开软件。
- 首先运行空白对照管，随后运行单染管，以调整流式细胞仪的电压和补偿参数。使用在 635 nm 处发射的 FL3 和 FL4 荧光通道，分别检测 PI 和 Alexa Fluor 647 荧光染料。
- 完成所有参数设置后，依次运行所有样品。
4. 流式细胞术数据分析
- 在FL4通道直方图中分析每个样本的Alexa Fluor 647染色情况。
- 为评估每个样本中双阳性细胞的比例，使用FL3/FL4的四象限点图。
- 根据同型对照IgG/PI双染样本设定阳性阈值，确保双阳性细胞比例低于1%。该方法有助于测量所有样本中双阳性细胞的比例。
结果
chGSDME-NT 在IBDV感染的DF-1细胞膜上可 readily 通过流式细胞术检测到
细胞焦亡最重要的特征之一是GSDM介导的细胞膜孔道形成NT 由Gasdermin切割产生的片段。因此，理论上可通过流式细胞术检测焦亡细胞 通过 检测GSDM-NT 使用特异性抗体检测细胞膜上的变化。因此，用传染性法氏囊病毒（IBDV）感染DF-1细胞，并通过流式细胞术检测焦亡细胞，所用抗体为Alexa Fluor 647标记的抗chGSDME抗体。NT McAb 和 PI 染色。有相当数量的 chGSDME-NT 感染IBDV后通过流式细胞术检测到阳性细胞（图1）。相比之下，模拟感染的对照组或使用同型对照IgG染色的细胞中，Alexa Fluor 647阳性细胞极少。这些结果表明，膜结合型chGSDME可被有效且特异性地检测到NT 通过流式细胞术。值得注意的是，裂解后的chGSDME的C端片段（chGSDME-计算机断层扫描) 保留在细胞质内，而未像 chGSDME 那样转位至质膜NTchGSDME-计算机断层扫描 通过膜表面抗原染色的流式细胞术检测，仅能勉强观察到碎片，这与焦亡与膜结合型chGSDME相关这一事实一致。NT 片段
通过使用荧光素标记的抗-chGSDME-NT 单克隆抗体与碘化丙啶（PI）对DF-1细胞进行双重染色，并结合流式细胞术可检测细胞焦亡的发生
当细胞经Alexa Fluor 647标记的抗-chGSDME-NT 单克隆抗体和PI双重染色后，在FL3和FL4荧光通道进行流式细胞术分析时，焦亡细胞可通过chGSDME-NT 和PI双阳性染色进行判定。如图2A、B所示，流式细胞术检测到感染传染性法氏囊病毒（IBDV）的细胞中存在大量chGSDME-NT 阳性细胞，且IBDV感染组中chGSDME-NT/PI双阳性细胞的比例（约33%）显著高于模拟感染对照组（P < 0.001），表明chGSDME-NT 形成的膜孔与细胞膜破裂同步发生，从而导致这些IBDV感染的细胞发生焦亡性死亡。这些结果明确表明，IBDV感染可诱导宿主细胞发生chGSDME介导的细胞焦亡。而仅PI阳性的细胞可能代表IBDV感染诱导的其他形式的细胞死亡。因此，通过流式细胞术检测成孔型chGSDME-NT 的表达，为区分焦亡细胞与其他类型死亡细胞提供了一种有效的方法。
图 1：通过流式细胞术检测 chGSDME-NT 结合细胞。DF-1 细胞经模拟感染或以 MOI 为 1 的 IBDV 进行感染。感染后 24 小时，收集细胞并用 Alexa Fluor 647 标记的抗 chGSDME-NT/抗 chGSDME-CT 单克隆抗体或同型对照 IgG 染色，随后进行流式细胞术分析。流式细胞术检测到 chGSDME-NT 染色阳性，表明 IBDV 诱导焦亡过程中存在膜结合型 chGSDME-NT 的细胞。请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：通过chGSDME-NT 与PI双染色结合流式细胞术检测细胞焦亡。（A）采用流式细胞术对焦亡细胞进行散点图分析。DF-1细胞以MOI为1的剂量感染IBDV，感染后24小时收集细胞，用Alexa Fluor 647标记的抗chGSDME-NT/抗chGSDME-CT单克隆抗体及PI染色，随后进行流式细胞术分析。（B）对（A）中各组焦亡细胞百分比进行绘图并进行统计分析。采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）评估统计学差异。数据来自三次独立实验，以均值±标准差表示。***P < 0.001。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本文介绍了一种利用流式细胞术检测焦亡的有效方法，该方法通过对感染细胞进行Alexa Fluor 647标记的抗chGSDME-NT 单克隆抗体与PI的双重染色实现。该方法还可应用于多种细胞类型，以区分焦亡与其他类型的细胞死亡，如凋亡和坏死。
焦亡，一种炎症性程序性细胞死亡，主要依赖于哺乳动物中由GSDMD介导的细胞膜孔道形成1,2,3，传统上通过LDH释放等方法进行评估6,15，形态特征16，以及 GSDM- 的检测NT/GSDM-计算机断层扫描 片段 通过 Western Blot 或 IFA 检测17然而，这些方法均无法准确量化发生焦亡的细胞百分比。本研究利用焦亡细胞中由GSDM形成的特征性细胞膜孔道NT 基于流式细胞术的片段检测策略开发。
当细胞用 chGSDME 进行双重染色时NT-使用Alexa Fluor 647和PI染色后进行分析 通过 在FL3和FL4荧光通道的流式细胞术检测中，可观察到细胞焦亡现象 通过 两个参数同时：chGSDME-NT-Alexa Fluor 647 染色显示剪切后chGSDME的N端片段诱导细胞膜孔道形成，PI染色显示细胞膜破裂。数据表明，chGSDME-NTIBDV 感染细胞中 PI 双阳性细胞的比例（约 33%）显著高于模拟感染对照组P < 0.001).
实验方法需要考虑多个因素，以确保准确性和可靠性。首先，用于流式分析的每管样品应包含不少于 1 × 106 个细胞，以维持流式分析的精确性。鉴于实验方案中包含多个洗涤步骤，建议在步骤 2.1 中相应增加每管的初始细胞数量，例如增至 2 × 106 个细胞。在细胞洗涤和转移过程中必须格外小心，避免无意中破坏细胞完整性。此外，需注意细胞密度、抗体浓度以及操作时间均可能影响最佳参数设置。因此，必须根据具体的实验条件调整流式细胞仪的参数和设置。本研究中使用的参数如下：FSC AmpGain 设置为 1.40，SSC 电压设置为 490 V。在 FSC/SSC 图中设门以涵盖所有细胞群体，用于后续 FL3/4 通道分析。荧光电压设置为 FL3 通道（PI）600 V，FL4 通道（Alexa Fluor 647）600 V。FL4 与 FL3 通道之间的补偿设置为 38.0%。流速设置为 200 事件/秒，事件阈值设为 10,000。
借助这一新方法，人们对GSDME介导的细胞焦亡在鸡体应对病原感染中的作用及其潜在机制的理解已取得显著进展。通过使用特异性抗体，我们能够利用流式细胞术检测成孔的chGSDME-NT，从而区分焦亡细胞与其他细胞，并有助于确定发生焦亡的细胞比例。因此，该方法在检测焦亡细胞方面相较于Western Blot或IFA检测具有明显优势。
然而，该实验方案的局限性在于使用鸡GSDME的N端片段在IBDV感染的细胞中作为研究细胞焦亡的实验模型。尽管如此，本研究首次成功地利用流式细胞术检测细胞焦亡。
综上所述，本文所述用于检测焦亡的流式细胞术在推动我们理解哺乳动物和鸟类焦亡机制方面具有巨大潜力。该方法是一种有效的工具，有助于生命科学领域中细胞死亡的研究。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢刘珏博士的大力协助。本研究得到了中国国家重点研发计划（编号：2022YFD1800300）、国家自然科学基金（编号：32130105）以及现代农业产业技术体系专项资金（编号：CARS-40）的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5 mL 圆底聚苯乙烯管（12 × 75 毫米 | Corning Falcon | 352052 | |
| 6孔细胞培养板 | 康宁 | 3516 | |
| Alexa Fluor 647 抗体标记试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | A20186 | |
| 抗chGSDME-CT单克隆抗体 | 中国中山 SAE 生物医学技术公司 | EU0228 | |
| 抗chGSDME-NT单克隆抗体 | 中国中山SAE生物医学技术有限公司 | EU0227 | |
| CellQuest 软件 | BD 生物科学 | ||
| CO2 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | 3100 | |
| 冷冻离心机 | Eppendorf | 5810R | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Gibco（隶属于 Life Technologies） | C11995500BT | |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
| 流式细胞仪 | BD 生物科学 | FACSCalibur | |
| 流式细胞术染色缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | 00-4222-26 | |
| 血细胞计数板 | 邱井生化试剂 &安普&仪器公司（中国上海） | YX-JSB52 | |
| IBDV Lx 毒株 | IBDV Lx 毒株由位于中国北京的北京市农林科学院刘珏博士惠赠 | ||
| 倒置显微镜 | 重庆光电仪器公司 | XDS-1B | |
| 正常小鼠 IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | M&和C 基因技术 | CC017 | |
| 碘化丙啶（PI） | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | M&与 基因技术 | CC008 | |
| 涡旋振荡器 | MIULAB | MIX-28+ |
参考文献
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