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DNA条形码技术在药用植物鉴定中的应用

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DOI：

10.3791/66925

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2024年11月1日

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Institute of Herbgenomics, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

本文内容

摘要

本实验方案介绍了利用DNA条形码技术对植物源性药材进行真伪鉴别的方法，并以药用植物当归（Angelica sinensis (Oliv.) Diels）为例进行了鉴定。

摘要

药用植物是全球宝贵的资源，被广泛用于维护健康和治疗疾病；然而，掺假现象的存在阻碍了其发展。DNA条形码技术通过标准DNA区域进行物种鉴定，可实现对传统药用植物的快速、准确识别。DNA条形码的流程包括六个基本步骤：1）药用植物样品处理，2）采用离心柱法从药用植物中提取高质量的总DNA，3）使用植物通用引物扩增目标DNA区域——内转录间隔区2（ITS2），并进行Sanger测序，4）拼接和比对序列以获得目标序列，5）将条形码序列与条形码数据库比对以完成物种鉴定，6）序列比对、比较种内与种间变异，并构建邻接法系统发育树。结果表明，通用引物能够成功扩增目标区域。基本局部比对搜索工具（BLAST）分析显示鉴定率为100%，邻接树显示拼接序列与A. sinensis OR879715.1分支聚类，该分支支持值为100。本实验方案为应用DNA条形码技术作为鉴定药用植物及其掺伪品的有效方法提供了参考依据。

引言

药用植物具有广泛的药理作用，是疾病治疗和预防的重要物质。在草药和药品中，药用植物的市场需求巨大且仍在持续增长。随着药用植物市场的扩大，掺假问题已成为制约其发展的障碍。目前，药用植物掺假主要源于以下原因：1）药用植物形态相似，难以准确鉴别和正确使用1,2,3,4,5；2）药用植物需求不断上升，导致市场供应不足6,7；3）药用植物价格昂贵且波动较大，使用廉价药材冒充经济价值高的材料，导致掺假和市场牟利行为频发8,9。为解决药用植物正确鉴别与使用的问题，亟需一种能使非专业人员也能准确识别其来源的技术10。

仅通过外观和气味来准确识别和使用药用植物存在局限性11。为了实现更精确的鉴定和质量控制，需采用理化方法12。例如，薄层色谱法（TLC）是一种快速鉴定药用植物的方法，已被收录于《中国药典》中。然而，该方法需要参照标准品才能完成植物鉴定13。高效液相色谱法（HPLC）可同时进行定性和定量检测，适用于药品质量检验。但该仪器价格昂贵，且操作需要专业知识14,15。DNA条形码技术是一种快速、准确的物种鉴定技术，通过稳定的DNA序列来区分形态相似的植物。Hebert 等人提出了利用基因组中一段公认且相对较短的DNA序列进行物种鉴定的DNA条形码技术16；Chen 等人则提出将ITS2作为药用植物分子鉴定的通用序列，已成功鉴定超过6600种植物，并表现出较高的鉴定能力17。基于ITS2和叶绿体基因片段对药用植物的研究表明，该技术能够在物种水平上有效区分不同物种，在资源保护、市场监管和国际贸易等领域具有广泛应用17,18,19。DNA条形码技术的应用可克服传统鉴定方法的局限性，有助于保障药用植物的质量与安全，防止资源滥用和混淆20。该技术已被证实对药用植物研究具有重要意义，可支持草药产业的可持续发展，并确保消费者使用正确的药物21,22,23,24。

本文概述了以A. sinensis为例，应用DNA条形码技术鉴定药用植物的实验方案。DNA条形码技术利用生物体DNA中一个或多个标准化的短遗传标记，以确定其所属物种。目前药用植物的鉴定方法存在一定局限性：传统的形态学鉴定高度依赖专家的丰富经验，易受人为因素影响；而化学鉴定则容易受到关键化合物掺假等问题的干扰。相比之下，DNA条形码技术提供了更为准确的物种鉴定手段，具有快速、高重复性和稳定性等优势。此外，该技术可通过互联网和信息平台实现物种序列数据的集中管理和共享，显著提高物种鉴定的效率与可靠性11,12。由于形态特征和药用部位相似，A. sinensis常与其他物种混淆，在市场上频繁被误用或故意替代25。Yang等利用DNA条形码技术鉴定A. anomala，以区分其与伪品药材26。Yuan等收集了23种Angelica属植物，并采用DNA条形码技术对不同物种进行区分27。通过遵循本方案所述操作流程，使用者可完成从样本前处理到将条形码序列与条形码数据库比对的全过程，实现对植物类药材的真伪鉴定（图1）。

方案

1. 样品制备

  1. 本研究采用采自甘肃省岷县海拔2800米地区、经历低温和长日照条件的两年生A. sinensis作为实验材料。从中选取三株植株，每株取三根以上的根进行实验。首先用灭菌水冲洗根部，然后使用酒精喷雾器或酒精棉片进行表面清洁，以防止污染影响实验结果的准确性。用灭菌解剖刀将根切成小于5 mm的小段，混匀后用于后续分析。（图2）。
    注意：也可将根置于液氮中使其变脆，以便更容易破碎。根据药用植物的形状、硬度及其他特性，选择合适的工具进行处理。
  2. 为平行实验准备三管实验样品。将各样品分别标记为AS-1、AS-2和AS-3。取约100 mg新鲜组织或20 mg干重组织（风干），放入2 mL离心管中。
  3. 在每个2 mL离心管中放入两颗5 mm的不锈钢研磨珠。将离心管置于高通量组织研磨仪中，在60 Hz条件下研磨60秒。

2 从样本中提取 DNA

注意：本研究使用基于CTAB法的植物基因组DNA提取试剂盒。DNA提取步骤参照说明书进行，但有一些修改，包括添加独特的细胞核分离缓冲液（NIB）。该方案通过首先将污染物与组织分离，并增加初始的细胞核分离步骤，从而提高了DNA的纯度28,29,30。

  1. 加入 800 µL 预冷的 NIB，将样品置于涡旋振荡器上，振荡 5 分钟。
  2. 放入离心机中，在 13,780 x g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。
  3. 重复步骤 2.1–2.2，额外进行 3 轮。
    注意：NIB 可提取质量更高的 DNA，其配制过程包含一些必须在通风橱中操作的危险化学品，因此初学者操作较为困难。然而，此步骤并非强制性。用户可选择遵循本建议或跳过这些步骤。其详细配方见表 1。
  4. 加入 600 µL Buffer P1 和 5 µL RNase A（10 mg/mL）。将样品置于涡旋振荡器上充分混匀。将样品在 65 °C 水浴中孵育 1.5 小时，孵育期间翻转离心管 2–3 次。
  5. 加入 200 µL Buffer P2，充分混匀，冰上放置 15 分钟，然后在 13,780 x g 条件下离心 10 分钟。
  6. 小心将上清液转移至滤柱 AF，以 13,780 x g 离心 2 分钟，将收集管中获得的下层滤液转移至新的 1.5 mL 离心管中。
  7. 计算滤液体积，加入 1.5 倍体积的 P3，立即振荡以获得混合溶液。
  8. 取 650 µL 已配制的混合液加入吸附柱（AC），孵育 5 分钟，然后在 13,780 x g 条件下离心 30–60 秒。
  9. 将步骤 2.8 中获得的滤液再次加入 AC 中，离心后弃去废液。对步骤 2.7 中剩余的混合溶液重复该操作。
  10. 加入 600 µL 洗涤液 WB，在 13,780 x g 条件下离心 30 秒，弃去废液，重复该步骤一次。
  11. 将吸附柱 AC 放回空的收集管中，在 13,780 x g 条件下离心 2 分钟，室温放置以去除残留乙醇。
  12. 取吸附柱 AC 置于洁净的 1.5 mL 离心管中。向已加热至 65 °C 的吸附膜中央加入 45 µL 灭菌去离子水（ddH2O），室温静置 5 分钟，然后在 13,780 x g 条件下离心 2 分钟。
  13. 将所得溶液重新加入柱中，在室温下以 13,780 x g 离心 2 分钟。
  14. 收集滤过溶液。使用分光光度计测定 DNA 浓度；OD260 代表核酸的吸光度。采用以下标准判断 DNA 质量：OD260/OD280 = 1.80–2.00，为正常范围；OD260/OD280>2.00，表明存在大量 RNA 污染；OD260/OD280<1.80，表明存在蛋白质、酚类或其他污染物。

3 个靶标片段的扩增与检测

注意：根据植物的拟选DNA条形码区域选择合适的扩增引物；反应条件见表2。

  1. 设置与引物扩增相对应的反应条件。使用0.2 mL离心管，加入9.5 µL ddH2O、12.5 µL 2x PCR预混液，以及各1 µL的正向引物、反向引物和模板DNA，总体积为25 µL。同时制备阴性对照，以水替代模板DNA。
  2. 将20 mL 1x Tris乙酸-EDTA（TEA）缓冲液与0.2 g琼脂糖加热，制备1%琼脂糖凝胶，然后加入2 µL核酸凝胶染料（10,000x），充分混匀。将混合液倒入凝胶模具中，待其凝固后得到琼脂糖凝胶。向凝胶中加入3 µL PCR产物和2 µL 5000 bp DNA Marker。
  3. 设定电压为120 V，电流为400 mA，电泳40分钟。使用多功能凝胶成像分析系统观察凝胶并检查结果。

4. 数据收集与分析

注意：序列组装与分析软件种类繁多；本文以 CodonCode Aligner V11.0.1 和 MEGA11 为例进行说明。

  1. 使用比对软件打开测序文件以观察峰图，并拼接双向测序的峰图文件。
    1. 选择 创建新项目 并点击 好的 前往软件主页。选择 添加样品 在“文件”菜单下，选择 文件 以序列迹线格式进行处理，并将其直接作为未组装样本中的导入文件导入软件。
    2. 选择 重叠群，然后在该部分中选择 高级组装，然后选择 分组集合首次使用用户在选择“分组组装”后，将看到此对话框：选择“定义名称”，根据文件名修改“定义样本名称部分”，然后单击 组装比对后的序列将被显示。
    3. 根据基于隐马尔可夫模型（HMM）的模型分析，获取完整的ITS2序列。使用5.8s（CGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCA）和28s（CGACCCCAGGTCAGGCGGGGCCACC）序列31 从头开始搜索比对序列，以去除5.8S和28S区域。
    4. 选择 开始，然后在该部分中选择 搜索序列 并点击 好的 以获得匹配序列。选择 重叠群，选择 删除 在去除5.8s和28s区域及低质量序列的步骤中，软件将输出用于比对的拼接序列。
  2. 使用从三个平行实验步骤中获得的剪接序列进行鉴定，选择 BLAST 搜索 使用美国国家生物技术信息中心（NCBI）的核苷酸数据库，并选择 物种鉴定工具 以及 特异性引物 ITS2 全球药典基因组数据库（GPGD）中相应的
    注意：NCBI32 和 GPGD33 包括药用植物和动物的核苷酸序列，被公认为权威数据库。其主要鉴定方法是基于序列比对的方法。34 （BLAST）。根据同源性比对结果中的序列一致性百分比，判断相似度最高的物种是否属于目标属。
  3. 使用 MEGA11 进行序列比对，分析并比较种内和种间序列变异，构建系统发育邻接树。
    1. 下载三个物种的序列 当归 一个物种 Peucedanum praeruptorum 从NCBI获取外群序列，将这些序列与获得的结果序列一同进行分析。
    2. 点击 文件，选择 打开文件/会话 导入文件后将弹出一个对话框。请选择 对齐 > DNA 并选择 使用 ClustalW 进行比对 用于序列比对。选择 系统发育分析 在数据中，然后返回主页。点击 构建/检验邻接法进化树 在系统发育分析中，该软件可生成系统发育树。

结果

样品DNA质量

各样品的OD260/OD280吸光度比值范围为1.80–1.84。分光光度计测得的每个样品DNA浓度均高于100 ng/µL（表3），表明样品DNA提取质量良好。这说明样品在提取过程中未受到蛋白质、RNA或试剂的污染，且质量合格，适用于后续PCR扩增。

PCR 分析

对三个平行实验样本的PCR产物进行了凝胶电泳。实验设置如下：Marker、样本1-3（AS-1、AS-2、AS-3）以及阴性对照（0），如图3所示。AS-1、AS-2和AS-3的大小均在500 bp左右，均呈现单一、明亮且清晰的条带，而0号泳道无条带，表明提取的DNA已通过ITS2引物成功扩增至500 bp。

测序结果的数据库比对

测序结果鉴定出 A. sinensis 通过结合NCBI数据库的BLAST鉴定结果，序列相似性为100%，与GPGD数据库的物种鉴定结果一致（表4）。BLAST 结果通过最高百分比一致性得分和最低 e 值确定。当最高最大百分比一致性对应唯一一个物种且得分为 >99%。如果得分 ≤ 99%，应检查测序文件的质量或PCR产物是否受到污染。

基于系统发育树的物种鉴定分析

结果表明，在构建的NJ系统发育树中，所有四个物种分别聚集成独立的分支，其中作为外群的P. praeruptorum与Angelica分支分离。拼接序列与A. sinensis OR879715.1分支聚类，分支支持值（自展支持率）为100；另外两个物种A. dahurica和A. cartilaginomarginata各自聚集成独立分支，从而证明该拼接序列为A. sinensis（图4）。

figure-results-1
图1：药用植物物种鉴定流程图。（A）处理植物样本、提取DNA并进行药用植物测序，（B）利用数据库比对物种序列，以及（C）构建系统发育树以进行分类学验证，确认物种间的系统发育关系。请点击此处查看该图的放大版本。

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图 2：药用植物 DNA 提取流程图。（A）从药用植物中提取 DNA 共包括 6 个步骤。（B）PCR 仪扩增及 PCR 循环过程。（C）电泳。（D）Sanger 测序及测序色谱图。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-3
图3：当归（Angelica sinensis (Oliv.) Diels）的凝胶电泳图谱。以DL5000 DNA Marker作为分子量标记，AS-1、AS-2和AS-3作为样品，0作为空白对照组进行凝胶电泳分析。结果显示，AS-1、AS-2和AS-3样品在500 bp处均出现条带，而对照组无条带。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-4
图 4：基于13条序列构建的邻接法系统发育树。 从NCBI数据库下载了来自四种植物物种的共10条序列，并对剪接序列进行比较，以分析和比较种内及种间序列变异，并构建邻接法系统发育树。 请点击此处查看该图的放大版本。

材料/设备名称剂量
Polyvinyl pyrrolidone10 g
Tris-HCl1 M  50 mL
乙二胺四乙酸0.5 M 20 mL
NaCl20.45 g
β-mercaptoethanol10 mL
灭菌去离子水500 mL

表1：细胞核分离缓冲液配方试剂。

条形码引物引物序列 (5'-3')PCR 扩增测序
ITS2R:3RGACGCTTCTCCAGACTACAAT94°C5分钟
94°C30秒40个循环
56°C30秒
F:2FATGCGATACTTGGTGTGAAT72°C45秒
72°C10分钟

表2：DNA条形码引物及PCR反应条件。

样品DNA 提取量 (ng/µL)OD260/OD280
AS-11241.84
AS-21841.81
AS-31641.82

表3：Angelica sinensis（Oliv.）Diels 提取DNA的质量。

样本比对序列长度 (bp)剪接序列长度 (bp)GC (%)NCBI：BLAST 比对率 (%)GPGD：物种鉴定率 (%)
AS-1500bp229bp55.50%100%100%
AS-2504bp229bp55.50%100%100%
AS-3499bp229bp55.50%100%100%

表4：测序结果的数据库比对。

讨论

分子鉴定技术相较于传统鉴定方法更易于学习和掌握。该技术克服了传统中药材鉴定的局限性，不受植物生长阶段的影响，且无需依赖主观判断或专业知识的积累。35. 其他物种被混淆为 A. sinensis 由于其形态和药用部位相似，但通过DNA条形码技术的应用，它 可以被明确鉴定36.

本方案中的关键步骤涉及若干重要考虑因素。首先，在处理药材和提取DNA时，必须避免污染，以防止外源DNA或杂质影响实验结果。对样品进行适当清洗，可去除外部污染物，而充分研磨则通过增加试剂作用的表面积，提高DNA提取效率。此外，使用适量的样品至关重要，以确保与试剂充分混匀，从而更有效地裂解细胞并释放DNA。最后，必须严格控制水浴时间，因为过度加热可能导致DNA降解，影响所提取DNA的质量。综上所述，这些步骤共同保障了高质量DNA的成功提取，为后续分析奠定基础。

药用植物含有影响DNA提取和扩增的多糖和多酚。使用细胞核分离缓冲液可降低这些物质的干扰作用，并实现细胞核裂解，从而更有效地提取高纯度基因组DNA28,29,30。目前主要有三种DNA提取方法：离心柱法、CTAB法和SDS法。然而，本研究选择离心柱法进行实验，因其具有稳定性好、操作简便、效率高以及能够提取高浓度DNA的优点37，且加热洗脱缓冲液有助于获得质量更优的DNA。本研究选用ITS2特异性引物17,38，较之其他引物，短片段ITS2序列作为分类学标记具有较高的种间变异性和更广泛的鉴定范围，是一种高效的分类序列标签39。扩增失败的可能原因是部分样本中DNA发生降解；另一个可能是所用的ITS2通用引物对不适用于某些物种，可尝试更换另一组通用引物40。BLAST结果依据最高序列一致性百分比和最低e值确定。当最高最大序列一致性对应唯一一个物种且得分>99%时，认为物种鉴定成功40,41；若得分≤99%，应检查测序文件质量或PCR产物是否受到污染。

总之，DNA条形码技术应在传统草药质量控制及国际草药贸易中发挥关键作用。本文介绍了植物DNA提取的一些方法，并详细阐述了利用DNA条形码技术鉴定药用植物的操作流程，强调了实验过程中需注意的关键环节。因此，本文为草药基础鉴定提供了参考，有助于更多人快速掌握该技术。然而，在某些特殊情况下，单一位点条形码的鉴定效率可能不足，这依赖于参考数据库的完善程度。构建物种覆盖度高的参考数据库，将是实现DNA条形码物种鉴定的重要一步42；许多研究人员已提出，多位点条形码技术可提高鉴定效率43,44。此外，随着分子技术的发展，Zheng等人将DNA条形码技术与等温DNA扩增技术及RPA-LFD检测相结合，实现了对有毒植物的快速鉴定45，并已开发出一些现成的试剂盒46。DNA条形码数据库正不断优化，在推动中药材鉴定方法的普及化、标准化和国际化方面发挥着重要作用。

披露

作者声明，本研究在不存在任何可能被视作潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。

致谢

本工作由成都中医药大学人才科研启动基金资助项目（030040015）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CTAB 快速植物基因组 DNA 提取试剂盒上海惠凌生物科技有限公司NG411M适用于从多种植物的不同组织中快速提取高质量基因组DNA
DL5000 DNA Marker南京诺唯赞生物科技股份有限公司MD102-02即用型产品，电泳时直接取适量本品上样。
电泳北京六一生物科技有限公司DYY-6C采用触摸屏设计，可同时显示设定电压和设定电流，并联输出
乙二胺四乙酸北京拜尔赛生物科技有限公司E70015-100G细胞核分离缓冲液配方试剂
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