我们近期发现视网膜毛细血管硬化是糖尿病相关视网膜功能障碍的一种新范式。本实验方案详细阐述了从小鼠视网膜毛细血管及视网膜内皮细胞培养物中分离视网膜毛细血管及其内皮下基质的步骤，随后介绍了利用原子力显微镜测量其硬度的技术方法。
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摘要
摘要
视网膜毛细血管退化是糖尿病性视网膜病变（DR）早期阶段的临床特征。我们最近的研究表明，糖尿病引起的视网膜毛细血管僵硬在炎症介导的视网膜毛细血管退化过程中起着关键且此前未被认识的因果作用。视网膜毛细血管僵硬度的增加源于赖氨酰氧化酶的过表达，该酶可交联并硬化内皮下基质。由于在早期阶段干预DR有望预防或延缓DR的进展及相关视力丧失，因此内皮下基质和毛细血管僵硬度成为早期DR管理中相关且新颖的治疗靶点。此外，直接测量视网膜毛细血管僵硬度可为开发用于在动物和人类受试者中无创评估视网膜毛细血管僵硬度的新成像技术提供关键的临床前验证步骤。基于这一考虑，本文提供了利用原子力显微镜分离并测量小鼠视网膜毛细血管及内皮下基质僵硬度的详细实验方案。
引言
视网膜毛细血管对于维持视网膜稳态和视觉功能至关重要。事实上，在糖尿病早期发生的毛细血管退化与糖尿病性视网膜病变（DR）这一威胁视力的并发症的发生密切相关。DR是一种微血管疾病，影响近40%的糖尿病患者1。血管炎症在DR中显著促进视网膜毛细血管的退化。以往的研究已证明，异常的分子和生化信号在糖尿病诱导的视网膜血管炎症中发挥重要作用2,3。然而，近期研究提出了DR发病机制的新范式，指出视网膜毛细血管僵硬是导致视网膜血管炎症和退化的关键因素，这一因素此前未被认识4,5,6。
具体而言，糖尿病引起的视网膜毛细血管刚性增加是由于视网膜内皮细胞（ECs）中胶原交联酶赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase, LOX）表达上调所致，该酶可导致内皮下基质（基底膜）硬化4,5,6。基质硬化反过来通过力学互作使覆盖其上的....
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方案
所有动物实验均遵循视力与眼科学研究协会（ARVO）关于在眼科与视觉研究中使用动物的声明，并经加州大学洛杉矶分校机构动物护理与使用委员会（IACUC；方案编号 ARC-2020-030）批准（OLAW 机构动物福利保证编号 A3196-01）。以下实验方案使用从成年（20周龄）雄性C57BL/6J小鼠视网膜毛细血管进行，小鼠体重约为25 g（糖尿病小鼠）和32 g（非糖尿病小鼠；Jackson Laboratory）。
1. 用于原子力显微镜刚度测量的小鼠视网膜毛细血管分离（第1-4天）
注意：本方案来自最近的一项研究4，详细描述了小鼠眼球的去核与轻度固定、视网膜分离、胰蛋白酶消化，以及随后将获得的视网膜血管系统置于显微镜载玻片上进行原子力显微镜（AFM）刚度测量的操作步骤。
- 去核与轻度固定（第1天）
- 通过暴露于二氧化碳后行颈椎脱位处死小鼠，将显微镊子插入眼球后方，夹住肌肉附着点，小心地将眼球拉出，注意不要过度夹紧镊子，以免切断视神经。
- 将去核后的眼球置于含5%（v/v）甲醛的PBS中，4 °C下固定24小时，以实现轻度固定。
注意：根据经验4，未固定或固定程度更轻的眼球会产生脆弱的毛细血管，在原子力显微镜（A....
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结果
小鼠视网膜毛细血管
分离的视网膜毛细血管进行原子力显微镜（AFM）刚度测量时，样品处理步骤可能破坏其力学-结构完整性。为防止此类损伤，从而确保AFM测量的可行性、可靠性和可重复性，在眼球摘除后，需在4 °C条件下用5%甲醛溶液固定过夜，再进行血管分离。该温和固定方案采用较低的甲醛浓度、较低的固定温度、较短的固定时间，且不穿刺角膜，旨在最大限度地减少化学固定可能引起的交联或硬化等假象。如图2B、C所示，这种相对温和的固定方式可确保分离出的视网膜血管结构完整，具有足够的机械耐久性，适用于AFM测量。相比之下，从未固定眼球（采用低渗法）4或短暂固定眼球（固定8小时）中分离的视网膜血管则容易发生断裂或塌陷，因而无法用于AFM测量（图2B）。
视网膜内皮下基质
血管硬度反映了血.......
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讨论
原子力显微镜（AFM）已广泛用于测量主动脉和动脉等较大血管在疾病相关状态下刚度的变化16。这些研究结果有助于确立内皮细胞力学生物学在动脉粥样硬化等心血管并发症中的作用17。基于这些发现，我们开始探索内皮细胞力学生物学在早期糖尿病视网膜病变（DR）视网膜微血管损伤发展过程中此前未被认识的作用。然而，这一研究的成功依赖于对糖尿病引起视网膜毛细血管刚度变化的精确测量。最近的研究表明，与大血管类似，视网膜毛细血管以及视网膜内皮细胞分泌的内皮下基质的刚度也可以通过原子力显微镜（AFM）进行直接、准确且可靠的测量4,5,6。
该方法通过胰蛋白酶消化从轻度固定的鼠眼组织中分离视网膜毛细血管。根据经验，此轻度固定步骤十分必要，因为从未固定眼球（采用低渗法）分离的毛细血管较为脆弱，易发生断裂，因而不适合进行原子力显微镜（.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院国家眼科研究所（National Eye Institute/NIH）R01EY028242 基金（资助 K.G.）、防盲研究组织/国际视网膜研究基金会（Research to Prevent Blindness/International Retinal Research Foundation）针对年龄相关性黄斑变性（AMD）的创新研究方法催化剂奖（资助 K.G.）、W.M. Keck 基金会资助的斯蒂芬·瑞安黄斑变性研究倡议（Stephen Ryan Initiative for Macular Research, RIMR）特别基金（资助 Doheny 眼科研究所）以及乌苏拉·曼德尔奖学金（Ursula Mandel Fellowship）和加州大学洛杉矶分校研究生理事会多元化奖学金（UCLA Graduate Council Diversity Fellowship）（资助 I.S.T.）的支持。此外，本研究还获得了防盲研究公司（Research to Prevent Blindness, Inc.）向加州大学洛杉矶分校眼科系提供的无限制资助。 本文内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 视网膜毛细血管分离 | |||
| 0.22 µm PVDF 注射器滤器 | Merck Millipore | SLGVM33RS | 低蛋白结合力 Durapore |
| 不含钙和镁的10X Dulbecco's 磷酸盐缓冲液 | Corning | 20-031-CV | 终浓度1X，pH 7.4 |
| 12孔板 | Falcon Corning | 353043 | |
| 15 mL 离心管 | Corning | 430791 | RNase-DNase-free，无热原 |
| 20 mL 鲁尔锁注射器 | BD | 302830 | |
| 5 3/4 英寸一次性硼硅酸盐玻璃/非无菌巴斯德吸管 | FisherBrand | 13-678-20A | |
| 60x15 mm 组织培养皿 | Falcon Corning | 353002 | |
| 6孔板 | Falcon Corning | 353046 | |
| Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL 笔式吸液器 | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| 刀片架 | X-ACTO | ||
| 碳钢手术刀片 #10 | Bard-Parker | 371110 | |
| 牙科蜡 | Electron Microscopy Sciences | 50-949-027 | |
| 解剖显微镜 | Am-scope | ||
| 中性缓冲福尔马林溶液，10% | Millipore Sigma | HT501128-4L | 终浓度5%（v/v） |
| Kimwipes - 擦拭纸 | Kimtech Science | 34133 | |
| 微型刮勺 | Fine Science Tools | 10089-11 | |
| 轨道摇床 | Lab Genius | SK-O180 | |
| PELCO Economy #7 不锈钢 115mm 镊子 | Ted Pella, Inc. | 5667 | |
| 相差显微镜 | Nikon TS2 | ||
| Purifier Logic+ II级A2型生物安全柜 | Labconco | 302380001 | |
| Safe-Lock 微量离心管 2 mL | Eppendorf | 22363352 | |
| 体视显微镜 | AmScope | SM-3 系列变倍三目体视显微镜 3.5X-90X | |
| Superfrost Plus 显微镜载玻片 - 白色标签 - 预清洁 - 25x75x1.0 mm | FisherBrand | 1255015 | |
| Tris 缓冲液，0.1M 溶液，pH 7.4 - 生物技术级 | VWR | E553-500ML | 胰蛋白酶溶液用 pH 8 |
| 胰蛋白酶 1:250 粉末，组织培养级 | VWR | VWRV0458-25G | 10%（w/v）胰蛋白酶溶液 |
| 分子生物学级水 | Corning | 46-000-CM | |
| 内皮下基质 | |||
| 10X PBS | Corning | 20-031-CV | |
| 含钙和镁的1X PBS | Thermo Fisher Scientific | 14040-117 | pH 7.4 |
| 氨水 | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| IV型胶原抗体 | Novus Biologicals | NBP1-26549 | |
| DNase I | Qiagen | 79254 | |
| 乙醇胺 | Sigma-Aldrich | 398136 | |
| 纤连蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | F6140 | |
| Fluoromount | Invitrogen-Thermo Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
| 明胶 | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| 玻璃盖玻片（12mm） | Fisher | 12-541-000 | |
| 戊二醛 | Electron microscopy Sciences | 16220 | |
| 人视网膜内皮细胞（HREC） | Cell Systems Corp | ACBRI 181 | |
| MCDB131 培养基 | Corning | 15-100-CV | |
| 小鼠视网膜内皮细胞（mREC） | Cell Biologics | C57-6065 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP151-100 | |
| 胰蛋白酶 | Gibco-Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | |
| 原子力显微镜测量 | |||
| 1 µm 探针 | Bruker | SAA-SPH-1UM | 高19微米的半球形探针，末端半径1 微米，弹簧常数0.25N/m |
| 70 nm LC 探针 | Bruker | PFQNM-LC-V2 | 高19微米的半球形探针，末端半径70nm， 弹簧常数0.1N/m |
| 摄像头 | XCAM 系列 | Toupcam | 1080P HDMI |
| 用于运行摄像头的台式机 | Asus | Asus 台式机 | Intel i5-6600 CPU，8GB 内存 |
| 盖玻片用培养皿支架 | Cellvis | D29-14-1.5-N | 29mm 玻璃底培养皿，带 14 mm 微孔 |
| Nanowizard 4 | Bruker | Nanowizard 4 | 安装在光学显微镜上的生物科学原子力显微镜，用于灵敏测量软性生物样品的力学结构特性（刚度和形貌） |
| 相差显微镜 | Zeiss | Axiovert 200 | 配备10X物镜的倒置显微镜 |
参考文献
- Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), e93751(2017).
- Roy, S., Kern, T. S., Song, B., Stuebe, C. Mechanistic in....
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