我们近期发现视网膜毛细血管硬化是糖尿病相关视网膜功能障碍的一种新范式。本实验方案详细阐述了从小鼠视网膜毛细血管及视网膜内皮细胞培养物中分离视网膜毛细血管及其内皮下基质的步骤，随后介绍了利用原子力显微镜测量其硬度的技术方法。
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摘要
摘要
视网膜毛细血管退化是糖尿病性视网膜病变（DR）早期阶段的临床特征。我们最近的研究表明，糖尿病引起的视网膜毛细血管僵硬在炎症介导的视网膜毛细血管退化过程中起着关键且此前未被认识的因果作用。视网膜毛细血管僵硬度的增加源于赖氨酰氧化酶的过表达，该酶可交联并硬化内皮下基质。由于在早期阶段干预DR有望预防或延缓DR的进展及相关视力丧失，因此内皮下基质和毛细血管僵硬度成为早期DR管理中相关且新颖的治疗靶点。此外，直接测量视网膜毛细血管僵硬度可为开发用于在动物和人类受试者中无创评估视网膜毛细血管僵硬度的新成像技术提供关键的临床前验证步骤。基于这一考虑，本文提供了利用原子力显微镜分离并测量小鼠视网膜毛细血管及内皮下基质僵硬度的详细实验方案。
引言
视网膜毛细血管对于维持视网膜稳态和视觉功能至关重要。事实上，在糖尿病早期发生的毛细血管退化与糖尿病性视网膜病变（DR）这一威胁视力的并发症的发生密切相关。DR是一种微血管疾病，影响近40%的糖尿病患者1。血管炎症在DR中显著促进视网膜毛细血管的退化。以往的研究已证明，异常的分子和生化信号在糖尿病诱导的视网膜血管炎症中发挥重要作用2,3。然而，近期研究提出了DR发病机制的新范式，指出视网膜毛细血管僵硬是导致视网膜血管炎症和退化的关键因素，这一因素此前未被认识4,5,6。
具体而言，糖尿病引起的视网膜毛细血管刚性增加是由于视网膜内皮细胞（ECs）中胶原交联酶赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase, LOX）表达上调所致，该酶可导致内皮下基质（基底膜）硬化4,5,6。基质硬化反过来通过力学互作使覆盖其上的视网膜ECs变硬，从而导致视网膜毛细血管整体刚性增加4。关键的是，仅糖尿病诱导的视网膜毛细血管硬化即可促进视网膜EC活化及炎症介导的EC死亡。这种对视网膜EC功能障碍的力学调控可归因于内皮细胞力传导过程的改变，即机械信号被转化为生化信号以产生生物学反应的过程7,8,9。重要的是，EC 所受机械信号及内皮下基质结构的改变也已被证实参与与早期年龄相关性黄斑变性（AMD）相关的脉络膜血管退行性病变10,11,12，这表明血管力生物学在退行性视网膜疾病中具有更广泛的病理意义。
值得注意的是，视网膜毛细血管硬化在糖尿病早期即已发生，且与视网膜炎症的起始时间相吻合。因此，视网膜毛细血管硬度的增加可能成为糖尿病视网膜病变（DR）的治疗靶点和早期诊断标志物。为此，获得视网膜毛细血管及其内皮下基质可靠且直接的硬度测量结果至关重要。原子力显微镜（AFM）可实现这一目标，该技术具有独特、灵敏、准确且可靠的优势，能够直接测量细胞、细胞外基质及组织的硬度13。AFM通过向样品施加微小（纳牛顿级）的压痕力，根据样品硬度决定探针悬臂弯曲的程度——样品越硬，悬臂弯曲越明显，反之亦然。我们已广泛使用AFM测量培养的内皮细胞、内皮下基质以及分离的小鼠视网膜毛细血管的硬度4,5,6,11,12。这些AFM硬度测量结果有助于确立内皮细胞力学生物学在糖尿病视网膜病变（DR）和年龄相关性黄斑变性（AMD）发病机制中的关键作用。为了推动力学生物学在视觉研究中的应用范围，本文提供了利用AFM对分离的小鼠视网膜毛细血管及内皮下基质进行硬度测量的逐步操作指南。
方案
所有动物实验均遵循视力与眼科学研究协会（ARVO）关于在眼科与视觉研究中使用动物的声明，并经加州大学洛杉矶分校机构动物护理与使用委员会（IACUC；方案编号 ARC-2020-030）批准（OLAW 机构动物福利保证编号 A3196-01）。以下实验方案使用从成年（20周龄）雄性C57BL/6J小鼠视网膜毛细血管进行，小鼠体重约为25 g（糖尿病小鼠）和32 g（非糖尿病小鼠；Jackson Laboratory）。
1. 用于原子力显微镜刚度测量的小鼠视网膜毛细血管分离（第1-4天）
注意：本方案来自最近的一项研究4，详细描述了小鼠眼球的去核与轻度固定、视网膜分离、胰蛋白酶消化，以及随后将获得的视网膜血管系统置于显微镜载玻片上进行原子力显微镜（AFM）刚度测量的操作步骤。
- 去核与轻度固定（第1天）
- 通过暴露于二氧化碳后行颈椎脱位处死小鼠，将显微镊子插入眼球后方，夹住肌肉附着点，小心地将眼球拉出，注意不要过度夹紧镊子，以免切断视神经。
- 将去核后的眼球置于含5%（v/v）甲醛的PBS中，4 °C下固定24小时，以实现轻度固定。
注意：根据经验4，未固定或固定程度更轻的眼球会产生脆弱的毛细血管，在原子力显微镜（AFM）样品制备和刚度测量过程中容易发生断裂。
- 视网膜分离（第2天）
- 将固定后的眼球置于解剖显微镜下的蜡纸上。使用显微镊子夹住附着在眼球后部外侧的肌肉残余和视神经，调整眼球方向，使角膜朝向一侧（图1）。
- 使用手术刀片，在距角膜缘（角膜-巩膜交界处）后方1-2 mm处作一平行切口。接着，在用显微镊子固定眼球的同时，用刀片向下施力并持续按压，直至眼前段完全与后段分离（图1）。弃去眼前段和晶状体。切勿来回锯动，以免损伤视网膜。
- 将眼球后段（巩膜、脉络膜和视网膜）转移至盛有PBS（pH 7.4）的6 cm培养皿中。
- 使用显微刮勺，同时用显微镊子轻轻夹住视神经，将视网膜刮出。将视网膜储存于含有PBS的2 mL微量离心管中，4 °C保存，直至进行毛细血管分离。
- 视网膜清洗
- 为清洗一片视网膜，取12孔板中的6个孔，每孔加入1 mL双蒸水（ddH2O）。然后使用倒置的巴斯德移液管，将视网膜从2 mL微量离心管转移至第一孔。
- 在室温（RT）下，将视网膜置于摇床上以120 RPM振荡清洗30分钟。
- 使用P1000移液器，小心地在视网膜附近上下吹吸液体，使水流冲击视网膜以产生轻柔搅动。
- 使用倒置玻璃移液管将视网膜转移至第二孔，并重复步骤1.3.2和1.3.3共4次，每次清洗均使用新的（含ddH2O）孔。
- 最后，将视网膜转移至第六孔，在室温下以100 RPM持续振荡过夜（O/N），以促进胰蛋白酶消化过程中视网膜神经胶质与血管的分离。
- 视网膜胰蛋白酶消化（第3天）
- 通过将胰蛋白酶1:250粉末溶解于Tris缓冲液（pH 8；0.1 M）中，配制10%（w/v）的胰蛋白酶溶液。轻轻翻转锥形管数次以混匀，尽量减少气泡形成，因为气泡会干扰对胰蛋白酶是否完全溶解的判断。
- 将10%胰蛋白酶溶液置于37 °C水浴中平衡10-15分钟。待胰蛋白酶粉末完全溶解后，使用0.2 µm注射器滤器过滤溶液。
- 在12孔板中，每孔每片视网膜加入2 mL过滤后的10%胰蛋白酶溶液。在邻近孔中额外加入一些胰蛋白酶溶液（用于后续步骤中平衡玻璃移液管壁）。
- 在6孔板的三个孔中各加入3 mL ddH2O（为一片视网膜专用这三个孔）。
- 在15 mL锥形管中，先插入P200吸头，再加入4 mL过滤后的10%胰蛋白酶溶液。将该锥形管置于37 °C水浴中，使吸头浸泡在胰蛋白酶中2-3分钟，以防止后续步骤中视网膜粘附在吸头壁上。
- 视网膜过夜清洗后（步骤1.3.5），使用P1000移液器小心地在视网膜附近上下吹吸液体，向视网膜喷水以产生轻柔搅动。
- 使用倒置玻璃移液管，将清洗后的视网膜转移至12孔板中含有胰蛋白酶的孔中（步骤1.4.3）。确保转移时残留的ddH2O尽可能少，以免显著稀释胰蛋白酶溶液。在37 °C孵育3小时。
- 将已浸泡在胰蛋白酶中的P200吸头（步骤1.4.5）对准视神经区域，轻柔地上下吹吸整个血管网络，以解离非血管组织14。
- 使用预先用胰蛋白酶冲洗过的倒置玻璃移液管（通过上下吹吸胰蛋白酶5次进行冲洗），将视网膜血管系统转移至6孔板中第一个含ddH2O的孔（步骤1.4.4）。
- 轻轻晃动培养板，并使用倒置的经胰蛋白酶冲洗的玻璃移液管上下吹吸血管系统，以去除任何残留的非血管组织。
- 使用玻璃移液管将视网膜血管系统转移至6孔板中第二个含ddH2O的孔，并于4 °C保存，直至将其固定在载玻片上进行AFM刚度测量。
注意：水合状态的视网膜血管系统（在PBS中）在4 °C下可保持结构完整长达2周。然而，常规刚度测量应使用新鲜分离的毛细血管进行。
- 固定视网膜血管系统用于AFM刚度测量（第4天）
- 使用倒置的经胰蛋白酶冲洗的玻璃移液管，将视网膜血管系统转移至6孔板中第三个含ddH2O的孔，以去除任何残留的胰蛋白酶溶液。
- 使用ddH2O和擦拭纸彻底清洁将用于固定血管网络以进行AFM刚度测量的带电表面显微镜载玻片。
注意：载玻片的带电表面可在AFM测量期间为血管网络提供强结合力。 - 标记载玻片，并用疏水笔在中心周围画出一个直径4-5 cm的圆形区域，以避免后续步骤中液体溢出。
- 使用倒置的经胰蛋白酶冲洗的玻璃移液管，小心地将视网膜血管系统转移至标记区域的中心。
- 使用P200移液器，小心地从一侧边缘尽可能多地吸除多余水分，避免意外将血管系统吸入吸头中。
- 将载玻片置于生物安全柜（BSL-2罩）靠近前侧（滤网侧）的位置，让残留水分自然蒸发。
- 当血管系统接近干燥时，在相差显微镜（4倍放大）下，使用P200移液器缓慢地从标记区域的一侧加入ddH2O，小心地重新水合血管系统。直接将ddH2O滴加在血管系统上会导致其脱落。
- 在4倍和20倍放大下拍摄重新水合后血管系统的相差图像，以确认其具有良好的结构完整性，并充分展开（无折叠）且牢固附着于玻璃载玻片上，这些是获得可靠AFM刚度测量结果的关键条件。
2. 从视网膜微血管内皮细胞（REC）培养物中获取内皮下基质（第1-17天）
注意：本方案改编自 Beacham 等人.15 ，并在近期研究中已有报道4,5,6，描述了在改良玻璃盖玻片上培养 REC，随后进行脱细胞处理以获得内皮下基质，用于后续的原子力显微镜（AFM）刚度测量。
- 明胶包被玻璃盖玻片的制备与细胞接种（第1天）
注意：在组织培养罩内完成明胶包被及后续的 PBS++ 洗涤步骤后，转移至化学通风橱中进行后续的戊二醛和乙醇胺处理步骤。- 将一个经高压灭菌的直径为12 mm的圆形玻璃盖玻片放入无菌24孔板的每个孔中，并向含盖玻片的每孔加入500 µL预热的无菌0.2%（w/v）明胶溶液（用含钙和镁的磷酸盐缓冲液稀释；PBS++），于37 °C孵育1小时。
- 吸除明胶溶液，用无菌PBS++冲洗盖玻片一次，然后每孔加入500 µL 1%（v/v）戊二醛，在室温下作用30分钟以交联包被的明胶。
- 收集并按照机构规定妥善处理戊二醛溶液，随后在室温下将盖玻片置于轨道摇床上，以100 rpm转速用PBS++振荡洗涤5分钟。重复此洗涤步骤5次。前3次洗涤时，使用无菌镊子轻轻提起盖玻片，确保戊二醛被充分洗去。任何残留均可能降低细胞活力。
- 向已交联明胶的盖玻片中每孔加入800 µL 1 M乙醇胺，室温孵育30分钟，以淬灭孔中残留的微量戊二醛。
- 收集并按照机构规定妥善处理乙醇胺溶液，随后在室温下将盖玻片置于轨道摇床上，以100 rpm转速用PBS++振荡洗涤5分钟，共洗涤5次 。前3次洗涤时，使用无菌镊子轻轻提起盖玻片，确保乙醇胺被充分洗去。任何残留均可能降低细胞活力。
- 交联后的盖玻片现已可用于细胞接种。
注意：尽管我们通常在盖玻片制备后立即接种细胞，但也可尝试将交联明胶包被的盖玻片在4 °C的PBS++中保存1–2天后再进行细胞接种，以比较其效果。 - 在组织培养罩内的无菌条件下，将视网膜微血管内皮细胞（RECs）以500 µL/孔的体积接种于培养基中，接种密度应确保在24小时内达到100%汇合，可通过相差显微镜确认。
注意：在24小时内达到汇合至关重要，因为由此产生的REC静息状态将增强细胞分泌基质的能力（参见下一步骤）。根据我们对人源RECs的经验，接种密度为4 × 104 个细胞/cm2 即可在24小时内达到汇合。然而，由于不同物种的RECs大小存在差异（例如小鼠RECs明显更小），初始接种密度可能需要优化。
- 通过REC培养生成内皮下基质（第2–16天）
- 细胞达到汇合后（约24小时），更换新鲜培养基，并添加经无菌过滤的抗坏血酸（终浓度为200 µg/mL）。
注意：此时可开始对RECs施加疾病风险因素（如高糖、晚期糖基化终产物等）或药理学干预，同时继续抗坏血酸处理。 - 每隔一天更换一次含抗坏血酸的培养基，持续15天。
注意：抗坏血酸在溶液中不稳定。应每隔一天新鲜配制100倍浓缩储备液用于培养基补充。
- 细胞达到汇合后（约24小时），更换新鲜培养基，并添加经无菌过滤的抗坏血酸（终浓度为200 µg/mL）。
- 去细胞化REC培养物以获得内皮下基质（第16天）
- 经过15天抗坏血酸处理后，移除培养基，并用无钙镁PBS冲洗细胞。
- 每孔加入250 µL预热的去细胞化缓冲液（含20 mM氢氧化铵和0.5% Triton X-100的PBS溶液），作用约2–3分钟，以去细胞化REC培养物。在相差显微镜（10倍放大）下确认细胞已被完全去除。
- 轻柔移除去细胞化缓冲液，避免扰动REC分泌的内皮下基质，然后向每孔加入0.5 mL PBS。
注意：为确保内皮下基质在此步骤及后续洗涤过程中不脱落，仅使用P1000移液器进行轻柔冲洗，切勿使用真空抽吸。 - 将培养板于4 °C过夜保存，以稳定REC分泌的基质。
- 用DNase处理内皮下基质以去除细胞碎片（第17天）
- 用800 µL PBS/孔冲洗第2.3.4步所得的内皮下基质。
- 轻柔吸除PBS，然后每孔加入200 µL无RNase的DNase I（30 K单位），于37 °C孵育30分钟，以彻底清除所有细胞碎片残留。通过在相差显微镜下仔细观察是否存在细胞碎片，评估DNase处理的效率。
- 轻柔移除DNase I溶液，并用800 µL PBS/孔对内皮下基质进行两次冲洗 。
- 在相差显微镜（10倍放大）下确认宏观纤维状内皮下基质可见。若需观察更精细的纳米级基质纤维，则需通过原子力显微镜（AFM）进行表面形貌扫描，或在100倍放大下对免疫标记的基质蛋白进行高分辨率共聚焦成像。
- 立即使用新鲜（未固定）的内皮下基质进行AFM刚度测定。
- 完成AFM测量后，用1%（v/v）多聚甲醛固定基质样本（室温固定15分钟），随后于4 °C保存，用于后续针对内皮下基质蛋白和/或交联酶的抗体免疫标记。
3. 原子力显微镜刚度测量
注意：本方案改编自标准的原子力显微镜（AFM）用户手册，并参考了近期研究4,5，详细描述了使用原子力显微镜及数据分析软件获取和分析视网膜毛细血管及其下内皮基质硬度数据的方法。尽管下述步骤基于特定型号的原子力显微镜（见材料表），但其基本原理普遍适用于所有型号的原子力显微镜。
- 悬臂探针的选择
注意：柔软的生物样品需要使用较软的悬臂，以便在样品压入时发生弯曲，同时探针的尺寸应与样品的尺寸相匹配。- 对于直径为5-8 µm的小鼠视网膜血管的刚度测量，使用半径为1 µm、弹簧常数（k）为0.2–0.3 N/m的悬臂探针；对于由纳米级纤维组成的内皮下基质的刚度测量，使用半径为70 nm、弹簧常数（k）为0.06–0.1 N/m的悬臂探针。
- 悬臂安装
- 在原子力显微镜（AFM）计算机上，打开控制AFM单元及与相差显微镜相连的摄像头的软件，用于观察悬臂和样品。
- 将悬臂支架固定在悬臂更换架上，在体视显微镜下使用钟表匠镊子将选定的悬臂安装到支架上，避免物理损伤悬臂。拧紧支架上的螺丝以固定悬臂。
- 将悬臂支架放置在支架上的AFM探头端并锁定。
- 使用AFM软件中的步进电机功能，将AFM探头端提升至最高点，并在软件中将该位置设为零点。此步骤可防止在安装AFM探头端（下一步）时意外撞击样品台。
- 小心地从支架上提起AFM探头端，并将其安装到AFM样品台上，将支架的支脚插入对应的插槽中。
- 激光对准
注意：初始激光对准应在无样品条件下进行（即空气模式），以确保激光束更精确地对准悬臂尖端（避免液体中的激光折射）。然而，由于生物样品浸没在折射率不同于空气的介质中，在刚度测量前必须在液体介质中重新对准激光。- 进行空气中激光对准时，将AFM探头端置于样品台上，使用10倍物镜及连接的摄像头在显示器上实时观察悬臂。红外激光对人眼不可见，但可通过CCD相机观察到。
- 在软件中选择“接触模式力谱”功能，并打开名为“激光对准”的窗口。
- 使用AFM探头端上标记为“激光横向”的两个螺丝，将激光束聚焦在悬臂上，使激光对准窗口中的SUM值达到最大。为此，应将激光聚焦在悬臂中心或其附近区域。
- 使用探测器调节螺丝，调整光电探测器，使激光光斑位于激光对准窗口的中心。
- 使用镜片调节螺丝，调整镜片位置，确保SUM值达到尽可能高的水平。
注意：较高的SUM值可确保对样品刚度进行灵敏且准确的评估。因此，应执行激光对准和镜片调节步骤，以获得最高的SUM值。 - 接下来进行液体中的激光对准，向培养皿中加入所需的培养基，并将其牢固地固定在样品台上，以防止任何振动或漂移，这些因素会在样品压入过程中产生测量伪影。
- 在观察聚焦于悬臂的实时摄像头画面的同时，使用步进电机功能将悬臂缓慢浸入液体中。
- 重复步骤3.3.4和3.3.5，确保SUM值保持最高，且激光光斑位于激光对准窗口的中心。
- 悬臂弹簧常数的校准
注意：尽管悬臂探针出厂时已由制造商校准了弹簧常数（k），但在开始测量前独立验证其在液体中的数值仍为良好实验实践。应使用干净的玻璃表面，以最小化悬臂探针与玻璃表面之间的相互作用。- 悬臂施加的设定力决定了力压入过程中允许的激光偏转最大值。初始设定为1.5 V。若在此设定力下悬臂无法接近样品，则逐步增加设定力，直至悬臂压入样品并生成力-压入曲线。
- Z长度 表示在悬臂达到设定点后，Z压电元件回撤的最大距离。Z长度应足够大，以确保悬臂探针与样品完全分离。在玻璃表面校准弹簧常数时，将Z长度设为1 µm。
- Z速度 指在力压入过程中，Z压电元件将悬臂垂直向下移动的速度。该速度需优化：速度过低主要反映样品的黏性行为，速度过高则主要反映其弹性行为。最佳速度应能真实反映生物样品的黏弹性特性。对于黏弹性生物样品，将Z速度设为2 µm/s。
- Z范围中的目标高度 表示在测量完一条力曲线后、移动至样品另一位置前，Z压电元件所处位置与样品之间的大致距离。Z范围目标高度应大于样品特征的高度。将Z范围的目标高度设为7.5 µm。
- 使用步进电机功能，在选择接触模式力谱窗口中的接近功能前，先将悬臂移至接近样品表面的位置（通过10倍放大率下的相差图像判断焦点位置），然后以15 µm的小步长进一步降低悬臂。
- 点击采集以获取一条力曲线。
- 选择力曲线，在校准管理器窗口中打开，并在方法部分选择基于接触的模式。
- 使用选择拟合范围功能，选择悬臂回撤曲线进行线性拟合。接着勾选灵敏度检查框，将力的单位从V转换为N。
- 在液体中将悬臂提升100–200 µm，并选择热噪声功能。再次使用选择拟合范围，用洛伦兹曲线拟合热噪声钟形曲线。完成曲线拟合后，选择弹簧常数（k）框。确认弹簧常数（k）接近制造商提供的数值，并记录该值以供后续参考。校准完成后，设定点的单位将从mV变为nN。
注意：热噪声是悬臂在特定温度下的固有频率。为准确测量弹簧常数，必须对热噪声进行校正。
- 力-距离曲线的采集
- 将载玻片固定的样品（视网膜血管或内皮下基质）放置在AFM样品台上，在软件的实验部分选择接触模式力谱。
- 将设定力设为0.5 nN，点击接近，该值显著高于SAA-SPH 1 µm和PFQNM-LC-A 70 nm两种悬臂探针的热偏转，可确保悬臂平稳接近样品。
- 当悬臂检测到表面并返回其静止目标高度后，将设定力调整为：对于较硬的SAA-SPH 1 µm悬臂探针设为0.2 nN，对于较软的PFQNM-LC-A 70 nm悬臂探针设为0.1 nN。此设定力调整可确保硬悬臂和软悬臂在样品压入过程中均能顺利弯曲（参见第3.1节）。
- 将Z长度设为约2.5 µm，以确保在回撤过程中悬臂探针能与生物样品完全分离（参见步骤3.4.2），并将Z速度设为2 µm/s（参见步骤3.4.3）。
- 使用AFM样品台上的调节螺丝，小心地将悬臂探针定位在样品的期望位置。
注意：由于毛细血管并不总是完全平铺在载玻片上，因此在移动样品台前，建议将悬臂从其静止目标高度再提升10–20 µm。 - 点击接近，先将悬臂靠近样品，然后点击采集，获取目标位置的力曲线。保存所有力曲线以供分析。
- 数据分析
- 在数据处理软件中打开力曲线。
- 选择回撤力曲线进行数据分析（类似于步骤3.4.8）。
- 使用数据平滑功能，通过高斯滤波器对力曲线进行平滑处理，以去除采集数据中的无关噪声。
- 使用基线扣除功能，将力曲线中（非接触）基线部分的斜率和幅值调整为零。
- 点击接触点功能，自动将力曲线的接触点移至X轴和Y轴的(0,0)坐标。
- 使用垂直探针位置功能，通过校正任何样品压入量，计算悬臂在Y轴上的实际垂直位置。
- 在处理后的力曲线上应用弹性拟合功能，首先选择探针形状和半径（根据所选悬臂探针），然后使用赫兹/斯内登（Hertz/Sneddon）模型进行力曲线拟合。
- 如果70 nm半径探针对基质的压入深度超过70 nm（通常如此），则选择抛物面体探针形状；对于毛细血管刚度测量，1 µm半径探针对样品的压入深度从不超过1 µm，因此选择球形探针形状。此外，如果拟合曲线的接触点与实际回撤曲线的接触点不一致，则勾选移动曲线复选框。
- 记录并保存杨氏模量（刚度）的数值。
结果
小鼠视网膜毛细血管
分离的视网膜毛细血管进行原子力显微镜（AFM）刚度测量时，样品处理步骤可能破坏其力学-结构完整性。为防止此类损伤，从而确保AFM测量的可行性、可靠性和可重复性，在眼球摘除后，需在4 °C条件下用5%甲醛溶液固定过夜，再进行血管分离。该温和固定方案采用较低的甲醛浓度、较低的固定温度、较短的固定时间，且不穿刺角膜，旨在最大限度地减少化学固定可能引起的交联或硬化等假象。如图2B、C所示，这种相对温和的固定方式可确保分离出的视网膜血管结构完整，具有足够的机械耐久性，适用于AFM测量。相比之下，从未固定眼球（采用低渗法）4或短暂固定眼球（固定8小时）中分离的视网膜血管则容易发生断裂或塌陷，因而无法用于AFM测量（图2B）。
视网膜内皮下基质
血管硬度反映了血管细胞与基底膜（内皮下基质）硬度的综合特性4。由于细胞会通过改变自身硬度以适应基质硬度，这一过程称为力学互惠性9，因此内皮下基质硬度成为决定整体血管硬度的重要因素。在测量基质硬度时，获得均匀致密的内皮下基质至关重要。对于在添加抗坏血酸的培养基中培养的人视网膜内皮细胞（ECs），通常需要10–15天(图3A)4,5,6。培养时间的差异可能源于市售原代视网膜内皮细胞批次之间的差异。此外，我们通常发现，与原代人视网膜内皮细胞培养相比，来自C57BL/6小鼠的市售视网膜内皮细胞沉积的基质更为致密，表明存在物种特异性差异。如图3A所示，相差显微图像仅能从宏观尺度上提供基质的大致形态。然而，在使用针对基质结构蛋白IV型胶原和纤连蛋白的抗体对基质进行免疫标记后，通过高分辨率共聚焦荧光成像可清晰观察到基质在纳米至微米尺度上的纤丝结构(图3B)。需要注意的是，这些基质蛋白还可通过与特定整合素受体结合，向内皮细胞传递指导性信号9。
原子力显微镜刚度测量
选择合适的悬臂梁刚度（弹簧常数，k）和探针尺寸对于获得可靠且灵敏的测量结果至关重要。这些参数应根据生物样品的刚度和尺寸进行匹配。在将选定的悬臂梁安装到原子力显微镜（AFM）上后，必须将红外激光束聚焦于悬臂梁末端，并使反射的激光光斑位于光电探测器的中心位置。这种激光对准可确保对悬臂梁偏转进行精确且灵敏的检测，从而实现准确的刚度测量。AFM刚度测量开始时，z轴压电陶瓷驱动悬臂梁垂直向下移动靠近样品。此时悬臂梁无偏转，进而在接近曲线中形成一条平坦的基线 (图4A)。当悬臂梁探针接触并压入样品时，悬臂梁发生弯曲，导致激光在光电探测器上发生偏转，这在接近曲线中表现为垂直方向的偏转。当对样品施加预设的压入力（设定力）后，悬臂梁从样品表面回撤至起始位置（Z目标高度）。随后，将偏转的回撤曲线拟合至赫兹/斯内登（Hertz/Sneddon）模型，以计算样品的杨氏模量（刚度）。
从图4所示的代表性力-压痕测量结果可以看出，从糖尿病小鼠分离的视网膜毛细血管获得的压入和回缩曲线(图4B)明显比非糖尿病小鼠的曲线(图4A)更陡峭。力-压痕曲线斜率更陡表明样品对压痕力的阻力更大，导致悬臂偏转更显著，反映出样品刚度更高13。事实上，对多条力-压痕曲线的后续数据分析表明，糖尿病小鼠的视网膜毛细血管刚度显著增加4。还应注意的是，悬臂探针与生物样品接触时常会引起非特异性表面黏附，导致回缩过程中悬臂出现负向偏转，表现为回缩曲线延伸至基线以下(图4B)。此外，细胞、基质和血管等生物样品本质上具有黏弹性，因此在受力压痕后可能发生一定程度的永久形变和/或表观刚度变化。若发生此类情况，则会在压入与回缩曲线之间出现不重合（滞后现象）。事实上，比较图4A与图4B可证实预期趋势：非糖尿病小鼠中较柔软的毛细血管在受力压痕后表现出的滞后程度大于其刚度更高的对应物。如先前报道5,6，视网膜内皮细胞培养获得的内皮下基质的刚度（杨氏模量）也可采用上述方法计算。
图1：小鼠眼球切口示意图，用于视网膜分离。 使用镊子夹住视神经，用手术刀在角膜缘后方做一完整切口，以将小鼠视网膜与晶状体及前房分离。紫色虚线表示垂直切口的位置。该示意图使用科学图像与绘图软件绘制。请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：用于原子力显微镜（AFM）测量的小鼠视网膜完整血管分离方案的优化。 （A）体视显微镜图像显示从小鼠眼球中分离出的完整视网膜，该眼球经轻度固定处理，尚未进行毛细血管分离步骤。比例尺：2 mm。（B）代表性相差显微图像（4倍放大）展示了采用不同分离方法获得的小鼠视网膜血管。通过比较分离血管的结构完整性和耐久性，发现将眼球摘除后的小鼠眼球在4 °C条件下用5%甲醛固定24小时，再进行胰蛋白酶消化（红色框），可获得最适合用于AFM刚度测量的视网膜血管网络。采用该方法分离的视网膜血管呈现出清晰且均匀铺展于玻璃表面的血管网络。比例尺：500 µm。（C）高倍放大（20倍）视野下完整的视网膜毛细血管网络（类似于B图所示），进一步证实了来自轻度固定眼球的毛细血管具有良好的结构完整性。比例尺：100 µm。本图经修改自4。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：源自原代人和小鼠REC培养的脱细胞基质。（A）代表性20倍相差显微图像，显示人或小鼠REC培养10天（10 d）或15天（15 d）后经脱细胞处理，在玻璃盖玻片上形成的内皮下基质聚集体。比例尺：100 µm。（B）源自15天人REC培养物的脱细胞基质的代表性高倍（100倍）共聚焦荧光图像，经抗IV型胶原和抗纤连蛋白抗体标记，显示致密的纳米纤维状IV型胶原与纤连蛋白基质。比例尺：20 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：小鼠视网膜毛细血管刚度测量中原子力显微镜（AFM）获得的力-距离曲线。 折线图显示了来自一只（A）非糖尿病或（B）糖尿病小鼠分离出的视网膜毛细血管某一位置单次力压痕测量的代表性接近（浅色）和回缩（深色）曲线。使用SAA-SPH 1 µm半径半球形悬臂探针获得的力曲线，描绘了悬臂-样品距离（由z压电驱动器控制）与引起悬臂偏转的施加垂直力之间的关系。（A）黄色箭头表示由z压电驱动的悬臂向样品接近过程，白色箭头表示悬臂探针与样品接触的接触点，绿色箭头表示悬臂偏转至设定值（峰值）压痕力（*）的过程。（B）从糖尿病小鼠分离出的视网膜毛细血管获得的接近和回缩曲线均表现出比非糖尿病小鼠明显更陡的斜率（如A图所示），表明糖尿病小鼠毛细血管刚度更高。箭头指示回缩曲线中低于基线的下陷，反映了在压痕过程中探针与样品之间的黏附力导致悬臂探针产生负偏转。请点击此处查看此图的放大版本。
讨论
原子力显微镜（AFM）已广泛用于测量主动脉和动脉等较大血管在疾病相关状态下刚度的变化16。这些研究结果有助于确立内皮细胞力学生物学在动脉粥样硬化等心血管并发症中的作用17。基于这些发现，我们开始探索内皮细胞力学生物学在早期糖尿病视网膜病变（DR）视网膜微血管损伤发展过程中此前未被认识的作用。然而，这一研究的成功依赖于对糖尿病引起视网膜毛细血管刚度变化的精确测量。最近的研究表明，与大血管类似，视网膜毛细血管以及视网膜内皮细胞分泌的内皮下基质的刚度也可以通过原子力显微镜（AFM）进行直接、准确且可靠的测量4,5,6。
该方法通过胰蛋白酶消化从轻度固定的鼠眼组织中分离视网膜毛细血管。根据经验，此轻度固定步骤十分必要，因为从未固定眼球（采用低渗法）分离的毛细血管较为脆弱，易发生断裂，因而不适合进行原子力显微镜（AFM）刚度测量4。相反，过度固定以及随之所需的强烈胰蛋白酶消化（其他视网膜胰蛋白酶消化方案中已有报道）18也可能破坏毛细血管的结构完整性，表现为紧密连接的断裂。因此，本方法采用的轻度毛细血管固定和温和胰蛋白酶消化有助于减少因甲醛过度交联引起的刚度伪影，同时确保毛细血管结构的完整性，从而实现可靠的AFM刚度测量。
作为一种替代方法，最近一项研究报道了对轻度固定的视网膜铺片中的视网膜毛细血管进行原子力显微镜（AFM）刚度测量19。该方法通过对完整视网膜内的毛细血管实施AFM力-压痕操作，实现了原位（in situ）刚度测量。然而，这些毛细血管的刚度测量值可能包含了内界膜的刚度成分。此外，该方法仅限于测量视网膜铺片表面可及的浅层毛细血管，而无法检测在早期糖尿病视网膜病变（DR）中特别受累的深层毛细血管丛20。本研究采用的方法可从所有视网膜层中干净地提取血管（无残留视网膜组织），从而解决了上述问题。目前，我们正在优化该方案，以从早期年龄相关性黄斑变性（AMD）动物模型中分离脉络膜血管。需要指出的是，本方案中使用的轻度甲醛固定可能在AFM测量中引起交联相关的刚度伪影。因此，在解读通过该方法获得的血管刚度值时，应更侧重于不同实验组之间的相对刚度变化，而非绝对刚度值。
与需要轻度固定的视网膜毛细血管不同，源自视网膜内皮细胞培养的血管内皮下基质可在无需任何修饰的情况下进行评估。这主要归因于所沉积基质的稳定性，其稳定性源于多种因素的共同作用，包括在培养基中添加抗坏血酸（可增强胶原蛋白合成）15），防止脱细胞过程中基质脱落的玻璃盖玻片化学修饰，以及延长培养时间（10–15天）。重要的是，我们已证明高血糖诱导的基底内皮下基质刚度增加 体外 与糖尿病引起的视网膜毛细血管僵硬度增加一致 体内4这一点并不令人意外，因为基质硬度的增加会通过力学互惠效应导致其上方的视网膜内皮细胞（ECs）硬度增加，二者共同作用使得毛细血管整体硬度上升。事实上，我们近期已证实，在糖尿病条件下培养的视网膜内皮细胞会变得更硬4，可能通过增加Rho/ROCK依赖性的肌动蛋白细胞骨架张力所致21这些发现还表明，在早期年龄相关性黄斑变性恒河猴模型中观察到的脉络膜内皮细胞僵硬，反映了脉络膜内皮下基质及完整血管的僵硬程度增加。12，这一假设正在持续开展的研究中得到验证。总体而言，未固定视网膜血管下基质及内皮细胞的刚度变化趋势与轻度固定的完整视网膜血管中观察到的变化趋势一致，这证明了轻度固定方法的可靠性。
对糖尿病视网膜病变（DR）动物模型中视网膜毛细血管进行直接刚度测量，不仅有助于确立内皮细胞力学生物学作为DR治疗的新靶点，也为未来开发用于无创评估DR患者视网膜毛细血管刚度的高灵敏成像技术提供了有力依据。此类无创技术有望检测由毛细血管僵硬化引起的血流微小变化，类似于糖尿病引起的心血管疾病中常检测到的动脉脉搏波速度变化。对来自糖尿病供体死后人眼分离的视网膜毛细血管进行原子力显微镜（AFM）刚度测量，将在这一方面提供重要的概念验证。鉴于在1型糖尿病（链脲佐菌素诱导）小鼠模型中，视网膜毛细血管刚度在疾病早期即已升高4，若能成功利用AFM验证刚度测量成像技术，或将促使视网膜毛细血管刚度被确立为早期DR发病机制的临床生物标志物。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院国家眼科研究所（National Eye Institute/NIH）R01EY028242 基金（资助 K.G.）、防盲研究组织/国际视网膜研究基金会（Research to Prevent Blindness/International Retinal Research Foundation）针对年龄相关性黄斑变性（AMD）的创新研究方法催化剂奖（资助 K.G.）、W.M. Keck 基金会资助的斯蒂芬·瑞安黄斑变性研究倡议（Stephen Ryan Initiative for Macular Research, RIMR）特别基金（资助 Doheny 眼科研究所）以及乌苏拉·曼德尔奖学金（Ursula Mandel Fellowship）和加州大学洛杉矶分校研究生理事会多元化奖学金（UCLA Graduate Council Diversity Fellowship）（资助 I.S.T.）的支持。此外，本研究还获得了防盲研究公司（Research to Prevent Blindness, Inc.）向加州大学洛杉矶分校眼科系提供的无限制资助。 本文内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 视网膜毛细血管分离 | |||
| 0.22 µm PVDF 注射器滤器 | Merck Millipore | SLGVM33RS | 低蛋白结合力 Durapore |
| 不含钙和镁的10X Dulbecco's 磷酸盐缓冲液 | Corning | 20-031-CV | 终浓度1X，pH 7.4 |
| 12孔板 | Falcon Corning | 353043 | |
| 15 mL 离心管 | Corning | 430791 | RNase-DNase-free，无热原 |
| 20 mL 鲁尔锁注射器 | BD | 302830 | |
| 5 3/4 英寸一次性硼硅酸盐玻璃/非无菌巴斯德吸管 | FisherBrand | 13-678-20A | |
| 60x15 mm 组织培养皿 | Falcon Corning | 353002 | |
| 6孔板 | Falcon Corning | 353046 | |
| Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL 笔式吸液器 | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| 刀片架 | X-ACTO | ||
| 碳钢手术刀片 #10 | Bard-Parker | 371110 | |
| 牙科蜡 | Electron Microscopy Sciences | 50-949-027 | |
| 解剖显微镜 | Am-scope | ||
| 中性缓冲福尔马林溶液，10% | Millipore Sigma | HT501128-4L | 终浓度5%（v/v） |
| Kimwipes - 擦拭纸 | Kimtech Science | 34133 | |
| 微型刮勺 | Fine Science Tools | 10089-11 | |
| 轨道摇床 | Lab Genius | SK-O180 | |
| PELCO Economy #7 不锈钢 115mm 镊子 | Ted Pella, Inc. | 5667 | |
| 相差显微镜 | Nikon TS2 | ||
| Purifier Logic+ II级A2型生物安全柜 | Labconco | 302380001 | |
| Safe-Lock 微量离心管 2 mL | Eppendorf | 22363352 | |
| 体视显微镜 | AmScope | SM-3 系列变倍三目体视显微镜 3.5X-90X | |
| Superfrost Plus 显微镜载玻片 - 白色标签 - 预清洁 - 25x75x1.0 mm | FisherBrand | 1255015 | |
| Tris 缓冲液，0.1M 溶液，pH 7.4 - 生物技术级 | VWR | E553-500ML | 胰蛋白酶溶液用 pH 8 |
| 胰蛋白酶 1:250 粉末，组织培养级 | VWR | VWRV0458-25G | 10%（w/v）胰蛋白酶溶液 |
| 分子生物学级水 | Corning | 46-000-CM | |
| 内皮下基质 | |||
| 10X PBS | Corning | 20-031-CV | |
| 含钙和镁的1X PBS | Thermo Fisher Scientific | 14040-117 | pH 7.4 |
| 氨水 | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| IV型胶原抗体 | Novus Biologicals | NBP1-26549 | |
| DNase I | Qiagen | 79254 | |
| 乙醇胺 | Sigma-Aldrich | 398136 | |
| 纤连蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | F6140 | |
| Fluoromount | Invitrogen-Thermo Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
| 明胶 | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| 玻璃盖玻片（12mm） | Fisher | 12-541-000 | |
| 戊二醛 | Electron microscopy Sciences | 16220 | |
| 人视网膜内皮细胞（HREC） | Cell Systems Corp | ACBRI 181 | |
| MCDB131 培养基 | Corning | 15-100-CV | |
| 小鼠视网膜内皮细胞（mREC） | Cell Biologics | C57-6065 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP151-100 | |
| 胰蛋白酶 | Gibco-Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | |
| 原子力显微镜测量 | |||
| 1 µm 探针 | Bruker | SAA-SPH-1UM | 高19微米的半球形探针，末端半径1 微米，弹簧常数0.25N/m |
| 70 nm LC 探针 | Bruker | PFQNM-LC-V2 | 高19微米的半球形探针，末端半径70nm， 弹簧常数0.1N/m |
| 摄像头 | XCAM 系列 | Toupcam | 1080P HDMI |
| 用于运行摄像头的台式机 | Asus | Asus 台式机 | Intel i5-6600 CPU，8GB 内存 |
| 盖玻片用培养皿支架 | Cellvis | D29-14-1.5-N | 29mm 玻璃底培养皿，带 14 mm 微孔 |
| Nanowizard 4 | Bruker | Nanowizard 4 | 安装在光学显微镜上的生物科学原子力显微镜，用于灵敏测量软性生物样品的力学结构特性（刚度和形貌） |
| 相差显微镜 | Zeiss | Axiovert 200 | 配备10X物镜的倒置显微镜 |
参考文献
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