本文介绍了通过使用针对鸡GSDME的N端片段（chGSDME-NT）和碘化丙啶（PI）的抗体进行双重染色后，利用流式细胞术鉴定发生焦亡的细胞。
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本文内容
摘要
摘要
焦亡是一种由炎性介导的程序性细胞死亡，主要由Gasdermin（GSDM）家族蛋白经切割后产生的N端片段在细胞膜上形成孔道所驱动。通过Western Blot检测膜结合型GSDM-NT是评估焦亡最常用的方法。然而，该方法难以区分发生焦亡的细胞与其他形式的细胞死亡。在本研究中，采用传染性法氏囊病毒（IBDV）感染的DF-1细胞作为模型，利用针对鸡GSDME N端片段（chGSDME-NT）的特异性抗体结合碘化丙啶（PI）染色，通过流式细胞术定量分析发生焦亡的细胞比例。使用Alexa Fluor 647标记的抗chGSDME-NT抗体，可通过流式细胞术清晰检测到chGSDME-NT阳性的细胞。此外，IBDV感染细胞中chGSDME-NT/PI双阳性细胞的比例（约33%）显著高于模拟感染对照组（P < 0.001）。这些结果表明，通过流式细胞术检测膜结合型chGSDME-NT是鉴定细胞死亡过程中焦亡细胞的有效方法。
引言
焦亡是一种炎症性的程序性细胞死亡，主要依赖于哺乳动物中Gasdermin（GSDM）D在细胞膜上形成孔道1,2,3。由于鸡缺乏GSDMD基因4,5，鸡体内焦亡的机制仍不清楚。Gasdermin家族包含一系列保守蛋白，如GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME和DFNB593,6。已有研究报道，来自硬骨鱼类和鸭子的GSDME可被caspase-1/3/7或caspase-3/7切割，从而诱导焦亡性细胞死亡7,8。然而，GSDME介导的焦亡在鸡抵抗病原体感染的宿主反应中的作用仍有待阐明。
传染性法氏囊病（IBD）是由传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的一种急性、高度传染性且具有免疫抑制性的家禽疾病9传染性法氏囊病病毒（IBDV）是一种无包膜的双链RNA病毒，基因组分为两个片段，属于双RNA病毒科（Birnaviridae）禽双RNA病毒属（Avibirnavirus）。10先前其他研究团队及本实验室的研究表明，传染性法氏囊病病毒（IBDV）感染可诱导宿主细胞发生细胞死亡 通过 不同的通路11,12,13,14先前的研究结果表明，传染性法氏囊病病毒（IBDV）感染会引发乳酸脱氢酶（LDH）的释放，后者是溶细胞性细胞死亡的标志物6,15，表明IBDV感染可诱导宿主细胞发生裂解性细胞死亡。此外，数据还显示，IBDV感染的细胞表现出细胞焦亡的形态学特征，包括细胞肿胀、细胞膜表面形成大的泡状突起以及碘化丙啶（PI）染色阳性，提示IBDV感染可诱导细胞发生焦亡。
鉴于GSDM蛋白经切割后产生的N端片段（GSDM-NT）在焦亡细胞膜上形成孔道是焦亡的标志性特征，理论上可通过特异性抗体检测细胞膜上的GSDM-NT，利用流式细胞术来检测焦亡细胞。在禽类焦亡细胞中，鸡Gasdermin E蛋白的N端片段（chGSDME-NT）可在细胞膜上形成孔道，使碘化丙啶（PI）进入细胞并与DNA结合。因此，可通过流式细胞术检测焦亡细胞的比例，从而将焦亡与其他形式的细胞死亡（如凋亡和坏死）区分开来。然而，目前尚未见报道利用流式细胞术检测焦亡细胞的方法。本研究中，将DF-1细胞感染传染性法氏囊病毒（IBDV）后，采用针对chGSDME-NT片段（膜结合形式）的单克隆抗体（McAb）并结合PI染色，通过流式细胞术检测焦亡细胞。出乎意料的是，流式细胞术能够有效检测到焦亡细胞，且可对焦亡细胞的比例进行定量分析。这些发现为焦亡的判定提供了一种强大而有效的方法。
本文介绍了一种利用抗chGSDME-NT 单克隆抗体和PI染色，通过流式细胞术检测IBDV感染细胞中细胞焦亡的方法。该方法还可拓展至其他病原体感染的细胞，适用于检测发生焦亡的各种细胞类型，并将其与其他形式的细胞死亡区分开来。
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方案
本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 样品细胞的制备
- 在六孔板中培养DF-1（永生化鸡胚成纤维细胞）细胞（每孔5 × 105个细胞），使用添加10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），于38 °C、5% CO2培养箱中培养。
- 当细胞融合度达到80%时，弃去含血清的细胞培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞三次，然后每孔加入2 mL无血清细胞培养基。
- 向每孔加入IBDV病毒液（含计算好的MOI），设置模拟感染对照组，加入与病毒液体积相等的DMEM培养基。
- 病毒吸附1小时后，弃去培养基，用PBS洗涤细胞三次，每孔加入2 mL添加2% FBS的DMEM，继续培养24小时。
- IBDV感染后24小时，进行胰蛋白酶处理（每孔500 µL，1分钟），随后用含10% FBS的DMEM（每孔2 mL）中和。之后收集细胞，制备单细胞悬液用于流式细胞术分析。
- 在2–8 °C条件下，以400 × g离心5分钟，用移液器弃去上清液。
- 用PBS重悬细胞沉淀，并轻轻涡旋振荡管子3秒。
- 按照步骤1.6所述条件（400 × g，2–8 °C，离心5分钟）再次离心细胞。
- 重复步骤1.7和1.8所述的细胞洗涤操作。
- 在显微镜下使用血细胞计数板进行细胞计数。然后将细胞重悬于适量的流式细胞术染色缓冲液中（使最终细胞浓度为1 × 107个细胞/mL），并轻轻涡旋混匀悬液。
2. 流式细胞术的细胞染色
- 将步骤1.10中获得的单细胞悬液各100 µL加入5 mL圆底聚苯乙烯管（12 mm × 75 mm）中。为抗-chGSDME-NT/CT 抗体染色准备模拟感染和IBDV感染的细胞，并以正常小鼠IgG作为同型对照。同时，使用IBDV感染的细胞制备空白对照管和单染管。
- 分别向IBDV感染管和模拟对照管中加入1 µg Alexa Fluor 647标记的抗-chGSDME-NT 单克隆抗体、抗-chGSDME-CT 单克隆抗体或正常小鼠IgG（作为同型对照）。随后，轻轻涡旋振荡管子3秒。
- 将染色后的细胞在2–8 °C或冰上避光孵育30分钟。每10分钟轻轻涡旋振荡一次。
- 用1 mL流式细胞术染色缓冲液重悬细胞，于2–8 °C以400 × g 离心5分钟进行洗涤。用移液器弃去上清液。
- 重复步骤2.4所述的细胞洗涤操作。
- 将细胞沉淀重悬于100 µL流式细胞术染色缓冲液中。
- 用10 µg/mL的碘化丙啶（PI）对IBDV感染组、模拟感染组以及PI单染管的细胞在室温下染色10分钟，随后加入400 µL流式细胞术染色缓冲液，用于流式细胞术检测。
3. 进行流式细胞术检测
- 启动流式细胞仪以初始化仪器并打开软件。
- 首先运行空白对照管，随后运行单染管，以调整流式细胞仪的电压和补偿参数。使用在 635 nm 处发射的 FL3 和 FL4 荧光通道，分别检测 PI 和 Alexa Fluor 647 荧光染料。
- 完成所有参数设置后，依次运行所有样品。
4. 流式细胞术数据分析
- 在FL4通道直方图中分析每个样本的Alexa Fluor 647染色情况。
- 为评估每个样本中双阳性细胞的比例，使用FL3/FL4的四象限点图。
- 根据同型对照IgG/PI双染样本设定阳性阈值，确保双阳性细胞比例低于1%。该方法有助于测量所有样本中双阳性细胞的比例。
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结果
chGSDME-NT 在IBDV感染的DF-1细胞膜上可 readily 通过流式细胞术检测到
细胞焦亡最重要的特征之一是GSDM介导的细胞膜孔道形成NT 由Gasdermin切割产生的片段。因此，理论上可通过流式细胞术检测焦亡细胞 通过 检测GSDM-NT 使用特异性抗体检测细胞膜上的变化。因此，用传染性法氏囊病毒（IBDV）感染DF-1细胞，并通过流式细胞术检测焦亡细胞，所用抗体为Alexa Fluor 647标记的抗chGSDME抗体。NT McAb 和 PI 染色。有相当数量的 chGSDME-NT 感染IBDV后通过流式细胞术检测到阳性细胞（图1）。相比之下，模拟感染的对照组或使用同型对照IgG染色的细胞中，Alexa Fluor 647阳性细胞极少。这些结果表明，膜结合型chGSDME可被有效且特异性地检测到NT 通过流式细胞术。值得注意的是，裂解后的chGSDME的C端片段（...
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讨论
本文介绍了一种利用流式细胞术检测焦亡的有效方法，该方法通过对感染细胞进行Alexa Fluor 647标记的抗chGSDME-NT 单克隆抗体与PI的双重染色实现。该方法还可应用于多种细胞类型，以区分焦亡与其他类型的细胞死亡，如凋亡和坏死。
焦亡，一种炎症性程序性细胞死亡，主要依赖于哺乳动物中由GSDMD介导的细胞膜孔道形成1,2,3，传统上通过LDH释放等方法进行评估6,15，形态特征16，以及 GSDM- 的检测NT/GSDM-计算机断层扫描 片段 通过 Western Blot 或 IFA 检测17...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢刘珏博士的大力协助。本研究得到了中国国家重点研发计划（编号：2022YFD1800300）、国家自然科学基金（编号：32130105）以及现代农业产业技术体系专项资金（编号：CARS-40）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5 mL 圆底聚苯乙烯管（12 × 75 毫米 | Corning Falcon | 352052 | |
| 6孔细胞培养板 | 康宁 | 3516 | |
| Alexa Fluor 647 抗体标记试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | A20186 | |
| 抗chGSDME-CT单克隆抗体 | 中国中山 SAE 生物医学技术公司 | EU0228 | |
| 抗chGSDME-NT单克隆抗体 | 中国中山SAE生物医学技术有限公司 | EU0227 | |
| CellQuest 软件 | BD 生物科学 | ||
| CO2 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | 3100 | |
| 冷冻离心机 | Eppendorf | 5810R | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Gibco（隶属于 Life Technologies） | C11995500BT | |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
| 流式细胞仪 | BD 生物科学 | FACSCalibur | |
| 流式细胞术染色缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | 00-4222-26 | |
| 血细胞计数板 | 邱井生化试剂 &安普&仪器公司（中国上海） | YX-JSB52 | |
| IBDV Lx 毒株 | IBDV Lx 毒株由位于中国北京的北京市农林科学院刘珏博士惠赠 | ||
| 倒置显微镜 | 重庆光电仪器公司 | XDS-1B | |
| 正常小鼠 IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | M&和C 基因技术 | CC017 | |
| 碘化丙啶（PI） | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | M&与 基因技术 | CC008 | |
| 涡旋振荡器 | MIULAB | MIX-28+ |
参考文献
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