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研究文章

红景天苷线粒体保护作用的机制研究 通过 缺氧HT22细胞中的AMPK/Sirt1/HIF-1α通路

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DOI：

10.3791/66923

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2025年4月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Research Service Office, Traditional Chinese Medicine Hospital of Meishan

本文内容

摘要

本研究发现了一种红景天苷通过AMPK/Sirt1/HIF-1α通路在缺氧HT22细胞中发挥线粒体保护作用的独特机制。

摘要

红景天苷（Sal）是红景天（Rhodiola crenulata (Hook. f. et Thoms.) H. Ohba）的一种活性成分，已被发现可通过改善代谢、增强脑细胞在缺氧条件下的能量供应而发挥线粒体保护作用。然而，其作用机制尚未完全阐明。本研究首先采用高效液相色谱法分析Sal对核苷酸（ATP、ADP和AMP）水平的影响；随后选用细胞热转移分析法（CETSA）——一种广泛用于在不同物种的细胞和组织中验证并定量药物靶点结合的分子互作方法，以确认Sal与AMPK/Sirt1/HIF-1α通路相关蛋白的亲和力。结果显示，Sal在缺氧的HT22细胞中可升高ATP和ADP水平，同时降低AMP水平；此外，Sal与AMPKα、p-AMPKα、Sirt1及HIF-1α蛋白均表现出稳定的结合能力。综上所述，Sal可能通过调控AMPK/Sirt1/HIF-1α通路来调节核苷酸含量，从而发挥线粒体保护作用。本研究为细胞样本中核苷酸含量的分析提供了方法学参考，并有助于中药来源化合物作用靶点的识别与发现。

引言

由于大脑具有高代谢需求、有限的糖酵解能力以及对氧化磷酸化的依赖性，因此对氧气极为敏感。因此，暴露于高海拔低氧环境容易导致低压性低氧脑损伤（HHBI）1,2。流行病学研究表明，未经高原习服的个体快速进入高海拔地区后，急性高山病的发病率可高达75%，重症病例的病死率约为1%。此外，若缺乏医疗救治，高原性脑水肿或肺水肿的死亡率可高达40%3,4。

高原性脑损伤（HHBI）的临床表现具有广泛的谱系。轻度至中度病例可能包括头痛、头晕和记忆力减退5，而重度病例则可能导致认知功能障碍、意识改变，甚至危及生命的后果5。在高原地区预防和治疗高原性脑损伤已成为医学研究的重点。预防策略主要包括在高原环境中的适应性训练，如保证充分休息、均衡饮食、合理营养以及适度的体育锻炼6,7。此外，以保护脑细胞和缓解脑缺氧为目标的药物干预措施，仍是当前高原性脑损伤研究的核心内容。

线粒体是细胞内主要的能量生产中心，通....

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方案

本研究中所用试剂和设备的商业信息详见材料表。

1. 溶液配制

  1. 通过添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素配制完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。
  2. 将3 mg Sal溶解于500 µL磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制20 mM Sal溶液21。
  3. 使用0.45 µm有机膜过滤500 mL色谱纯乙腈（流动相A）。
  4. 向1 L去离子水中加入3.5 mL试剂I，配制1000 mL流动相B。根据核苷酸（ATP、ADP和AMP）含量检测试剂盒的说明书，用试剂II调节pH至6.15（参见材料表）。
    注意：试剂I和试剂II包含在核苷酸（ATP、ADP和AMP）含量检测试剂盒中。
  5. 使用0.22 µm水相膜过滤流动相B。
    注意：流动相B应在配制后立即使用。流动相A和B在使用前应超声30分钟以去除气泡。
  6. 用去离子水稀释1 µM ATP、ADP和AMP标准储备液，得到0.5 µM、0.1 µM、0.05 µM、0.01 µM和0.005 µM的ATP、ADP和AMP系列标准溶液。
  7. 使用0.22 µm针式微孔滤膜过滤系列标准溶液。
    注意：应使用棕色进样瓶储存系列标准溶液。....

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结果

通过高效液相色谱法（HPLC）检测得到的 ATP、ADP 和 AMP 的标准曲线分别为 Y = 7006.5X - 222.99、Y = 5217.3X - 17.796 和 Y = 9280.1X + 22.749（图 1A–C）。各组中核苷酸含量通过 HPLC 测定，并利用上述标准曲线进行计算（图 1D–I）。结果显示，与对照组相比，CoCl2 显著降低了 HT22 细胞中的 ATP 和 ADP 水平（P < 0.01，图 1J、K）。此外，与 CoCl2 处理组相比，给予 AMPK 抑制剂 dorsomorphin（Dor）后，ATP 和 ADP 水平进一步显著降低（P < 0.01，

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讨论

线粒体是参与HHBI治疗预防的关键细胞器23,24,25。该研究团队先前的研究已证实，Sal可调节AMPK、Sirt1和HIF-1α蛋白的表达，增强神经元线粒体功能，从而对HHBI起到保护作用21,24。然而，Sal在缺氧细胞中对核苷酸的直接作用仍需进一步研究。此外，在不同温度条件下评估化合物与蛋白质之间的结合潜力，对于理解其相互作用至关重要。

为探讨这些方面，本研究采用高效液相色谱法（HPLC）检测了Sal对HT22细胞线粒体中ATP、ADP和AMP水平的影响，从而直接揭示其在线粒体能量代谢中的作用。根据既往研究18，选用250 µM的CoCl2诱导HT22细胞产生缺氧状态。结果显示，在缺氧的HT22细胞中，S.......

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作受到国家自然科学基金（82274207 和 82474185）以及科学技术 &四川省科技厅（2024NSFSC1845）、青年科学基金 &四川省科技厅（2023NSFSC1776）、宁夏重点研发计划（2023BEG02012）、中华中医药学会2024—2026年度青年人才支持项目（2024-QNRC2-B07）以及成都中医药大学杏林学者科研提升项目（XKTD2022013 和 QJJJ2024027）。

作者贡献：
Xiaobo Wang、Yating Zhang、Ya Hou、Rui Li 和 Xianli Meng 构思了本项目。Yating Zhang、Ya Hou 和 Tingting Kuang 进行了实验并分析了数据。Yating Zhang 和 Hong Jiang 撰写了稿件。Xiaobo Wang 和 Xianli Meng 对稿件进行了修改。所有作者均已阅读并批准了最终稿件。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙腈AladdinA104440
0.22 µm 水性膜JintengJTMF0445
0.22 µm针型微孔滤膜JintengJTSFM013001
0.45 µ有机膜JintengJTMF0448
安捷伦 OpenLab 软件  安捷伦版本 2.X
抗体-AMPKα细胞信号技术公司#2532
抗体-HIF-1αCell Signaling Technology#41560
抗体-p-AMPKα细胞信号技术公司#50081
抗体-Sirt1Cell Signaling Technology#2028
抗体-β-肌动蛋白细胞信号技术公司#4970
BCA 蛋白浓度测定试剂盒Boster Biological Technology17E17B46
牛血清白蛋白Cywin创新（北京）生物科技有限公司SW127-02
广谱磷酸酶抑制剂（100×)Boster Biological TechnologyAR1183
色谱柱安捷伦SB-C18
CoCl2Sigma15862
脱色摇床Kylin-BellTS-2
DorsomorphinMedChemExpress (MCE)HY-13418A
杜尔贝科改良伊格尔培养基Gibco8121587
电泳缓冲液NCM Biotech20230801
胎牛血清Gibco2166090RP
山羊抗兔IgG H&L（TRITC）ZenBioScience有限公司511202
GraphPad Prism 软件GraphPad 软件有限责任公司版本 9.0.0
高效液相色谱安捷伦1260 Infinity II Prime 
高速冷冻离心机赛默飞世尔科技Legend Micro 17R
HRP标记的Affinipure山羊抗兔IgG(H+L)Boster 生物技术有限公司BA1054
HT22细胞广州杰诺生物技术有限公司JNO-02001
高敏ECL化学发光试剂盒NCM BiotechP10300
Image J 软件美国国立卫生研究院v1.8.0
金属加热温度控制仪Baiwan Electronic Technology Co., Ltd.HG221-X3
甲醇AladdinM116118
核苷酸（ATP、ADP 和 AMP）含量检测试剂盒北京索莱宝科学技术 &科技有限公司BC5114
PAGE胶快速制备试剂盒BiosharpPL566B-5
青霉素-链霉素NCM BiotechC125C5
磷酸盐缓冲液（1×)Gibco8120485
预染色彩色蛋白质标准品（10-180 kDa）Cywin创新（北京）生物科技有限公司SW176-02
蛋白上样缓冲液（5x）Boster Biological TechnologyAR1112
PVDF（0.45 μm)Cywin创新（北京）生物科技有限公司SW120-01
快速膜转移溶液Cywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.SW171-02
RIPA 裂解液Boster Biological Technology Co., Ltd.AR0105
红景天苷成都Herbpurify有限公司RFS-H0400191102
TBS 缓冲液NCM Biotech23HA0102
跨膜缓冲液NCM Biotech23CA2000
胰蛋白酶（0.25%, 1×)HyCloneJ210045
Tween 20上海康仕邦科学仪器有限公司PM12012
超声波细胞破碎仪宁波新艺超声波设备有限公司JY92-IIDN
Visionworks成像系统Analytik JenaUVP ChemStudio
涡旋混合器Kylin-BellXW-80A

参考文献

  1. Marutani, E., Ichinose, F. Sulfide catabolism ameliorates hypoxic brain injury. Nat Commun. 12 (1), 3108(2021).
  2. Chen, X., Ma, W., Li, Y. Current situation of Chinese and Western medicine research on hypoxic brain injury at high altitude. Jilin Medical J....

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