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研究文章

红景天苷线粒体保护作用的机制研究 通过 缺氧HT22细胞中的AMPK/Sirt1/HIF-1α通路

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DOI：

10.3791/66923

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2025年4月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Research Service Office, Traditional Chinese Medicine Hospital of Meishan

本文内容

摘要

本研究发现了一种红景天苷通过AMPK/Sirt1/HIF-1α通路在缺氧HT22细胞中发挥线粒体保护作用的独特机制。

摘要

红景天苷（Sal）是红景天（Rhodiola crenulata (Hook. f. et Thoms.) H. Ohba）的一种活性成分，已被发现可通过改善代谢、增强脑细胞在缺氧条件下的能量供应而发挥线粒体保护作用。然而，其作用机制尚未完全阐明。本研究首先采用高效液相色谱法分析Sal对核苷酸（ATP、ADP和AMP）水平的影响；随后选用细胞热转移分析法（CETSA）——一种广泛用于在不同物种的细胞和组织中验证并定量药物靶点结合的分子互作方法，以确认Sal与AMPK/Sirt1/HIF-1α通路相关蛋白的亲和力。结果显示，Sal在缺氧的HT22细胞中可升高ATP和ADP水平，同时降低AMP水平；此外，Sal与AMPKα、p-AMPKα、Sirt1及HIF-1α蛋白均表现出稳定的结合能力。综上所述，Sal可能通过调控AMPK/Sirt1/HIF-1α通路来调节核苷酸含量，从而发挥线粒体保护作用。本研究为细胞样本中核苷酸含量的分析提供了方法学参考，并有助于中药来源化合物作用靶点的识别与发现。

引言

由于大脑具有高代谢需求、有限的糖酵解能力以及对氧化磷酸化的依赖性，因此对氧气极为敏感。因此，暴露于高海拔低氧环境容易导致低压性低氧脑损伤（HHBI）1,2。流行病学研究表明，未经高原习服的个体快速进入高海拔地区后，急性高山病的发病率可高达75%，重症病例的病死率约为1%。此外，若缺乏医疗救治，高原性脑水肿或肺水肿的死亡率可高达40%3,4。

高原性脑损伤（HHBI）的临床表现具有广泛的谱系。轻度至中度病例可能包括头痛、头晕和记忆力减退5，而重度病例则可能导致认知功能障碍、意识改变，甚至危及生命的后果5。在高原地区预防和治疗高原性脑损伤已成为医学研究的重点。预防策略主要包括在高原环境中的适应性训练，如保证充分休息、均衡饮食、合理营养以及适度的体育锻炼6,7。此外，以保护脑细胞和缓解脑缺氧为目标的药物干预措施，仍是当前高原性脑损伤研究的核心内容。

线粒体是细胞内主要的能量生产中心，通过合成三磷酸腺苷（ATP）以满足细胞的能量需求。在缺氧条件下，线粒体的能量生成能力下降，导致ATP水平降低，细胞功能受损8。缺氧损伤还会破坏线粒体对Ca2+和pH稳态的调节，从而触发细胞凋亡和坏死9,10。线粒体功能障碍与缺氧性脑损伤之间存在相互促进的关系。一方面，缺氧引起的线粒体功能障碍进一步降低细胞能量代谢，加剧氧供不足，形成恶性循环；另一方面，线粒体功能障碍导致细胞内Ca2+浓度升高，激活凋亡级联反应，最终导致细胞死亡11。尽管缺氧性脑损伤的机制复杂且尚未完全阐明，但多项研究已明确神经元线粒体能量代谢障碍是其发病过程中的关键因素12,13。因此，进一步探究线粒体功能可能为缺氧性脑损伤的潜在治疗靶点提供重要线索。

红景天苷（Sal）是从高原植物Rhodiola crenulata（Hook. f. et Thoms.）H. Ohba 中提取的一种活性成分，广泛应用于保健食品和药品中14。Sal 的分子式为 C14H20O7，也称为 2-(4-羟基苯基)-乙基 β-D-吡喃葡萄糖苷。它具有多种药理作用，包括抗缺氧、抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤、免疫调节、抗炎以及心脑血管保护作用15,16,17。其中，其抗缺氧作用是研究最为充分的效应之一。近年来的研究 increasingly 强调了 Sal 显著的线粒体保护作用，这可能是其对小鼠高原性脑损伤发挥预防和治疗作用的潜在机制14,18。然而，Sal 影响 ATP、ADP 和 AMP 水平的具体分子机制仍不明确。

AMP激活的蛋白激酶（AMPK）作为一种关键的能量感受器，有助于维持细胞能量稳态。AMPK的激活可刺激去乙酰化酶1（Sirt1），从而提高细胞内NAD+水平19。研究表明，Sirt1能够调节缺氧诱导因子1-α（HIF-1α），以协调细胞对缺氧的反应20。先前的研究表明，Sal可抑制神经元线粒体通透性转换孔的开放，调节HIF-1α介导的线粒体能量过程，减轻神经元凋亡，并维持血脑屏障的完整性，从而保护大鼠免受高原诱导的脑损伤14,21。然而，Sal对ATP及其代谢产物ADP和AMP的影响尚不明确。

为了研究这一点，首先采用高效液相色谱法（HPLC）定量检测这三种核苷酸的水平。此外，还使用了细胞热迁移分析（CETSA），这是一种自2013年引入的广泛使用的生物物理技术，用于在完整细胞中研究配体-蛋白质相互作用22，被用于此研究。该方法常用于在不同物种的细胞和组织中验证并定量药物与靶点的结合情况。具体而言，在将靶细胞裂解液与药物在不同温度下共同孵育一定时间后，与药物结合的蛋白质表现出更高的热稳定性，因而更不易发生变性与沉淀。未结合药物的蛋白质则形成沉淀，随后被去除 通过 离心后，通过蛋白质印迹法分析上清液以鉴定药物-靶标相互作用22为了鉴定Sal的潜在分子靶点，选用CETSA评估其与AMPK/Sirt1/HIF-1α通路相关蛋白的结合亲和力。

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方案

本研究中所用试剂和设备的商业信息详见材料表。

1. 溶液配制

  1. 通过添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素配制完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。
  2. 将3 mg Sal溶解于500 µL磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制20 mM Sal溶液21。
  3. 使用0.45 µm有机膜过滤500 mL色谱纯乙腈（流动相A）。
  4. 向1 L去离子水中加入3.5 mL试剂I，配制1000 mL流动相B。根据核苷酸（ATP、ADP和AMP）含量检测试剂盒的说明书，用试剂II调节pH至6.15（参见材料表）。
    注意：试剂I和试剂II包含在核苷酸（ATP、ADP和AMP）含量检测试剂盒中。
  5. 使用0.22 µm水相膜过滤流动相B。
    注意：流动相B应在配制后立即使用。流动相A和B在使用前应超声30分钟以去除气泡。
  6. 用去离子水稀释1 µM ATP、ADP和AMP标准储备液，得到0.5 µM、0.1 µM、0.05 µM、0.01 µM和0.005 µM的ATP、ADP和AMP系列标准溶液。
  7. 使用0.22 µm针式微孔滤膜过滤系列标准溶液。
    注意：应使用棕色进样瓶储存系列标准溶液。配制好的系列标准溶液应尽快使用。

2. 细胞培养

注意：HT22 细胞培养及 CoCl2 刺激的缺氧模型参照先前报道的方法建立21。

  1. 在培养皿中，将HT22细胞于37 °C、5% CO2条件下培养至80%融合度。用0.25%胰蛋白酶消化1分钟。
  2. 将步骤2.1中的2 × 105个细胞接种至6孔板中，分别加入完全DMEM（无药物处理的对照组）或含药物的完全DMEM（250 µM CoCl2、250 µM CoCl2 + 10 µM Dor、250 µM CoCl2 + 20 µM Sal，以及250 µM CoCl2 + 10 µM Dor + 20 µM Sal）。于37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。
    注意：每组设置三个平行样本。

3. 核苷酸（ATP、ADP 和 AMP）含量测定

  1. 向步骤 2.2 中的 6 孔板各孔加入 1 mL 提取试剂 I。
    注意：提取试剂 I 包含在核苷酸（ATP、ADP 和 AMP）含量检测试剂盒中（见材料表）。
  2. 将细胞置于冰浴中，使用超声波细胞破碎仪进行超声处理以裂解细胞（功率：300 W，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间：3 分钟）。
  3. 将裂解后的细胞在 4 °C 条件下，以 10,304 × g 离心 10 分钟，使用高速冷冻离心机。
  4. 从步骤 3.3 中取 0.75 mL 上清液转移至 2.0 mL 离心管中，加入 0.75 mL 提取试剂 II，使用涡旋混合器振荡混匀，然后在 4 °C 条件下以 10,304 × g 再次离心 10 分钟。
    注意：提取试剂 II 包含在核苷酸（ATP、ADP 和 AMP）含量检测试剂盒中。
  5. 用移液器吸取步骤 3.4 中的上清液，并通过 0.22 µm 针式微孔滤膜过滤至棕色样品瓶中。
    注意：提取样品中的 ATP、ADP 和 AMP 不稳定，所有实验操作应在低温或冰上进行，样品应尽快处理和检测。
  6. 打开色谱软件并设置以下参数：进样体积：10 µL；柱温：27 °C；流速：0.8 mL/min；检测波长：254 nm；检测时间：70 分钟。根据表 1设置梯度洗脱程序。
  7. 点击执行按钮，按照步骤 3.6 中设定的程序自动进样，并检测系列标准溶液（步骤 1.7）和样品溶液（步骤 3.5）中 ATP、ADP 和 AMP 的含量。
    注意：实验结束后，使用 98% 的流动相 B 清洗色谱柱，以防止堵塞。
  8. 使用绘图与统计分析软件绘制 ATP、ADP 和 AMP 的标准曲线，以系列标准品浓度为横坐标（x 轴），峰面积为纵坐标（y 轴）。
  9. 根据步骤 3.8 得到的标准曲线方程，计算样品中 ATP、ADP 和 AMP 的含量。

4. 细胞热迁移分析（CETSA）

  1. 在培养皿中使用含有蛋白酶抑制剂的裂解液（裂解液：蛋白酶抑制剂 = 100:1）反复吹打，冰浴中裂解正常HT22细胞20分钟。
    注意：此步骤需在冰浴中进行，以防止蛋白质降解。
  2. 收集步骤4.1的细胞裂解液，于冰浴中使用超声波细胞破碎仪进行超声处理（功率：300 W，超声3秒，间隔7秒，总时间3分钟）。在4 °C条件下以10,304 × g离心20分钟，收集上清液。
    注意：将上清液分为14份，其中7组用于与Sal共孵育，7组用于与PBS共孵育作为对照。对于Sal处理组，每份样品加入100 µL上清液和0.1 µL的20 µM Sal；对于对照组，每份样品加入100 µL上清液和0.1 µL PBS。
  3. 将各样品在室温下孵育30分钟，然后使用金属加热温控仪分别在37 °C、42 °C、47 °C、52 °C、57 °C、62 °C和67 °C下继续孵育3分钟。
  4. 将步骤4.3的样品在4 °C条件下以10,304 × g离心20分钟，用移液器收集上清液。
  5. 按照制造商说明书（见材料表），使用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定步骤4.4所得上清液的总蛋白浓度。
  6. 按照制造商说明书（见材料表），使用PAGE凝胶快速制备试剂盒配制10%分离胶。
  7. 在分离胶的加样孔中加入3 µL预染蛋白Marker和14 µL样品（每孔最终蛋白量为20 µg）。
  8. 使用电泳缓冲液在80–100 mV电压下电泳1小时，以实现蛋白质分离。
  9. 采用快速转膜液和三明治结构（棉布–滤纸–PVDF膜–蛋白胶–滤纸–棉布），在400 mA电流下电转30分钟，将步骤4.8中的蛋白质转移至PVDF膜上。
  10. 用5%牛血清白蛋白（BSA）溶液在室温下封闭步骤4.9所得PVDF膜1–2小时。
    注意：将5 mg BSA粉末溶解于含100 mL TBS缓冲液和0.05% Tween 20的100 mL TBST溶液中，配制5% BSA溶液。
  11. 将步骤4.10的PVDF膜与5 mL稀释后的一抗在4 °C孵育过夜。
    注意：用BSA溶液按1:1000比例稀释一抗。
  12. 用TBST洗涤PVDF膜三次，每次5分钟，以去除未结合的一抗。
  13. 将步骤4.12的膜在脱色摇床上，室温下与稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育2小时。
    注意：用BSA溶液按1:10,000比例稀释HRP标记的二抗。
  14. 用TBST洗涤膜三次，每次5分钟，以去除残留的二抗。
  15. 将步骤4.14的膜用ECL化学发光显影液覆盖，然后使用成像系统检测目标蛋白信号。
    注意：此步骤需在避光条件下进行，以防止荧光淬灭。
  16. 使用ImageJ软件分析并定量目标蛋白的灰度值（见材料表）。

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结果

通过高效液相色谱法（HPLC）检测得到的 ATP、ADP 和 AMP 的标准曲线分别为 Y = 7006.5X - 222.99、Y = 5217.3X - 17.796 和 Y = 9280.1X + 22.749（图 1A–C）。各组中核苷酸含量通过 HPLC 测定，并利用上述标准曲线进行计算（图 1D–I）。结果显示，与对照组相比，CoCl2 显著降低了 HT22 细胞中的 ATP 和 ADP 水平（P < 0.01，图 1J、K）。此外，与 CoCl2 处理组相比，给予 AMPK 抑制剂 dorsomorphin（Dor）后，ATP 和 ADP 水平进一步显著降低（P < 0.01，

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讨论

线粒体是参与HHBI治疗预防的关键细胞器23,24,25。该研究团队先前的研究已证实，Sal可调节AMPK、Sirt1和HIF-1α蛋白的表达，增强神经元线粒体功能，从而对HHBI起到保护作用21,24。然而，Sal在缺氧细胞中对核苷酸的直接作用仍需进一步研究。此外，在不同温度条件下评估化合物与蛋白质之间的结合潜力，对于理解其相互作用至关重要。

为探讨这些方面，本研究采用高效液相色谱法（HPLC）检测了Sal对HT22细胞线粒体中ATP、ADP和AMP水平的影响，从而直接揭示其在线粒体能量代谢中的作用。根据既往研究18，选用250 µM的CoCl2诱导HT22细胞产生缺氧状态。结果显示，在缺氧的HT22细胞中，S...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作受到国家自然科学基金（82274207 和 82474185）以及科学技术 &四川省科技厅（2024NSFSC1845）、青年科学基金 &四川省科技厅（2023NSFSC1776）、宁夏重点研发计划（2023BEG02012）、中华中医药学会2024—2026年度青年人才支持项目（2024-QNRC2-B07）以及成都中医药大学杏林学者科研提升项目（XKTD2022013 和 QJJJ2024027）。

作者贡献：
Xiaobo Wang、Yating Zhang、Ya Hou、Rui Li 和 Xianli Meng 构思了本项目。Yating Zhang、Ya Hou 和 Tingting Kuang 进行了实验并分析了数据。Yating Zhang 和 Hong Jiang 撰写了稿件。Xiaobo Wang 和 Xianli Meng 对稿件进行了修改。所有作者均已阅读并批准了最终稿件。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙腈AladdinA104440
0.22 µm 水性膜JintengJTMF0445
0.22 µm针型微孔滤膜JintengJTSFM013001
0.45 µ有机膜JintengJTMF0448
安捷伦 OpenLab 软件  安捷伦版本 2.X
抗体-AMPKα细胞信号技术公司#2532
抗体-HIF-1αCell Signaling Technology#41560
抗体-p-AMPKα细胞信号技术公司#50081
抗体-Sirt1Cell Signaling Technology#2028
抗体-β-肌动蛋白细胞信号技术公司#4970
BCA 蛋白浓度测定试剂盒Boster Biological Technology17E17B46
牛血清白蛋白Cywin创新（北京）生物科技有限公司SW127-02
广谱磷酸酶抑制剂（100×)Boster Biological TechnologyAR1183
色谱柱安捷伦SB-C18
CoCl2Sigma15862
脱色摇床Kylin-BellTS-2
DorsomorphinMedChemExpress (MCE)HY-13418A
杜尔贝科改良伊格尔培养基Gibco8121587
电泳缓冲液NCM Biotech20230801
胎牛血清Gibco2166090RP
山羊抗兔IgG H&L（TRITC）ZenBioScience有限公司511202
GraphPad Prism 软件GraphPad 软件有限责任公司版本 9.0.0
高效液相色谱安捷伦1260 Infinity II Prime 
高速冷冻离心机赛默飞世尔科技Legend Micro 17R
HRP标记的Affinipure山羊抗兔IgG(H+L)Boster 生物技术有限公司BA1054
HT22细胞广州杰诺生物技术有限公司JNO-02001
高敏ECL化学发光试剂盒NCM BiotechP10300
Image J 软件美国国立卫生研究院v1.8.0
金属加热温度控制仪Baiwan Electronic Technology Co., Ltd.HG221-X3
甲醇AladdinM116118
核苷酸（ATP、ADP 和 AMP）含量检测试剂盒北京索莱宝科学技术 &科技有限公司BC5114
PAGE胶快速制备试剂盒BiosharpPL566B-5
青霉素-链霉素NCM BiotechC125C5
磷酸盐缓冲液（1×)Gibco8120485
预染色彩色蛋白质标准品（10-180 kDa）Cywin创新（北京）生物科技有限公司SW176-02
蛋白上样缓冲液（5x）Boster Biological TechnologyAR1112
PVDF（0.45 μm)Cywin创新（北京）生物科技有限公司SW120-01
快速膜转移溶液Cywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.SW171-02
RIPA 裂解液Boster Biological Technology Co., Ltd.AR0105
红景天苷成都Herbpurify有限公司RFS-H0400191102
TBS 缓冲液NCM Biotech23HA0102
跨膜缓冲液NCM Biotech23CA2000
胰蛋白酶（0.25%, 1×)HyCloneJ210045
Tween 20上海康仕邦科学仪器有限公司PM12012
超声波细胞破碎仪宁波新艺超声波设备有限公司JY92-IIDN
Visionworks成像系统Analytik JenaUVP ChemStudio
涡旋混合器Kylin-BellXW-80A

参考文献

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红景天苷 线粒体保护AMPK 通路Sirt1 通路HIF-1α核苷酸含量ATP 水平细胞热转移高效液相色谱中药

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