方法文章

分离小鼠视网膜毛细血管和内皮下基质，使用原子力显微镜进行刚度测量

DOI：

10.3791/66922

⸱

2024年7月12日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of California, Los Angeles, 2Doheny Eye Institute, 3Molecular, Cellular, and Integrative Physiology Interdepartmental PhD Program, University of California, Los Angeles, 4Department of Bioengineering, University of Pennsylvania

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们最近确定视网膜毛细血管硬化是与糖尿病相关的视网膜功能障碍的新范式。该协议详细阐述了从视网膜内皮培养物中分离小鼠视网膜毛细血管和内皮下基质的步骤，然后描述了使用原子力显微镜的刚度测量技术。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

视网膜毛细血管变性是糖尿病视网膜病变 （DR） 早期阶段的临床标志。我们最近的研究表明，糖尿病诱导的视网膜毛细血管硬化在炎症介导的视网膜毛细血管变性中起着至关重要且以前未被认识的因果关系。视网膜毛细血管硬度的增加是由于赖氨酰氧化酶的过表达，赖氨酰氧化酶是一种交联和硬化内皮下基质的酶。由于在早期解决 DR 有望预防或减缓 DR 进展和相关的视力丧失，因此内皮下基质和毛细血管僵硬是早期 DR 管理的相关和新型治疗靶点。此外，直接测量视网膜毛细血管硬度可以作为开发新成像技术的关键临床前验证步骤，用于对动物和人类受试者的视网膜毛细血管硬度进行无创评估。考虑到这一观点，我们在这里提供了使用原子力显微镜对小鼠视网膜毛细血管和内皮下基质进行隔离和刚度测量的详细方案。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

视网膜毛细血管对于维持视网膜稳态和视觉功能至关重要。事实上，他们在早期糖尿病中的退化与糖尿病视网膜病变 （DR） 威胁视力并发症的发展密切相关，DR 是一种影响近 40% 的糖尿病患者的微血管疾病1。血管炎症对 DR 中的视网膜毛细血管变性有显著影响。过去的研究表明，异常的分子和生化线索在糖尿病诱导的视网膜血管炎症中起重要作用 2,3。然而，最近的工作引入了一种 DR 发病机制的新范式，该范式将视网膜毛细血管硬化确定为视网膜血管炎症和变性的关键但以前未被认识的决定因素 4,5,6。

具体来说，糖尿病诱导的视网膜毛细血管硬度增加是由视网膜内皮细胞 （EC） 中胶原蛋白交联酶赖氨酰氧化酶 （LOX） 的上调引起的，这会使内皮下基质（基底膜）变硬4,5,6。反过来，基质硬化使覆盖的视网膜 EC 变硬（由于机械互易性），从而导致视网膜毛细血管刚度的整体增加4。至关重要的是，这种糖尿病诱导的视网膜毛细血管硬化本身就可以促进视网膜 EC 激活和炎症介导的 EC 死亡。视网膜 EC 缺陷的这种机械调节可归因于改变的内皮机械转导，即机械线索转化为生化信号以产生生物反应的过程 7,8,9。重要的是，改变的 EC 机械线索和内皮下基质结构也与早期年龄相关性黄斑变性 （AMD） 相关的脉络膜血管变性有关10,11,12，这证明了血管力学生物学在退行性视网膜疾病中的更广泛影响。

值得注意的是，视网膜毛细血管硬化发生在糖尿病的早期，这与视网膜炎症的发作相吻合。因此，视网膜毛细血管硬度的增加既可以作为 DR 的治疗靶点，也可以作为 DR 的早期诊断标志物。为此，获得视网膜毛细血管和内皮下基质的可靠和直接的刚度测量非常重要。这可以通过使用原子力显微镜 （AFM） 来实现，原子力显微镜提供了一种独特、灵敏、准确和可靠的技术来直接测量细胞、细胞外基质和组织的刚度13。AFM 对样品施加微小的（纳米牛顿级）压痕力，其刚度决定了压痕悬臂弯曲的程度 - 样品越硬，悬臂弯曲越多，反之亦然。我们广泛使用 AFM 来测量培养的内皮细胞、内皮下基质和分离的小鼠视网膜毛细血管的刚度 4,5,6,11,12。这些 AFM 刚度测量有助于确定内皮力学生物学是 DR 和 AMD 发病机制的关键决定因素。为了帮助拓宽视觉研究中机械生物学的范围，我们在这里提供了使用 AFM 进行孤立小鼠视网膜毛细血管和内皮下基质刚度测量的分步指南。

方案

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所有动物手术均按照视觉与眼科学研究协会 （ARVO） 关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明进行，并经加州大学洛杉矶分校机构动物和护理使用委员会 （IACUC;协议编号 ARC-2020-030）（OLAW 机构动物福利保证编号 A3196-01）批准。使用从体重 ~25 g（糖尿病小鼠）和 ~32 g（非糖尿病小鼠）的成年（20 周龄）雄性 C57BL/6J 小鼠中分离的视网膜毛细血管执行了以下方案;Jackson Laboratory）。

1. 分离小鼠视网膜毛细血管以进行 AFM 刚度测量（第 1-4 天）

注意:该协议在最近的一项研究4 中报告，详细介绍了小鼠眼的摘除和轻度固定、视网膜分离和胰蛋白酶消化，以及随后将所得视网膜脉管系统安装在显微镜载玻片上用于 AFM 刚度测量。

  1. 眼球摘除术和轻度固定术（第 1 天）
    1. 在对小鼠实施二氧化碳暴露后颈椎脱位实施安乐死后，将微型镊子插入眼球后面，抓住肌肉附件，小心地将眼睛拉出，不要将微型镊子捏得太紧，这可能会切断视神经。
    2. 将去核的眼睛置于 PBS 中的 5% （v/v） 福尔马林中，在 4 °C 下 24 小时以进行轻度固定。
      注:根据经验4，未固定或较轻微固定的眼睛会产生脆弱的毛细血管，这些毛细血管在 AFM 样品制备和刚度测量过程中会碎裂。
  2. 视网膜分离（第 2 天）
    1. 将固定的眼睛放在解剖显微镜下的一张蜡纸上。接下来，使用微型镊子，将附着在后眼外侧的肌肉和视神经残余部分固定，并调整眼睛的方向，使角膜面向一侧（图1）。
    2. 使用手术刀片，在角膜缘（角膜-巩膜交界处）后方 1-2 毫米处做一个切口。接下来，在用微型镊子将眼睛固定到位的同时，用刀片向下施加力并继续按压，直到眼睛的前段与后端完全分离（图 1）。丢弃眼前节和晶状体。不要来回锯，因为这可能会导致视网膜损伤。
    3. 将后段（巩膜、脉络膜和视网膜）转移到装满 PBS （pH 7.4） 的 6 cm 培养皿中。
    4. 使用微型刮刀，同时用微型镊子轻轻握住视神经，挖出视网膜。将视网膜储存在含有 PBS 的 2 mL 微量离心管中，在 4 °C 下直至毛细管分离。
       
  3. 视黄醇冲洗液
    1. 要冲洗一个视网膜，请用 1 mL 双蒸 H2O （ddH2O） 填充 12 孔板的六个孔。接下来，使用倒置的巴斯德移液器，将视网膜从 2 mL 微量离心管转移到第一个孔中。
    2. 在室温 （RT） 下以 120 RPM 的轨道振荡器冲洗视网膜 30 分钟。
    3. 使用 P1000 移液器，小心地在视网膜附近上下移液水，向视网膜吹水以引起轻微的搅动。
    4. 使用倒置玻璃移液器，将视网膜转移到第二个孔中，并重复步骤 1.3.2 和 1.3.3 4 次，每次冲洗都在新鲜的（含 ddH2O）孔中完成。
    5. 最后，将视网膜转移到第六个孔中，并在设置为 100 RPM 的轨道振荡器上以 RT 冲洗过夜 （O/N），以促进胰蛋白酶消化过程中视网膜神经胶质细胞与血管的分离。
  4. 视网膜胰蛋白酶消化（第 3 天）
    1. 通过将胰蛋白酶 1:250 粉末溶解在 Tris 缓冲液 （pH 8;0.1 M） 中，制备 10% （w/v） 胰蛋白酶溶液。将锥形管倒置数次，轻轻混匀，以减少气泡的形成，从而更难确认胰蛋白酶的溶解度。
    2. 将 10% 胰蛋白酶溶液在 37 °C 水浴中平衡 10-15 分钟。胰蛋白酶粉末完全溶解后，使用 0.2 μm 注射器过滤器过滤溶液。
    3. 在 12 孔板中，加入 2 mL/孔/视网膜的过滤后的 10% 胰蛋白酶溶液。在相邻的孔中加入一些额外的胰蛋白酶溶液（以平衡玻璃移液器壁以进行后续步骤）。
    4. 在 6 孔板的三个孔中加入 3 mL ddH2O（将这三个孔专用于一个视网膜）。
    5. 在 15 mL 锥形管中，插入 P200 吸头，然后加入 4 mL 过滤后的 10% 胰蛋白酶溶液。将此锥形管转移到 37 °C 浴中，让尖端浸泡在胰蛋白酶中 2-3 分钟，因为这有助于防止视网膜在后续步骤中粘附在尖端壁上。
    6. O/N 冲洗视网膜后（从步骤 1.3.5 开始），使用 P1000 移液器小心地在视网膜附近上下移液，将水喷在视网膜上以引起轻微的搅动。
    7. 使用倒置玻璃移液器，将冲洗过的视网膜转移到 12 孔板的含胰蛋白酶的孔中（从步骤 1.4.3 开始）。确保用最少量的残留 ddH2O 转移视网膜，以免显着稀释胰蛋白酶溶液。在 37 °C 下孵育 3 小时。
    8. 将胰蛋白酶浸泡的 P200 尖端（来自步骤 1.4.5）置于视神经区域的中心，轻轻上下移液整个血管网络以分离非血管组织14。
    9. 使用在胰蛋白酶中预冲洗的倒置玻璃移液器（通过上下移液胰蛋白酶 5 次），将视网膜脉管系统转移到 6 孔板的第一个含 ddH2O 的孔中（来自步骤 1.4.4）。
    10. 旋转板并使用倒置胰蛋白酶冲洗的玻璃移液器上下移液管系统，以去除任何残留的非血管组织。
    11. 使用玻璃移液器，将视网膜脉管系统转移到 6 孔板的第二个含 ddH 2 O 的孔中，并储存在 4 °C 直至安装在载玻片上以进行 AFM 刚度测量。
      注意:水合的视网膜脉管系统（在 PBS 中）在 4 °C 下结构完整长达 2 周。然而，常规刚度测量应从新分离的毛细血管进行。
  5. 安装视网膜脉管系统以进行 AFM 刚度测量（第 4 天）
    1. 使用倒置胰蛋白酶冲洗的玻璃移液器，将视网膜脉管系统转移到 6 孔板的第三个含 ddH2O 的孔中，以去除任何残留的胰蛋白酶溶液。
    2. 彻底清洁（使用 ddH2O 和刮水器组织）带电表面显微镜载玻片，该载玻片将用于安装血管网络以进行 AFM 刚度测量。
      注意:在 AFM 测量过程中，载玻片的带电表面为血管网络提供了很强的结合力。
    3. 标记载玻片并用疏水笔在中心周围画一个 4-5 厘米的圆形区域，以避免在后续步骤中溅出水。
    4. 使用倒置胰蛋白酶冲洗的玻璃移液器，小心地将视网膜脉管系统转移到标记区域的中心。
    5. 使用 P200 移液器，小心地从一个边缘去除尽可能多的多余水分，不要意外地将脉管系统吸入吸头。
    6. 将载玻片放入靠近正面（过滤网）的生物安全柜（BSL-2 罩）中，让残留的水蒸发。
    7. 一旦脉管系统几乎干燥，在相差显微镜（4 倍放大）下，用 P200 移液器将 ddH2O 缓慢添加到标记区域的一侧，小心地为脉管系统补充水分。直接在脉管系统上添加 ddH2O 会导致其分离。
    8. 以 4 倍和 20 倍放大倍率拍摄再水化脉管系统的相差图像，以确保其具有良好的结构完整性并正确展开（而不是自行折叠）并附着在载玻片上，这是可靠 AFM 刚度测量的基本标准。

2. 从视网膜微血管内皮细胞 （REC） 培养物中获得内皮下基质（第 1-17 天）

注意:该协议改编自 Beacham 等人。15 并在最近的研究中报道了 4,5,6，描述了在改良的玻璃盖玻片上培养 REC，然后脱细胞以获得用于后续 AFM 刚度测量的内皮下基质。

  1. 明胶涂层玻璃盖玻片的制备和细胞电镀（第 1 天）
    注:在移至化学通风橱进行后续的戊二醛和乙醇胺处理步骤之前，请在组织培养罩中执行明胶涂层和后续的 PBS++ 冲洗步骤。
    1. 在无菌 24 孔板的每个孔中放置一个高压灭菌的 12 mm 直径圆形玻璃盖玻片，并加入 500 μL 预热的无菌 0.2% （w/v） 明胶（在含有钙和镁的 PBS 中稀释;PBS ++） 添加到每个含有盖玻片的孔中。在 37 °C 下孵育 1 小时。
    2. 吸出明胶溶液，用无菌 PBS++ 冲洗盖玻片一次，然后在室温下加入 500 μL 1% （v/v） 戊二醛 30 分钟，使包被的明胶交联。
    3. 收集并妥善处理（根据机构指南）戊二醛溶液，然后在 RT 中用 PBS++ 在轨道振荡器上以 100 RPM 冲洗盖玻片 5 分钟。重复此冲洗步骤 5 次。在前三次冲洗过程中，使用无菌镊子提起盖玻片，以彻底冲洗戊二醛。任何残留量都会降低细胞活力。
    4. 在 RT 下将 800 μL 1 M 乙醇胺添加到明胶交联盖玻片中 30 分钟，以淬灭孔中残留的戊二醛痕迹。
    5. 收集并妥善处理（根据机构指南）乙醇胺溶液，并在 RT 中以 100 rpm 的轨道振荡器用 PBS++ 冲洗盖玻片 5 次，每次 5 分钟。在前三次冲洗过程中，使用无菌镊子提起盖玻片，以彻底冲洗乙醇胺。任何残留量都会降低细胞活力。
    6. 交联的盖玻片现在可以进行细胞接种。
      注意:尽管我们通常在盖玻片制备后立即对细胞进行铺板，但比较在 4 °C 下储存在 PBS++ 中 1-2 天的交联明胶盖玻片上的细胞铺板可能是值得的。
    7. 在组织培养通风橱的无菌条件下，将视网膜微血管内皮细胞 （REC） 接种在 500 μL 培养基/孔中，密度在 24 小时内达到 100% 汇合，通过相差显微镜证实。
      注意:在 24 小时内达到汇合很重要，因为由此产生的 REC 静止将增加细胞分泌基质的能力（请参阅以下步骤）。根据我们对人类 REC 的经验，4 x 104 个细胞/cm2 的电镀密度足以在 24 小时内达到汇合。然而，由于 REC 大小随物种而变化（例如，小鼠 REC 明显更小），因此可能需要优化初始铺板密度。
  2. 通过 REC 培养生产内皮下基质（第 2-16 天）
    1. 细胞达到汇合后（~24 小时），用补充有无菌过滤抗坏血酸（终浓度为 200 μg/mL）的新鲜培养基替换培养基。
      注意:任何具有疾病危险因素（例如，高血糖、晚期糖基化终产物等）或药物的 REC 治疗都可以立即开始，同时进行抗坏血酸治疗。
    2. 每隔一天更换补充抗坏血酸的培养基，持续 15 天。
      注意:抗坏血酸在溶液中不稳定。每隔一天准备一次新鲜的 100X 储备液，用于培养基补充。
  3. REC 培养物的脱细胞以获得内皮下基质（第 16 天）
    1. 抗坏血酸处理 15 天后，去除培养基并用不含钙/镁的 PBS 冲洗细胞。
    2. 通过添加 250 μL/每孔的温热脱细胞缓冲液（20 mM 氢氧化铵和 0.5% Triton X-100 的 PBS 溶液）~2-3 分钟来脱细胞 REC 培养物。在相差显微镜（10 倍放大倍率）下确认细胞的去除。
    3. 轻轻去除脱细胞缓冲液，而不干扰 REC 分泌的内皮下基质，并向每个孔中加入 0.5 mL PBS。
      注:为确保内皮下基质在此和后续冲洗步骤中不会脱落，请仅使用 P1000 移液器进行温和冲洗。请勿进行真空抽吸。
    4. 将板在4°C下储存过夜，以稳定REC分泌的基质。
  4. 内皮下基质的 DNase 处理以去除细胞碎片（第 17 天）
    1. 用 800 μL PBS/孔冲洗步骤 2.3.4 中的内皮下基质。
    2. 轻轻去除 PBS，并将基质与 200 μL 不含 RNase 的 DNase I（30 K 单位）在 37 °C 下孵育 30 分钟，以去除所有痕量的细胞碎片。通过在相差显微镜下仔细寻找细胞碎片来检查 DNase 处理的效率。
    3. 轻轻去除 DNase I 溶液，并用 800 μL PBS/孔冲洗内皮下基质两次。
    4. 检查宏观纤维内皮下基质在相差显微镜（10 倍放大）下是否可见。更细的纳米级基质纤维的可视化需要 AFM 形貌扫描或免疫标记基质蛋白的 100 倍放大率的高分辨率共聚焦成像。
    5. 立即使用新鲜的（未固定的）内皮下基质进行 AFM 刚度测量。
    6. AFM 测量后，用 1% （v/v） 多聚甲醛（室温下 15 分钟）固定基质样品并储存在 4 °C，以便用针对内皮下基质蛋白和/或交联酶的抗体进行免疫标记。

3. AFM 刚度测量

注意:该协议改编自标准 AFM 用户手册，并在最近的研究 4,5 中报告了如何使用 AFM 和数据分析软件从视网膜毛细血管和内皮下基质获取和分析刚度数据。尽管下面概述的步骤基于特定的 AFM 模型（参见材料表），但基本原理通常适用于所有 AFM 模型。

  1. 悬臂式探头的选择
    注:软生物样品需要软悬臂，这些悬臂会在样品压痕时弯曲，同时选择探针尺寸以匹配样品的尺寸。
    1. 对于直径为 5-8 μm 的小鼠视网膜血管的刚度测量，使用弹簧常数 （k） 为 0.2-0.3 N/m 的 1 μm 半径的悬臂探针。对于由纳米级纤维组成的内皮下基质的刚度测量，使用弹簧常数 （k） 为 0.06-0.1 N/m 的 70 nm 半径悬臂探针。
  2. 悬臂式安装
    1. 在 AFM 计算机上，打开控制 AFM 单元和连接到相差显微镜的相机的软件，该相机用于可视化悬臂和样品。
    2. 将悬臂支架固定在悬臂更换架上，并在立体镜下使用制表镊子将选定的悬臂安装在支架上，而不会物理损坏悬臂。拧紧支架上的螺钉以固定悬臂。
    3. 将悬臂支架放在支架上的 AFM 头上并锁定。
    4. 使用 AFM 软件中的步进电机功能，将 AFM 头撤回到最高点，并在软件中将该位置设置为零点。此步骤可防止 AFM 悬臂在安装 AFM 头时意外撞击样品台（下一步）。
    5. 小心地将 AFM 头从支架上提起，然后将支腿放入各自的插槽中，将其安装在 AFM 样品台上。
  3. 激光对准
    注:初始激光对准是在没有任何样品的情况下进行的（即，在空气模式下），因为它确保激光束在悬臂尖端上更精确地对准（通过防止激光在液体中折射）。然而，由于生物样品浸没在折射率与空气不同的介质中，因此在测量刚度之前在介质中重新对准激光器非常重要。
    1. 对于在空气中的激光对准，将 AFM 头放在样品台上，并使用 10 倍物镜和连接的相机在实时模式下在监视器上可视化悬臂。红外激光器隐藏在用户视野之外，但可以通过 CCD 相机看到。
    2. 在软件中选择 Contact Mode Force Spectroscopy 功能，然后打开标题为 Laser alignment 的窗口。
    3. 使用 AFM 头上标记为激光横向的两个螺钉，将激光束聚焦在悬臂上，使激光对准窗口中的 SUM 值最高。为此，请将激光聚焦在悬臂中心或悬臂中心周围。
    4. 使用探测器调节螺钉，调整光电探测器，使激光光斑位于激光对准窗口的中心。
    5. 使用镜像调整螺钉调整镜像，以确保 SUM 值处于尽可能高的值。
      注:高 SUM 值可确保对样品刚度进行灵敏和准确的评估。因此，应同时执行激光对准和反射镜调整步骤以获得最高的 SUM 值。
    6. 接下来，为了在液体中进行激光对准，在培养皿中加入所需的培养基并将其牢固地安装在载物台上，以防止任何振动或漂移，从而在样品压痕过程中产生测量伪影。
    7. 在查看聚焦在悬臂上的实时摄像机馈送时，使用步进电机功能将其降低到液体中。
    8. 重复步骤 3.3.4 和 3.3.5 以确保 SUM 值保持最高，并且激光光斑位于激光对准窗口的中心。
  4. 悬臂弹簧常数校准
    注意:尽管悬臂式探头带有制造商校准的弹簧常数 （k），但最好在测量开始之前独立验证其值（在液体中）。使用干净的玻璃表面，以最大限度地减少悬臂式探头和玻璃表面之间的相互作用。
    1. 悬臂施加的设定点力设置允许力压痕的激光从悬臂偏转的最大激光偏转。最初将其设置为 1.5 V。如果悬臂无法以给定的设定点力接近，则逐渐增加它，直到它压痕样品并生成力压痕曲线。
    2. Z 长度表示在样品压痕过程中悬臂达到设定点后 z 压电陶瓷退出的最大距离。Z 长度应至少足以确保悬臂探针与样品干净分离。要校准玻璃表面上的弹簧常数，请将 Z 长度设置为 1 μm。
    3. Z 速度是指在力压痕过程中，z 压电陶瓷将悬臂垂直向下移向样品的速度。它应该进行优化，因为非常低的速度将主要捕获样品的粘性行为，而非常高的速度将主要捕获弹性行为。预期最佳速度可以捕获生物样品的真实粘弹性。将粘弹性生物样品的 Z 速度设置为 2 μm/s。
    4. Z 范围内的目标高度表示在测量力曲线后和移动到样品上的其他位置之前，z 压电陶瓷与样品之间的大致距离。Z Range 目标高度应大于样本要素的高度。将 Z 范围内的目标高度设置为 7.5 μm。
    5. 使用 步进电机 功能，将悬臂相当靠近样品表面（根据 10 倍放大倍率的相差图像中的焦点判断），然后在接触模式力谱窗口中选择 "接近 "功能，以 15 μm 的较小增量降低悬臂。
    6. 单击 Acquire 以捕获力曲线。
    7. 选择 Force Curve，在校准管理器窗口中将其打开，然后在方法部分中选择 Contact-based Mode 。
    8. 使用 Select-fit Range 功能，选择 Cantilever Retraction Curve 进行线性曲线拟合。接下来，选中 Sensitivity 复选框 ，将力单位从 V 转换为 N。
    9. 将悬臂在液体中抬起 100-200 μm，然后选择 Thermal Noise 功能。同样，使用 Select Fit Range （选择拟合范围） 将热噪声钟形曲线与洛伦兹曲线拟合。曲线拟合后，选择 Spring Constant （k） 框。确认弹簧常数 （k） 接近制造商的值，并记下来以备将来参考。校准后，设定值的单位将从 mV 变为 nN。
      注意:热噪声是悬臂在特定温度下的固有频率。为了准确测量弹簧常数，需要校正热噪声。
  5. 获取力-距离曲线
    1. 将载玻片上的样品（视网膜血管或内皮下基质）放在 AFM 载物台上，然后在软件的实验部分选择 接触模式力谱 。
    2. 将设定点力设置为 0.5 nN 并单击 "接近"，这明显高于 SAA-SPH 1 μm 和 PFQNM-LC-A 70 nm 悬臂探针的热偏转，确保悬臂平稳接近样品。
    3. 悬臂检测到表面并返回到其静止目标高度后，对于较硬的 SAA-SPH 1 μm 悬臂探针，将设定点设置为 0.2 nN，对于较软的 PFQNM-LC-A 70 nm 悬臂探针，将设定点设置为 0.1 nN。这种设定点调整可确保刚性和软悬臂在样品压痕过程中都能轻松弯曲（参见第 3.1 节）。
    4. 将 Z 长度设置为 ~2.5 μm，以确保在回缩期间（参见步骤 3.4.2）和 Z 速度为 2 μm/s（参见步骤 3.4.3）期间悬臂探针与生物样品的干净分离。
    5. 使用 AFM 载物台上的载物台螺钉，小心地将悬臂探针定位在样品上的所需位置。
      注意:由于毛细管并不总是在载玻片上平铺，因此在移动载物台之前，将悬臂从其静止目标高度再抽出 10-20 μm 是安全的。
    6. 单击 Approach 首先使悬臂更靠近样品，然后单击 Acquire 以捕获所需位置的力曲线。保存所有力曲线以供分析。
  6. 数据分析
    1. 在数据处理软件中打开力曲线。
    2. 选择用于数据分析的 Retraction Force Curve （类似于步骤 3.4.8）。
    3. 使用数据平滑功能，使用高斯滤波器平滑力曲线，以去除采集数据中不需要的噪声。
    4. 使用 Baseline subtract （基线减法） 功能，将力曲线的 （非接触） 基线部分的斜率和大小值调整为零。
    5. 单击 接触点 功能，自动将力曲线的接触点置于 X 轴和 Y 轴上的 （0,0） 坐标处。
    6. 使用 Vertical Tip Position 功能，通过校正任何样品压痕来计算悬臂在 Y 轴上的实际垂直位置。
    7. 在处理后的力曲线上，首先选择尖端形状和半径（基于选定的悬臂探针），然后使用 Hertz/Sneddon 模型拟合力曲线，从而应用 弹性拟合 功能。
      1. 如果 70 nm 半径探针的基质压痕超过 70 nm（通常是这种情况），请选择 抛物面 尖端形状。对于毛细管刚度测量，半径为 1 μm 的探针的样品压痕永远不会超过 1 μm，因此请选择 球形 尖端形状。此外，如果拟合曲线的接触点与实际缩回曲线的接触点不一致，请选中 Shift Curve 复选框。
    8. 记下并保存杨氏模量 （刚度） 的值。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

小鼠视网膜毛细血管
离体视网膜毛细血管的 AFM 刚度测量涉及样品处理步骤，这些步骤可能会破坏其机械结构完整性。为了防止这种情况，从而确保 AFM 测量的可行性、可靠性和可重复性，在血管分离之前，将去核的眼睛在 4°C 下在 5% 福尔马林中固定过夜。这种温和的固定方案具有福尔马林浓度降低、固定温度低、固定时间有限且无角膜穿刺的特点，旨在最大限度地减少化学固定引起的任何潜在交联/硬化伪影。如图 2B、C 所示，这种相对温和的固定确保孤立的视网膜脉管系统在结构上坚固并且足以进行 AFM 测量。相比之下，从未固定的眼睛（使用低渗法）4 或短暂固定的眼睛（8 小时）中分离的视网膜血管变得碎片化或塌陷，从而使其不适合 AFM 测量（图 2B）。

视网膜内皮下基质
血管刚度反映了血管细胞和基底膜（内皮下基质）的组合刚度4。由于细胞通过自身刚度的类似变化来适应基质刚度，因此称为机械互易性 9（mechanical reciprocity）的过程，即内皮下基质刚度，成为整体血管刚度的重要决定因素。对于基质刚度测量，获得均匀致密的内皮下基质很重要。对于在补充抗坏血酸的培养基中生长的人视网膜 EC，这通常需要 10-15 天（图 3A）4,5,6。培养时间的这种差异可能是由于市售原代视网膜 EC 的批次间差异引起的。此外，我们通常发现，与原代人视网膜 EC 培养物相比，来自 C57BL/6 小鼠的市售视网膜 EC 沉积了更致密的基质，从而表明物种特异性差异。如图 3A 所示，相差图像仅提供宏尺度上基质的总体视图。然而，更精细的纳米到微米级纤维结构在基质免疫标记的基质的高分辨率共聚焦荧光图像中变得明显，该基质用针对基质结构蛋白胶原蛋白 IV 和纤连蛋白的抗体进行免疫标记（图 3B）。应该注意的是，这些基质蛋白还通过与特异性整合素受体结合，为内皮细胞提供指导性线索9。

AFM 刚度测量
选择合适的悬臂刚度（弹簧常数 k）和探头尺寸对于可靠和灵敏的测量至关重要。应选择这些参数以匹配生物样品的刚度和尺寸。将选定的悬臂安装在 AFM 上后，红外激光束必须聚焦在悬臂的尖端，并且反射的激光点必须以光电探测器为中心。这种激光对准可确保精确、灵敏地检测悬臂挠度，从而测量刚度。AFM 刚度测量从 z 压电陶瓷将悬臂垂直向下移向样品开始。此时没有悬臂挠度，这会产生接近曲线的平坦基线 （图 4A）。当悬臂式探针接触并压痕样品时，悬臂式会弯曲，导致光电探测器上的激光偏转，如接近曲线的垂直偏转所示。在样品上施加预设的压痕力（设定点力）后，悬臂缩回远离样品的起始位置（Z 目标高度）。然后将偏转的回缩曲线拟合到 Hertz/Sneddon 模型，以计算样品的杨氏模量（刚度）。

从图 4 所示的代表性力压痕测量中可以清楚地看出，从糖尿病小鼠分离的视网膜毛细血管（图 4B）获得的接近和回缩曲线比从非糖尿病小鼠（图 4A）获得的曲线陡峭得多。力压痕曲线的斜率越陡峭，表明样品对力压痕的抵抗力越大，导致悬臂挠度越大，这反映了样品刚度越高13。事实上，随后对多个力压痕曲线的数据分析显示，糖尿病患者的小鼠视网膜毛细血管明显变硬4。还应该注意的是，悬臂探针和生物样品之间的接触通常会导致非特异性表面粘附，这会导致在回缩过程中出现负悬臂偏转，从回缩曲线超出基线的延伸可以看出（图 4B）。此外，细胞、基质和血管等生物样品本质上是粘弹性的，因此在力压痕后可能会发生一些永久性变形和/或表观刚度的变化。如果是这样，这将反映在接近曲线和缩回曲线的错位（滞后）中。事实上，比较图 4A 和图 4B 证实了预期的趋势，即非糖尿病小鼠中较软毛细血管的力压痕比在较硬的毛细血管中观察到的产生更大的滞后。如前所述 5,6，也以上述方式计算从视网膜 EC 培养物获得的内皮下基质的刚度（杨氏模量）。

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图 1:在小鼠眼睛上切割用于视网膜分离的切口示意图。 使用镊子固定视神经，使用手术刀在角膜缘后方做一个完整的切口，以将小鼠视网膜与晶状体和前房分开。紫色虚线显示垂直切口的位置。该示意图是使用科学图像和插图软件绘制的。 请单击此处查看此图的较大版本。

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图 2:分离完整小鼠视网膜血管以进行 AFM 测量的方案优化。 （A） 立体镜图像显示了在毛细血管分离步骤之前从轻度固定的小鼠眼中分离出的完整视网膜。比例尺:2 mm。（B） 4 倍放大倍率的代表性相差图像显示了使用不同分离方法获得的小鼠视网膜血管。比较分离血管的结构完整性和耐用性，发现在 4 °C 下用 5% 福尔马林固定 24 小时（红框）的去核眼视网膜的胰蛋白酶消化产生了最适合 AFM 刚度测量的视网膜血管系统。使用这种方法分离的视网膜血管表现出清晰的血管网络，沿玻璃表面均匀分布。比例尺:500 μm。（C） 完整视网膜毛细血管网络的高放大倍率 （20x） 视图，类似于 （B） 中所示的视图，证实了从轻度固定的眼睛获得的毛细血管的高结构完整性。比例尺:100 μm。此数字已从4 修改而来。 请单击此处查看此图的较大版本。

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图 3:从原代人和小鼠 REC 培养物中获得的脱细胞基质。 （A） 20 倍放大倍率的代表性相差图像，显示人或小鼠 REC 的 10 天 （10 d） 或 15 天 （15 d） 培养物脱细胞后玻璃盖玻片上的内皮下基质聚集体。比例尺:100 μm。（B） 从 15 d 人 REC 培养物中获得并用抗胶原 IV 和抗纤连蛋白抗体标记的脱细胞基质的代表性高放大倍率 （100x） 共聚焦荧光图像揭示了致密的纳米原纤维胶原 IV和纤连蛋白基质。比例尺:20 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

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图 4:小鼠视网膜毛细血管的 AFM 刚度测量的力距离曲线。 线图表示从 （A） 非糖尿病小鼠或 （B） 糖尿病小鼠分离的小鼠视网膜毛细血管的一个位置的单次力压痕测量的代表性方法（浅色）和回缩（深色）曲线。使用 SAA-SPH 半径为 1 μm 的半球形悬臂探头获得的力曲线绘制了悬臂-样品距离（由 z 压电控制）与导致悬臂偏转的施加垂直力之间的关系。（A） 黄色箭头表示 z 压电驱动的悬臂接近样品，白色箭头表示悬臂探针与样品接触的接触点，绿色箭头表示悬臂偏转至设定点（峰值）压痕力 （*）。（B） 从糖尿病小鼠分离的视网膜毛细血管中获得的接近和回缩曲线都显示出比非糖尿病对应物（如 A 所示）明显更陡峭的斜率，这表明糖尿病小鼠的毛细血管刚度更高。箭头表示回缩曲线低于基线的下降，这反映了压痕过程中探针和样品之间的粘附引起的悬臂探针的负偏转。 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AFM 已广泛用于测量较大血管（如主动脉和动脉）的疾病相关硬度变化16。这些发现有助于确定内皮力学生物学在心血管并发症（如动脉粥样硬化17）中的作用。基于这些发现，我们已经开始研究以前未被认识的内皮力学生物学在早期 DR 视网膜微血管病变发展中的作用。然而，这一追求的成功取决于对糖尿病诱导的视网膜毛细血管硬度变化的准确测量。最近的研究表明，与大血管类似，视网膜毛细血管和视网膜 EC 分泌的内皮下基质的刚度也可以使用 AFM 4,5,6 直接、准确和可靠地测量。

这种方法涉及使用胰蛋白酶消化从轻度固定的眼睛中分离小鼠视网膜毛细血管。根据经验，这种温和的固定步骤是必要的，因为从未固定的眼睛中分离的毛细血管（使用低渗方法）很脆弱并且会碎裂，使它们不适合 AFM 刚度测量4。相反，更强的固定和随之而来的对广泛胰蛋白酶消化的需求（在其他视网膜胰蛋白酶消化方案中已有报道18）也可能损害毛细血管结构的完整性，正如紧密连接的破坏所判断的那样。因此，这里采用的温和的毛细管固定和温和的胰蛋白酶消化有助于减少因福尔马林诱导的过度交联而产生的刚度伪影，并确保毛细管的结构完整性，以实现可靠的 AFM 刚度测量。

作为一种替代方法，最近的一项研究报告了来自轻度固定视网膜平面支架的视网膜毛细血管的 AFM 刚度测量19。通过在完整视网膜内的视网膜毛细血管上执行 AFM 力压痕，这种方法可以进行 原位 刚度测量。然而，这些毛细血管刚度测量值可能包括内限制膜的刚度。此外，这种方法仅限于测量可在视网膜平面支架上触及的浅表毛细血管，而忽略了在早期 DR20 中特别受影响的较深的毛细血管丛。这些问题可以使用这种方法来解决，该方法从所有视网膜层中干净地提取血管（没有残留的视网膜组织）。我们目前正在优化该协议，以从早期 AMD 的动物模型中分离脉络膜血管。也就是说，我们意识到方案中采用的温和福尔马林固定可能会导致 AFM 测量中出现交联相关的硬化伪影。因此，谨慎的做法是更多地根据刚度的相对变化（不同实验组之间）而不是绝对刚度来解释使用这种方法获得的血管刚度值。

与需要轻度固定的视网膜毛细血管相比，无需任何修改即可评估从视网膜 EC 培养物获得的内皮下基质。这主要是由于沉积基质的稳健性，这是多种因素共同作用的结果，包括在培养基中添加抗坏血酸（可增强胶原蛋白合成15）、玻璃盖玻片的化学改性可防止脱细胞过程中基质脱落，以及培养时间延长（10-15 天）。重要的是，我们已经表明，高血糖诱导的体外内皮下基质刚度增加与糖尿病诱导的体内视网膜毛细血管硬度增加一致 4。这并不奇怪，因为预计基质刚度的增加会增加覆盖视网膜 EC 的刚度（由于机械互易性），这些刚度共同增加了整体毛细血管刚度。事实上，我们最近表明，在糖尿病条件下生长时，视网膜内皮细胞会变得更硬4，这可能是由于 Rho/ROCK 依赖性肌动蛋白细胞骨架张力的增加21。这些发现还意味着，在早期 AMD 的恒河猴模型中看到的脉络膜 EC 硬化反映了脉络膜内皮下基质和完整血管的刚度增加12，这一想法正在正在进行的研究中得到检验。总体而言，未固定的视网膜内皮下基质和 ECs 的刚度变化反映了在轻度固定的完整视网膜血管中看到的趋势，这一事实证明了轻度固定方法的有效性。

从 DR 动物模型中直接测量视网膜毛细血管的硬度不仅有助于将内皮力学生物学确立为 DR 管理的新治疗靶点，而且还为开发新的敏感成像技术提供有力的理论依据，用于未来 DR 患者视网膜毛细血管硬度的无创评估。这种无创技术可能会检测到预计由毛细血管硬化引起的血流的细微变化，类似于糖尿病引起的心血管疾病中常见的动脉脉搏波速度变化。从糖尿病供体的死后人眼中分离的视网膜毛细血管的 AFM 刚度测量将在这方面提供重要的概念验证。鉴于视网膜毛细血管硬度在 1 型糖尿病的（链脲佐菌素）小鼠模型中早期增加4，成功使用 AFM 验证硬度测量成像方式可能导致视网膜毛细血管僵硬被确定为早期 DR 发病机制的临床生物标志物。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可披露的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了美国国家眼科研究所/NIH 赠款 R01EY028242（对 K.G.）、防盲研究/国际视网膜研究基金会 AMD 创新研究方法催化剂奖（对 K.G.）、来自 WM Keck 基金会的 Stephen Ryan 黄斑研究倡议 （RIMR） 特别赠款（对 Doheny 眼科研究所），以及 Ursula Mandel 奖学金和加州大学洛杉矶分校研究生委员会多元化奖学金（对 I.S.T.）。这项工作还得到了 Research to Prevent Blindness， Inc. 对加州大学洛杉矶分校眼科的无限制资助的支持。本文中的内容完全由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
视网膜毛细血管分离
0.22 µm PVDF 针式过滤器Merck MilliporeSLGVM33RS低蛋白结合 Durapore
10X Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水，不含钙 % 镁康宁20-031-CV终浓度 1X，pH 7.4
12 孔板Falcon Corning353043
15 mL 离心管康宁430791RNA酶，无热原
20 mLLuer-Lok TIP 注射器BD302830
5 3/4 英寸一次性硼硅酸盐玻璃/非无菌巴斯德移液器FisherBrand13-678-20A
60x15 mm 组织培养皿Falcon Corning353002
6 孔板Falcon Corning353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL 笔科学设备实验室9804-02
刀架X-ACTO
碳钢手术刀片 #10Bard-Parker371110
牙科蜡电子显微镜科学50-949-027
解剖显微镜Am-scope
福尔马林溶液，中性缓冲，10%Millipore SigmaHT501128-4L终浓度 5% （v/v）
Kimwipes - 刮水器组织Kimtech Science34133
微刮刀精细科学工具10089-11
轨道摇床实验室 GeniusSK-O180
PELCO 经济型 #7 不锈钢 115mm 镊子Ted Pella， Inc.5667
相差显微镜尼康 TS2
净化器 Logic+ II 类，A2 型 生物安全柜Labconco302380001
Safe-Lock 微量离心管 2 mLEppendorf22363352
立体镜AmScopeSM-3 系列变焦三目立体显微镜 3.5X-90X
Superfrost Plus 显微镜载玻片 - 白色标签 - 预清洁 - 25 x 75 x 1.0 mmFisherBrand1255015
Tris 缓冲液，0.1 M 溶液，pH 7.4 - 生物技术级VWRE553-500ML，pH 8 用于胰蛋白酶溶液
胰蛋白酶 1：250 粉末 组织培养级VWRVWRV0458-25G10 % （w/v） 胰蛋白酶溶液
水分子生物学级康宁46-000-CM
内皮下基质
10X PBS康宁20-031-CV
1X 含钙和镁的 PBSThermo Fisher Scientific14040-117pH 7.4
氢氧化铵Sigma-Aldrich338818
抗坏血酸Sigma-AldrichA4034
胶原蛋白 IV抗体Novus BiologicalsNBP1-26549
DNase IQiagen79254
乙醇胺Sigma-Aldrich398136
纤连蛋白抗体Sigma-AldrichF6140
氟支架Invitrogen-Thermo Fisher Scientific00-4958-02
明胶Sigma-AldrichG1890
玻璃盖玻片 （12mm）Fisher12-541-000
戊二醛电子显微镜科学16220
人视网膜内皮细胞 （HREC）Cell Systems CorpACBRI 181
MCDB131 培养基康宁15-100-CV
小鼠视网膜内皮细胞 （mREC）细胞生物制剂C57-6065
Triton X-100Thermo Fisher Scientific BP151-100
胰蛋白酶Gibco-Thermo Fisher Scientific25200-056
AFM 测量
1 µm 探头布鲁克SAA-SPH-1UMA 19 微米高的半球形探头，端部半径为 1
微米，弹簧常数 0.25N/m
70 nm 液相色谱探头布鲁克PFQNM-LC-V2A 19 微米高的半球形探头，端部半径为 70 nm，
 弹簧常数 0.1N/m
 相机XCAM 系列Toupcam1080P HDMI
台式机 运行相机华硕台式机Intel i5-6600 CPU，8GB RAM
盖玻片培养皿架CellvisD29-14-1.5-N29mm 玻璃底培养皿带
 14 mm 微孔
Nanowizard 4BrukerNanowizard 4Bioscience 原子力显微镜，用于灵敏测量软生物样品的机械结构特性（刚度和形貌）
差微型显微镜ZeissAxiovert 200带 10 倍物镜的倒置显微镜
无 安装在光学显微镜上的 相

参考文献

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