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方法文章

由大鼠子宫内膜上皮干细胞生成并表征大鼠子宫类器官

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DOI：

10.3791/66928

⸱

2024年8月2日

 ,  ,  ,  , 
1Meizhou Clinical Institute of Shantou University Medical College, 2Department of Pathology, Meizhou People's Hospital, 3Guangdong Engineering Technological Research Center of Clinical Molecular Diagnosis and Antibody Drugs, Meizhou Academy of Medical Sciences, Meizhou People's Hospital

本文内容

摘要

本文介绍一种分离和培养大鼠子宫内膜上皮干细胞（reESCs）并建立大鼠子宫内膜类器官的实验方案。该方法有助于 体外 子宫内膜疾病研究，实现基因编辑及其他细胞操作。

摘要

子宫内膜类器官为研究子宫内膜疾病的发育机制和病理生理过程提供了重要见解，并可作为药物筛选的平台。尽管已建立了人和小鼠的子宫内膜类器官模型，但关于大鼠子宫内膜类器官的研究仍较为有限。由于大鼠能够更好地模拟某些子宫内膜病理状态（如宫腔粘连），本研究旨在建立大鼠子宫内膜类器官模型。本文提供了一种详细的实验方案，用于大鼠子宫内膜上皮干细胞（reESCs）的分离与培养，以及大鼠子宫内膜类器官的构建。通过优化的reESCs扩增培养基，我们成功分离并稳定扩增了reESCs，证实其具有长期培养的潜力。由reESCs生成的类器官表现出子宫内膜典型的结构和功能特征，包括对激素的响应性。实验结果表明，大鼠子宫内膜类器官可实现长期稳定培养，持续增殖的同时维持腺体结构、细胞极性以及子宫内膜上皮的功能特性。这一新型的大鼠来源子宫内膜类器官模型为研究子宫内膜疾病及评估治疗干预手段提供了有价值的平台，并具有在多种哺乳动物中广泛应用的潜力。

引言

子宫内膜是人体内一种多功能且具有再生能力的组织，在卵巢激素的作用下经历周期性的脱落、再生和分化1。子宫内膜的异常与多种女性生殖系统疾病相关，例如子宫内膜异位症、子宫内膜癌以及不孕症2。目前缺乏可靠的子宫内膜研究模型，这阻碍了对这些疾病发病机制、临床诊断和治疗的深入研究。尽管细胞系和动物模型常被用于子宫内膜研究，但由于细胞系存在表型不稳定、动物模型存在种间差异以及其他局限性，难以真实模拟人类子宫内膜复杂的生理结构和动态功能变化3。

类器官是由干细胞在细胞外环境中培养形成的三维结构，具有自我更新和自我组织能力。它们能够模拟生理和病理组织的结构与功能，被公认为人类疾病的临床前模型42017年，通过将经酶消化获得的游离子宫内膜组织碎片嵌入细胞外基质支架中，并添加特定生长因子和信号因子混合物进行培养，成功构建了小鼠和人类子宫内膜类器官。5结果表明 离体 子宫内膜类器官表现出长期且稳定的增殖能力，能够维持子宫内膜上皮的腺体结构、细胞极性及功能特性，包括黏液分泌和激素反应6。然而， 离体 成年干细胞培养形成子宫内膜类器官需要类似腺体的结构支撑，这导致了干细胞干性丧失以及传代困难等挑战7.

目前，子宫内膜类器官的培养主要依赖于组织块消化培养法。在之前的一项研究中，我们的研究团队对人子宫内膜上皮干细胞进行了长期培养 体外 使用主要含有Y27632的初级培养基，我们利用该培养基构建了子宫内膜类器官8在这一成功的基础上，我们采用小分子化合物培养基从大鼠子宫内膜组织中分离并培养了子宫内膜上皮干细胞，建立了长期培养体系 体外 培养系统。此外，我们利用大鼠子宫内膜上皮干细胞（reESCs）构建了大鼠子宫内膜类器官。该模型的建立将促进未来 体外 和 体内 结合大鼠模型对子宫内膜相关疾病的研究。

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方案

六只7至8周龄、体重200–250 g的雌性Sprague-Dawley大鼠用于本研究。大鼠饲养于环境可控的动物实验设施中， 随意摄取 可自由获取食物和水。所有涉及动物的实验程序均遵循实验室动物护理与使用机构指南，并经梅州市人民医院研究伦理委员会动物实验审查委员会批准。

以下部分概述了使用主要含有 Y27632、A8301 和 CHIR990217 的优化大鼠子宫内膜上皮干细胞扩增培养基（REEM），对大鼠子宫内膜上皮干细胞进行分离、传代、冻存和复苏的过程。8,9REEM 培养基配方基于无血清的 DMEM/F12，添加特定浓度的关键成分：10 µM Y27632、3 µM CHIR99021 和 0.5 µM A8301。有关各成分的详细信息见于 材料表使用异氟烷吸入法麻醉大鼠后，随后进行图中所示的操作步骤。 图1 应予以实施。

1. 手术操作

  1. 通过吸入异氟烷对大鼠进行麻醉。
    1. 将大鼠置于充满3-5%异氟烷与氧气混合气体的诱导室中。通过夹捏脚趾无反应以及翻正反射消失来确认麻醉效果。
    2. 麻醉成功后，在手术过程中通过鼻罩维持1-3%异氟烷吸入。在大鼠麻醉期间，涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。
      注意：大鼠在麻醉状态下应置于温度可控的加热垫上进行手术，以维持体温，防止术中低体温。
  2. 在腹部下段做正中切口，暴露子宫角。
    注意：大鼠手术区域应剃毛，并使用含碘或氯己定的消毒液以环形方式多次擦拭消毒，随后用酒精冲洗或擦拭，以确保无菌操作。手术过程中使用无菌铺巾覆盖动物体表及下方区域，并配合无菌4×4纱布垫，有效隔离并维持切口周围的无菌环境。
  3. 在子宫两侧做纵向切口，暴露内层子宫内膜。使用T10刀片刮擦子宫内膜，直至表面变得粗糙。操作完成后，分别使用可吸收单丝缝线缝合子宫和腹肌层，以确保解剖结构的正确重建。皮肤切口则使用不可吸收单丝缝线或无菌伤口夹闭合，以固定外部组织层。
  4. 手术后，将大鼠转移至温湿度受控的无菌温暖恢复区，密切监测直至其完全清醒并能自主维持胸卧位。术后大鼠每三只为一组，分笼饲养。为缓解术后疼痛，给予阿片类镇痛药48-72小时。
    注意：可每8小时皮下注射一次布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg），以维持有效镇痛；或者单次皮下注射缓释型布托啡诺（0.5–1.2 mg/kg），可提供持续48–72小时的镇痛效果。

2. 组织处理

  1. 将所有子宫内膜组织碎片置于3.5 cm培养皿中，用PBS洗涤3次。
  2. 将子宫内膜组织碎片与3 mL 1% I型胶原酶（溶于0.25%胰蛋白酶/1 mM EDTA中）在37 °C下混合消化60分钟。使用100 µm细胞筛过滤未消化的组织，收集滤液用于后续培养。
  3. 将收集的细胞接种至12孔板中，使用REEM培养基进行进一步培养。根据所需细胞密度（通常每孔1.5 mL REEM中接种约1–2 × 105个细胞），计算每孔所需的细胞悬液体积。
  4. 用PBS洗涤步骤2.2中收集的细胞3次。首次洗涤后，在300 × g下离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于含1% BSA（牛血清白蛋白）的PBS中，以减少非特异性结合，并在冰上孵育15–30分钟。
  5. 将细胞与针对不同标志物的特异性一抗（见材料表）在4 °C下孵育30分钟至1小时。按照生产商说明书，将抗体稀释于含1% BSA的PBS中。
  6. 孵育结束后，用PBS洗涤细胞2次，以去除未结合的抗体。最后一次洗涤后，将细胞重悬于600 µL含1% BSA的PBS中，用于流式细胞术分析。
  7. 根据实验中使用的荧光染料（如FITC、PE、APC）配置合适的激光器和滤光片。利用前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）设门，选择活的单细胞群体，排除碎片和细胞聚集体。使用未染色对照样本校准流式细胞仪，确保仪器正确对齐。基于未染色对照设置特定设门，以确定各目标标志物的阳性细胞群（阈值为0.02%）。

3. 大鼠子宫内膜上皮干细胞的长期培养

  1. 集落形成实验
    注意：该实验有助于确定重编程胚胎干细胞（reESCs）的最佳培养基。
    1. 将P0代reESCs以每孔1,000个细胞的密度接种至6孔板中，分别在REEM培养基或不含A8301、Y27632或CHIR99021的REEM培养基中培养14天。
    2. 培养结束后，在室温下用4%多聚甲醛固定细胞20分钟，随后用结晶紫溶液染色20分钟。
    3. 统计含有超过50个细胞的细胞簇数量，并根据支持细胞簇生长的培养基选择最优培养条件。
      注意：从REEM中去除特定因子会导致reESCs增殖能力下降（图1B、C）。基于这些结果，选择REEM作为reESCs培养的首选培养基，以优化培养条件。
  2. 每2天更换一次REEM培养基。当细胞融合度达到80–90%时，使用0.25%胰蛋白酶/1 mM EDTA消化5–6分钟。
  3. 以1:3的传代比例在REEM培养基中进行细胞传代。
  4. 增殖实验
    1. 将P1、P7和P14代reESCs以每孔4 × 103个细胞的密度接种至96孔板中，每孔加入150 µL REEM培养基。
    2. 在培养24、48、72和96小时后，向每孔加入10 µL CCK-8试剂，随后在37 °C孵育2小时。
    3. 使用酶标仪测定450 nm处的吸光度，以确定细胞增殖速率。
  5. 冻存液的制备与使用
    1. 使用含10% DMSO的REEM培养基配制冻存液。
    2. 用0.25%胰蛋白酶/1 mM EDTA收集reESCs。
    3. 将细胞沉淀重悬于冻存液中，调整细胞浓度至1 × 106个细胞/mL，并将细胞悬液转移至冻存管中。
    4. 先将冻存管置于-80 °C冰箱中冷冻，24小时内转移至液氮中长期保存。
      注意：若计划短期内复苏细胞，建议将冻存细胞在-80 °C保存不超过6个月。
    5. 将REEM培养基预热至37 °C。
    6. 取出冻存的reESCs，置于37 °C水浴中解冻1–2分钟。
    7. 将解冻后的reESCs以每孔1 × 105个细胞的接种密度接种至6孔板中，使用REEM培养基进行培养。
  6. 免疫荧光染色
    1. 将处于对数生长期的reESCs以每孔2 × 103个细胞的密度接种于u-Slide 8孔板中，并在REEM培养基中培养。
    2. 当reESCs融合度达到90%时，用4%多聚甲醛固定20分钟。固定前后均用PBS洗涤2次。
    3. 使用0.2% Triton X-100处理细胞10分钟以增加通透性。
    4. 用含5%牛血清白蛋白（BSA）的30%山羊血清在室温下封闭细胞30分钟。封闭前后均用PBS洗涤2次。
    5. 加入一抗（抗SSEA-1和抗角蛋白抗体），4 °C孵育12小时。孵育后用PBS洗涤2次。
    6. 加入二抗，在室温下孵育1小时。孵育后用PBS洗涤2次。
    7. 用150 µL DAPI对细胞进行复染，标记所有细胞核。
    8. 使用倒置共聚焦显微镜拍摄染色后的细胞图像。

4. 从大鼠子宫内膜干细胞建立大鼠子宫内膜类器官

  1. 类器官的生成
    1. 当重编程胚胎干细胞（reESCs）达到70%融合度时，用0.25%胰蛋白酶/1 mM EDTA消化细胞5-6分钟。
    2. 将5 × 105个reESCs重悬于500 µL解冻的Matrigel中，并接种至12孔板中。将培养板置于37 °C孵育20分钟，以促进凝胶形成。
    3. 待细胞-Matrigel混合物凝固后，每孔加入1.5 mL REEM培养基覆盖Matrigel。每2-3天更换一次REEM培养基。
  2. 免疫荧光染色
    1. 吸除REEM培养基，向12孔板中每孔加入1 mL预冷的类器官收获溶液。冰上孵育40-60分钟。
    2. 用巴斯德吸管收集类器官，于4 °C以300 × g离心3分钟。
    3. 用PBS洗涤类器官2-3次。
    4. 用4%多聚甲醛固定类器官20分钟，随后用5% BSA封闭60分钟。
      注意：每一步操作前后均需用PBS洗涤2次。
    5. 将类器官与用1% BSA稀释的一抗在4 °C孵育过夜。
    6. 将类器官与二抗在室温下孵育1小时。
    7. 用200 µL DAPI对类器官进行复染。
    8. 使用倒置共聚焦显微镜采集图像。
  3. 苏木精-伊红（HE）染色
    1. 通过梯度乙醇脱水处理类器官：70%乙醇30分钟；80%乙醇30分钟；95%乙醇30分钟；100%乙醇两次，每次30分钟。将类器官浸入二甲苯中两次，每次30分钟以进行透明处理。
    2. 将透明后的类器官浸入60 °C熔化的石蜡中1小时。将浸透石蜡的类器官转移至包埋模具中，填充熔化石蜡，并将模具置于冷台上使石蜡凝固。待石蜡完全凝固后从模具中取出石蜡块，并修去多余石蜡。
    3. 将石蜡块安装到切片机上。切取5 µm厚的切片，并将其漂浮于温水浴（42-45 °C）中展平。小心将切片转移至载玻片上，并在玻片加热器上烘干。
    4. 将载玻片浸入二甲苯中两次，每次5分钟以脱蜡。通过梯度乙醇复水：100%乙醇两次，每次3分钟；95%乙醇3分钟；70%乙醇3分钟；最后用蒸馏水冲洗。
    5. 用苏木精染色5分钟，然后用流水冲洗5分钟。用1%酸性乙醇分化数秒，再用流水冲洗5分钟；将切片置于0.2%氨水中蓝化30秒，再用流水冲洗5分钟；用伊红染色2分钟。通过梯度乙醇脱水：70%乙醇1分钟；95%乙醇1分钟；100%乙醇两次，每次1分钟。最后用二甲苯透明两次，每次1分钟。
    6. 在染色后的切片上滴加一滴封片剂，然后盖上盖玻片，避免产生气泡。在光学显微镜下观察染色切片。
  4. 荧光染色
    1. 按照步骤4.3.1至4.3.4所述进行脱蜡和复水处理。
    2. 在微波炉中预热抗原修复液。将载玻片放入加热的抗原修复液中，保持亚沸状态20分钟。让载玻片在抗原修复液中冷却40分钟。用去离子水冲洗载玻片5分钟。
    3. 将载玻片在含0.3%过氧化氢的甲醇溶液中孵育10分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。用PBS冲洗载玻片三次，每次5分钟，在湿盒中用封闭液于室温孵育1小时。轻轻拍去多余封闭液，但不要冲洗。
    4. 根据生产商说明书，将一抗用封闭液稀释。将稀释后的一抗加至组织切片上，在湿盒中4 °C孵育过夜。
    5. 用PBS冲洗载玻片三次，每次5分钟。根据生产商说明书，将HRP标记的二抗用封闭液稀释。将稀释后的二抗加至组织切片上，在湿盒中室温孵育1小时。用PBS冲洗三次，每次5分钟，以去除未结合的二抗。
    6. 根据试剂盒说明书配制荧光素酪胺工作液。将工作液加至组织切片上，在湿盒中室温孵育15分钟。用PBS冲洗三次，每次5分钟。
    7. 重复步骤4.4.1至4.4.5，直至完成所有三种抗体的染色。在每张组织切片上滴加含DAPI的荧光封片剂，小心盖上盖玻片以避免气泡。使用倒置共聚焦显微镜观察切片。
  5. 定量PCR
    1. 按照步骤4.2.1至4.2.3所述收集类器官。吸除PBS，根据生产商说明书从类器官中提取总RNA。
    2. 使用任意市售的反转录试剂盒，以1 µg总RNA合成cDNA。根据试剂盒生产商的方案配制q-PCR反应体系。q-PCR所用引物序列见材料表。

5. 大鼠子宫内膜类器官的长期培养

  1. 吸除REEM，并加入1 mL类器官消化液，作用40分钟以解离类器官。将样品置于冰上孵育，以维持类器官完整性。
  2. 孵育结束后，使用巴斯德吸管收集类器官，于4 °C下以300 × g离心3分钟，使类器官沉淀，以便后续操作。
    注意：修剪吸管尖端有助于无损操作较大类器官（超过500 µm）。
  3. 将沉淀的类器官重悬于Matrigel中，按1:2或1:3的比例混合，用于包埋及后续在12孔板中的培养。
  4. 制备冷冻保存液：含10% DMSO的REEM。
  5. 收获类器官后，将其重悬于冷冻保存液中，随后置于-80 °C超低温冰箱或液氮中长期保存。
  6. 复苏冻存类器官时，将REEM在37 °C水浴中预热，并将冻存管浸入水浴中，缓慢融化类器官。
  7. 解冻后，将类器官重悬于500 µL Matrigel中，用于重新包埋并在12孔板中培养。后续操作请参照步骤4.1.2至4.1.3。
    注意：建议将冻存类器官短期保存于-80 °C，长期保存则应转移至液氮中。

6. 可选：将类器官转至贴壁培养

注意：该方案提到一种通过将类器官转换至贴壁培养以获得扁平培养的重编程胚胎干细胞（reESCs）的替代方法，该方法可实现类器官形态的重构。

  1. 吸除REEM，并加入1 mL类器官收获液以解离类器官。置于冰上孵育，以维持类器官完整性。
  2. 孵育后，使用巴斯德吸管收集类器官，并在4 °C下以300 × g 离心3分钟，形成沉淀。
  3. 将类器官重悬于3 mL预热的REEM中，并将重悬的类器官转移至3.5 cm培养皿中。每2天更换一次REEM培养基。
  4. 当细胞达到70%融合度时，使用0.25%胰蛋白酶/1 mM EDTA消化5–6分钟。
  5. 按照步骤4.1.1至4.1.3，使用reESCs重建类器官。

7. 类器官与雌二醇（E2）和孕酮（P4）的序贯培养

  1. 用DMSO配制E2和P4的储备液。将储备液用REEM稀释至所需的工作浓度（E2：10 nM；P4：1 µM），确保最终DMSO浓度不超过0.1%，以避免细胞毒性作用。
  2. 将类器官在REEM中按照步骤4.1.1至4.1.3培养4天。更换为添加E2的REEM继续培养7天。每天观察类器官的生长情况和形态变化，每2-3天更换一次培养基。
  3. 更换为添加E2和P4的REEM。每天观察类器官的生长情况和形态变化，每2-3天更换一次培养基。继续培养类器官7天。

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结果

由六只体重在200 g至250 g之间的雌性Sprague-Dawley大鼠建立reESCs和大鼠子宫类器官，具体操作步骤遵循以下方案： 图1借鉴人子宫内膜上皮干细胞长期培养的成功经验，REEM培养基主要包含Y27632、A8301和CHIR99021，以稳定reESC 体外我们首先采用酶消化法和机械法从大鼠子宫内膜中分离子宫内膜细胞。随后进行流式细胞术分析 图2A 结果显示，原代子宫内膜细胞中约50%为表达CD9的上皮细胞（49.8%），EpCAM（4.49%）和CD24（2.64%）表达水平较低。重编程子宫内膜干细胞（reESCs）标志物SSEA-1占6.58%，而内皮细胞标志物CD31（30.9%）和CD45（70.3%）比例相对较高。

然而，在REEM培养基中培养的P1代重编程胚胎干细胞（reESCs）呈现出均匀的漩涡状或多边形形态，并形成致密的克隆结构（图 2D). 从REEM...

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讨论

在本研究中，我们描述了一种分离和培养大鼠子宫内膜上皮干细胞（reESCs）的简便方法，并优化了先前建立的 离体 人子宫内膜上皮干细胞系统8我们的方法采用含有Y27632、A8301和CHIR99021作为核心组分的小分子培养基，以实现稳定且长期的 离体 培养。此外，我们利用重编程的胚胎干细胞（reESCs）成功实时生成了大鼠子宫内膜类器官。该新型体系简化了目前依赖组织块的子宫内膜类器官培养方法，从而更清晰地揭示了细胞谱系关系10重要的是，我们的系统可在细胞水平上促进基因编辑及其他操作，从而生成表达特定基因的类器官。此外，该类器官系统可实现对大鼠子宫内膜中特定基因的靶向敲除或过表达，进而实现子宫内膜上皮干细胞的筛选与培养，以生成子宫内膜类器官。这一综合性的研究方法从多个方面阐明了特定基因的功能 体内 和 离体 为研究与子宫内膜上皮相关的疾病提供了新的视角。

药物筛选是类器官的一项关键应用。然而，目前类器官的来源和制备方...

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

本工作由广东省基础与应用基础研究基金（2023A1515110760）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗 CD15（SSEA-1）Abcamab135377兔源，1:200（IHC）
抗雌激素受体 αAbcamab32063兔源，1:200（IHC）
抗广谱细胞角蛋白Abcamab7753鼠源，1:250（IHC）
抗孕激素受体Abcamab101688兔源，1:200（IHC）
抗 Ki67Abcamab279653鼠源，1:250（IHC）
A8301TargetMol909910-43-6
β-雌二醇MerckE8875
细胞计数试剂盒-8BeyotimeC0038
CD9BioLegend1098191:20（FC），Pacific Blue
CD24BioLegend1018061:20（FC），FITC
CD31BioLegend3031201:20（FC），APC
CD45BioLegend3017031:20（FC），PE
CHIR99021TargetMolCT99021
Cultrex 类器官收获溶液R&D Systems3700-100-01
Cy3 TSA 荧光系统试剂盒APExBIOK1051
Cy5 TSA 荧光系统试剂盒APExBIOK1052
DAPISigmaD95421 μg/mL
DMEM/F-12Invitrogen11330032
EpCAMBioLegend3698031:20（FC），PerCP
荧光素 TSA 荧光系统试剂盒APExBIOK1050
山羊抗兔 IgG，Alexa Fluor 488InvitrogenA-110081:500
山羊抗鼠 IgG，Alexa Fluor 555InvitrogenA-214221:500
山羊抗兔 IgG/HRP 抗体APExBIObs-0295G-HRP
无血清培养基替代物Invitrogen10828028
MatrigelCorning356234
PrimeScript RT Master MixTakaraRR063A
孕酮Merck57-83-0
Sprague-Dawley 大鼠 上海杰思捷实验动物有限公司，中国
SSEA-1BioLegend3230471:20（FC），APC
TB Green Fast qPCR MixTakaraRR820A
TriZOLInvitrogen15596026CNRNA 提取
u-Slide 8 孔板Ibidi80827
Y27632TargetMol146986-50-7
目的基因的 qPCR 引物 
基因公司序列
大鼠 GAPDH F生工生物GACATGCCGCCTGGAGAAAC
大鼠 GAPDH R生工生物AGCCCAGGATGCCCTTTAGT
大鼠 Nanog F生工生物GACTAGCAACGGCCTGACTCA
大鼠 Nanog R 生工生物CTGCAATGGATGCTGGGATA
大鼠 Sox2 F生工生物ATTACCCGCAGCAAAATGAC
大鼠 Sox2 R生工生物ATCGCCCGGAGTCTAGTTCT
大鼠 Oct4 F生工生物CCCAGCGCCGTGAAGTTGGA
大鼠 Oct4 R
GG		生工生物ACCTTTCCAAAGAGAACGCCCA

参考文献

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