DNA条形码技术在药用植物鉴定中的应用

摘要

本实验方案介绍了利用DNA条形码技术对植物源性药材进行真伪鉴别的方法，并以药用植物当归（Angelica sinensis (Oliv.) Diels）为例进行了鉴定。

摘要

药用植物是全球宝贵的资源，被广泛用于维护健康和治疗疾病；然而，掺假现象的存在阻碍了其发展。DNA条形码技术通过标准DNA区域进行物种鉴定，可实现对传统药用植物的快速、准确识别。DNA条形码的流程包括六个基本步骤：1）药用植物样品处理，2）采用离心柱法从药用植物中提取高质量的总DNA，3）使用植物通用引物扩增目标DNA区域——内转录间隔区2（ITS2），并进行Sanger测序，4）拼接和比对序列以获得目标序列，5）将条形码序列与条形码数据库比对以完成物种鉴定，6）序列比对、比较种内与种间变异，并构建邻接法系统发育树。结果表明，通用引物能够成功扩增目标区域。基本局部比对搜索工具（BLAST）分析显示鉴定率为100%，邻接树显示拼接序列与A. sinensis OR879715.1分支聚类，该分支支持值为100。本实验方案为应用DNA条形码技术作为鉴定药用植物及其掺伪品的有效方法提供了参考依据。

引言

药用植物具有广泛的药理作用，是疾病治疗和预防的重要物质。在草药和药品中，药用植物的市场需求巨大且仍在持续增长。随着药用植物市场的扩大，掺假问题已成为制约其发展的障碍。目前，药用植物掺假主要源于以下原因：1）药用植物形态相似，难以准确鉴别和正确使用^1,2,3,4,5；2）药用植物需求不断上升，导致市场供应不足^6,7；3）药用植物价格昂贵且波动较大，使用廉价药材冒充经济价值高的材料，导致掺假和市场牟利行为频发^8,9。为解决药用植物正确鉴别与使用的问题，亟需一种能使非专业人员也能准确识别其来源的技术¹⁰。

仅通过外观和气味来准确识别和使用药用植物存在局限性¹¹。为了实现更精确的鉴定和质量控制，需采用理化方法

方案

1. 样品制备

1. 本研究采用采自甘肃省岷县海拔2800米地区、经历低温和长日照条件的两年生A. sinensis作为实验材料。从中选取三株植株，每株取三根以上的根进行实验。首先用灭菌水冲洗根部，然后使用酒精喷雾器或酒精棉片进行表面清洁，以防止污染影响实验结果的准确性。用灭菌解剖刀将根切成小于5 mm的小段，混匀后用于后续分析。（图2）。
   注意：也可将根置于液氮中使其变脆，以便更容易破碎。根据药用植物的形状、硬度及其他特性，选择合适的工具进行处理。
2. 为平行实验准备三管实验样品。将各样品分别标记为AS-1、AS-2和AS-3。取约100 mg新鲜组织或20 mg干重组织（风干），放入2 mL离心管中。
3. 在每个2 mL离心管中放入两颗5 mm的不锈钢研磨珠。将离心管置于高通量组织研磨仪中，在60 Hz条件下研磨60秒。

2 从样本中提取 DNA

注意：本研究使用基于CTAB法的植物基因组DNA提取试剂盒。DNA提取步骤参照说明书进行，但有一些修改，包括添加独特的细胞核分离缓冲液（NIB）。该方案通过首先将污染物与组织分离，并增加初始的细胞核分离步骤，从而提高了DNA的纯度

结果

样本DNA质量

OD260/OD280 吸光度比值范围为 1.80–1.84。分光光度计测得的各样本 DNA 量均大于 100 ng/µL（表 3），表明样本 DNA 提取质量良好。这说明样本在提取过程中未受蛋白质、RNA 或试剂污染，且质量良好，适用于后续 PCR 扩增。

PCR 分析

对三个平行实验样品的PCR产物进行凝胶电泳。实验设置为：Marker、样品1-3（AS-1、AS-2、AS-3）以及阴性对照（0），如图3所示。AS-1、AS-2和AS-3的大小均在500 bp左右，均呈现单一、明亮且清晰的条带，而0号泳道无条带，表明提取的DNA已通过ITS2引物扩增至500 bp。

测序结果的数据库比对

讨论

分子鉴定技术相较于传统鉴定方法更易于学习和掌握。该技术克服了传统中药材鉴定的局限性，不受植物生长阶段的影响，且无需依赖主观判断或专业知识的积累。³⁵. 其他物种被混淆为 A. sinensis 由于其形态和药用部位相似，但通过DNA条形码技术的应用，它 可以被明确鉴定³⁶.

本方案中的关键步骤涉及若干重要考虑因素。首先，在处理药材和提取DNA时，必须避免污染，以防止外源DNA或杂质影响实验结果。对样品进行适当清洗，可去除外部污染物，而充分研磨则通过增加试剂作用的表面积，提高DNA提取效率。此外，使用适量的样品至关重要，以确保与试剂充分混匀，从而更有效地裂解细胞并释放DNA。最后，必须严格控制水浴时间，因为过度加热可能导致DNA降解，影响所提取DNA的质量。综上所述，这些步骤共同保障了高质量DNA的成功提取，为后续分析奠定基础。

药用植物含有影响DNA提取和扩增的多糖和多酚。使用细胞核分离缓冲液可降低这些物.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CTAB 快速植物基因组 DNA 提取试剂盒	上海惠凌生物科技有限公司	NG411M	适用于从多种植物的不同组织中快速提取高质量基因组DNA
DL5000 DNA Marker	南京诺唯赞生物科技股份有限公司	MD102-02	即用型产品，电泳时直接取适量本品上样。
电泳	北京六一生物科技有限公司	DYY-6C	采用触摸屏设计，可同时显示设定电压和设定电流，并联输出
乙二胺四乙酸	北京拜尔赛生物科技有限公司	E70015-100G	细胞核分离缓冲液配方试剂
Goldview 核酸凝胶染料（10,000×)	上海益生生物技术有限公司	10201ES03	在使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA时，它会与DNA结合并产生强烈的荧光信号。
高速台式离心机	长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司	H1650	为实现样品的快速高效分离，这款小巧轻便的离心机提供了可靠的安全保障
高通量组织研磨仪	上海精兴工业发展有限公司	Tiss-48	用于研磨样品的高频振动仪器
http://www.gpgenome.com/	中国中医科学院中药研究所，中国中医科学院	-	HerbGenomics 数据库包含基因组序列、基因集、细胞器基因组、低覆盖度基因组数据以及DNA条形码序列。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/	美国国家医学图书馆	-	美国国家生物技术信息中心通过提供生物医学和基因组信息，推动科学与健康事业的发展。
Kylin-Bell	海门麒麟贝尔仪器制造有限公司	VORTEX-5	高速涡旋形式的快速混匀，混匀速度、均匀性、彻底性
LifeTouch	杭州博日科技股份有限公司	TC-96/G/H(b)B	采用先进的热电制冷技术和新开发的TAS技术以提升其整体性能
多功能凝胶图像分析系统	上海天能生命科学有限公司西南运营中心	Tanon-Mini Space 2000	可进行快速基因扩增实验，具备梯度功能以优化扩增条件，梯度温度范围最高可达30°C
NaCl	北京索莱宝科技有限公司&Technology Co., Ltd.	S8210-100	细胞核分离缓冲液配方试剂
Nanodrop One	Genes Ltd.	ND ONE	用仅需1-2微升样品，数秒内即可定量DNA、RNA和蛋白质样本 µ样品体积（L）
聚乙烯吡咯烷酮	上海源叶生物科技有限公司	S30268-500g	细胞核分离缓冲液配方试剂
雪花制冰机	上海智信实验仪器技术有限公司	ZX-60X	采用旋转挤压制冰法，制冰速度快，产冰效率高
用于组织匀浆仪的不锈钢珠	碧云天生物技术	F6623	用于通过振动研磨和混合组织及其他样品的设备
Tris乙酸盐-EDTA缓冲液	碧云天生物技术股份有限公司	ST716	TAE 是一种常用于 DNA 电泳的缓冲液，常在琼脂糖凝胶电泳中使用。
Tris-HCl	北京索莱宝科技有限公司&Technology Co., Ltd.	T8230	细胞核分离缓冲液配方试剂
水浴锅 电热水壶	上海森信实验仪器有限公司	DK-8D	精确的恒温器与温度调节，准确可靠的温度控制
β-巯基乙醇	上海易昂化工科技有限公司	R054186-100ml	细胞核分离缓冲液配方试剂