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利用修饰的合成寡核苷酸检测核酸代谢酶

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DOI：

10.3791/66930

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2024年7月5日

 ,  ,  ,  , 
1University of Waikato, 2ArcticZymes Technologies ASA

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于检测核酸代谢酶的实验方案，以连接酶、核酸酶和聚合酶为例进行了说明。该检测方法利用荧光标记和未标记的寡核苷酸，可组合形成模拟RNA和/或DNA损伤或通路中间体的双链结构，从而实现对酶活性特征的表征。

摘要

商业供应商提供的多种修饰合成寡核苷酸，使得研究人员能够在任何标准分子生物学实验室中开发出复杂的检测方法，用于表征核酸代谢酶的多种特性。荧光标记的使用使这些方法对拥有常规聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）设备和荧光成像系统的科研人员而言更加便捷，无需使用放射性材料，也无需配备专门用于放射性物质储存和制备的实验室（即“热实验室”）。选择性地添加磷酸化等标准修饰可简化实验操作流程，而特异性引入模拟DNA损伤或反应中间体的修饰核苷酸，则可用于探究酶功能的特定方面。本文展示了利用商业化合成寡核苷酸设计并实施多种酶促DNA加工过程检测的方法，包括连接酶对不同DNA和RNA杂交结构的连接能力、核酸酶对这类结构的降解能力、DNA连接酶对不同辅因子的利用差异，以及酶的DNA结合能力评估。文章还讨论了设计合成核苷酸底物时需考虑的因素，并提供了一组基础寡核苷酸序列，可用于多种核酸连接酶、聚合酶和核酸酶活性检测。

引言

所有生命形式都需要核酸加工酶来执行复制、转录和DNA修复等基本生物学过程。这些通路中的关键酶功能包括聚合酶（可生成RNA/DNA分子的拷贝）、连接酶（可连接多核苷酸底物）、核酸酶（可降解多核苷酸）、解旋酶和拓扑异构酶（可解开核酸双链或改变其拓扑结构）1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。此外，许多这类酶还为克隆、诊断和高通量测序等应用提供了重要的分子工具11,12,13,14,15。

通过退火寡核苷酸制备标记的 DNA/RNA 底物，可以测定这些酶的功能特性、动力学参数以及底物特异性。传统上，通过在链的 5' 末端引入放射性标记（32P）来追踪底物和产物，随后可通过X光胶片或磷屏成像系统进行检测16,17。尽管放射性标记底物具有提高实验灵敏度的优点，且不会改变核苷酸的化学性质，但操作放射性同位素可能带来的健康风险促使了非放射性核酸标记技术的发展，为 DNA 和 RNA 的检测提供了更安全的替代方案18,19,20。其中，荧光检测技术——包括直接荧光检测、时间分辨荧光以及能量转移/荧光淬灭分析——被认为是最具通用性的方法21,22,23,24。丰富的荧光染料种类使得可在每条寡核苷酸上设计独特的报告基团，从而实现多样化的 DNA/RNA 底物设计25。此外，与放射性同位素相比，荧光染料具有更高的稳定性，使研究人员能够制备并长期保存大量荧光标记的 DNA 底物19。这些荧光标记的底物可与目标蛋白以及不同组合的金属离子和核苷酸辅因子共同孵育，以分析其结合情况或酶活性。结合或活性的变化可通过凝胶成像系统中不同的荧光染料通道进行观察。由于该技术仅能显示荧光标记的寡核苷酸，因此标记寡核苷酸大小的任何增加或减少均易于追踪。此外，凝胶还可后续使用核酸染色染料进行染色，以可视化凝胶上存在的所有 DNA 条带。

多核苷酸连接酶是一类能够连接DNA/RNA片段的酶，通过催化5'端磷酸化的DNA末端与DNA的3'羟基之间形成磷酸二酯键，从而封闭断裂。根据其对核苷酸底物的需求，可将连接酶分为两类：依赖NAD且高度保守的连接酶存在于所有细菌中26，而结构多样的依赖ATP的连接酶则广泛分布于所有生命域中8,27。DNA连接酶在DNA复制过程中参与冈崎片段的加工，同时也在多种DNA修复通路（如核苷酸切除修复和碱基切除修复）中发挥作用，通过封闭自发产生的切口以及修复后残留的切口来维持基因组完整性8,10。不同的DNA连接酶在连接DNA断裂的不同构型方面表现出不同的能力，包括双链中的切口、双链断裂、错配、缺口，以及RNA与DNA的杂合结构28,29,30。通过将带有5'磷酸的寡核苷酸退火，可在核酸双链中形成相邻的5'和3'末端，从而构建多种可连接的底物结构31,32,33。最常用的分析方法是采用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（urea PAGE）进行终点检测；然而，近年来的新技术也包括毛细管凝胶电泳（可实现高通量分析）34、质谱分析35，以及均相分子信标检测法（可实现时间分辨的实时监测）36。

连接反应的第一步是连接酶通过三磷酸腺苷（ATP）或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）发生腺苷酰化，从而形成共价的酶中间体。反应的第二步是在切口位点5'端的核酸底物发生腺苷酰化，随后完成核酸切口链的连接。许多在E. coli中重组表达的连接酶在纯化时已处于腺苷酰化形式，因此无需添加核苷酸辅因子即可有效连接核酸。这使得确定其具体依赖哪一类核苷酸辅因子变得困难。本文除了描述评估DNA连接酶活性的实验方法外，还提供了一种通过非标记底物去腺苷酰化酶以可靠判断其辅因子使用类型的方法。

核酸酶是一类庞大且多样化的DNA/RNA修饰酶和催化性RNA，可切割核酸之间的磷酸二酯键37。在DNA复制、修复以及RNA加工过程中均需要核酸酶的功能，根据其对DNA、RNA或两者糖基的特异性，可将核酸酶进行分类。内切核酸酶可在DNA/RNA链内部水解磷酸二酯键，而外切核酸酶则从DNA/RNA链的3'端或5'端逐个水解核苷酸，其作用方向可以是3'到5'，也可以是5'到3'38。

尽管许多核酸酶蛋白具有非特异性，可能参与多种过程，但另一些核酸酶则对特定序列或DNA损伤具有高度特异性6,39,40。序列特异性核酸酶被广泛应用于多种生物技术领域，例如克隆、诱变和基因组编辑。这些应用中常用的核酸酶包括限制性核酸酶41、锌指核酸酶42、转录激活因子样效应物核酸酶，以及最近出现的RNA引导的工程化CRISPR核酸酶43。近年来还鉴定出一些损伤特异性核酸酶，例如EndoMS核酸酶，其通过具有错配特异性的RecB样核酸酶结构域，对DNA中的碱基错配具有特异性识别能力5,44。传统的核酸酶活性检测通常采用间断式检测方法，使用放射性标记的底物进行；然而，除了其他固有缺陷外，这类方法无法确定核酸酶蛋白切割的具体位点，而使用荧光标记底物则可以实现该目的45,46。近年来发展出的连续式核酸酶检测方法，则利用不同状态下与DNA相互作用的DNA染料来实现检测；例如，某些染料在与双链DNA（dsDNA）结合时比在未结合状态下发出更强的荧光信号，或特异性结合短链RNA47。其他连续式核酸酶检测方法则使用发夹结构DNA，其5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团，当寡核苷酸被降解导致荧光基团与淬灭基团分离时，荧光信号随之增强48。 尽管这些检测方法可用于表征DNA降解蛋白的动力学特性，但它们需要事先了解酶的功能及其底物，并且仅适用于那些能改变DNA构象从而影响染料结合能力的酶。因此，仍有必要采用终点检测法，通过分辨单个核酸酶反应产物，以深入了解蛋白质活性所引起的DNA修饰情况。

本文详细介绍了一种荧光标记DNA/RNA寡核苷酸的设计方法，这些寡核苷酸可灵活组合，用于构建底物以检测新型核酸酶、聚合酶和连接酶的活性。该基本寡核苷酸序列组的验证简化了实验设计，无需购买大量定制底物，即可经济高效地分析多种酶的功能特性。文中提供了使用这些底物进行标准DNA加工酶活性检测的详细操作流程，并以DNA连接酶活性检测为例，描述了适用于核酸酶和聚合酶检测与分析的相应改进方法。此外，还介绍了一种经改进的高精度检测DNA连接酶辅因子特异性的实验方法，并采用双标记探针评估多组分连接反应的组装情况。最后，讨论了对基本检测体系的若干改进方案，使其可利用相同的底物通过电泳迁移率变动分析法（EMSA）来研究蛋白质与DNA的相互作用。

方案

1. 寡核苷酸的设计与采购

注意：设计用于组装并退火形成目标双链的单链寡核苷酸。双链中的一条或多条链必须带有荧光基团，以便追踪目标酶对寡核苷酸的加工过程。用于多种活性实验的一组基础单链序列见表1。

  1. 根据下文所述，为感兴趣的酶引入所需的特定修饰。
    1. 对于DNA连接酶底物（图1）：由三条寡核苷酸组装最简单的底物，包括5'端磷酸化的供体链（NL2）、5'端FAM标记的受体链（NL1）以及连接两者的互补链（NL3）。
      1. 在步骤2中组装底物主混合液之前，确保提供可连接切口5'末端的链已磷酸化。可通过在NL2上订购修饰（如表1所示），或在寡核苷酸重悬后使用T4多核苷酸激酶进行酶促磷酸化。
      2. 对NL6和NL8进行5'端磷酸化修饰，它们分别构成如图1A所示双链断裂的互补链（NL6/NL7 和 NL8/NL9），以更接近限制性内切核酸酶产生的天然底物。使用双标记底物以确定多组分组装中连接反应程度的相对差异（见步骤6）。
      3. 改变互补链序列以产生错配（NL10）和缺口（NL11）。
        注：简单切口底物的多种变体如图1A所示。可通过调整下划线位置使用其他序列，产生更广泛的错配或更长的缺口。
      4. 将DNA寡核苷酸替换为RNA寡核苷酸。
        注：简单切口底物的多种变体如图1B所示。通过此处提供的基本寡核苷酸组合，可生成更广泛的DNA/RNA双链体，例如包含RNA和DNA的双链断裂。下文步骤6中给出了此类变体的一个示例，其中采用了双标记策略。
    2. 对于DNA聚合酶底物：将表1中列出的寡核苷酸NL1和NL3组装，构建简单的引物延伸检测体系。通过在NL1（引物）或NL3（模板）链中引入修饰，进一步研究聚合酶活性的其他方面。
      1. 在NL3寡核苷酸中第20位点之前引入损伤碱基类似物，以评估聚合酶对模板链上损伤位点的跨过能力。
      2. 在NL1寡核苷酸的第20位点引入损伤碱基类似物，以评估延伸受损引物的能力。
      3. 在双链体中使用RNL1或RNL3，以研究RNA引物的延伸或RNA模板的使用。
    3. 对于核酸酶底物（图2）：组装寡核苷酸，以获得非穷尽范围的双链和单链底物（图2Ai），以及一系列 flap 和 splayed 结构的连接区（图2Aii）和损伤底物（图2B）。
      1. 为检测核糖核酸酶活性，可依次将NL1、NL2和NL3替换为RNL1、RNL2和RNL3。使用HJ5和HJ6的额外RNA版本进一步扩展该底物集合。
      2. 使用在中心位置含有修饰的寡核苷酸MD5、MD6和MD9，以模拟氧化损伤、无碱基修复中间体或脱氨产物（图2B）。这些底物可用于检测该位点处链的切割。用正交荧光染料（如TAMRA）标记互补链NL3，以检测双链切割（见步骤6）。
      3. 对互补链进行正交标记，以检测探针链（NL5和ND9）及互补链（MD10和NL10）上错配位点的双链切割。
  2. 从商业供应商订购含有相关荧光染料及其他修饰的合成寡核苷酸。
    注：对于所述检测，100 nM合成规模并在合成后进行HPLC纯化是合适的。

2. 核酸双链的组装与退火

  1. 寡核苷酸的重悬与稀释
    1. 开启前，将装有冻干寡核苷酸的2 mL离心管在台式离心机中以最大速度离心2–5分钟，确保核酸沉于管底。
    2. 制备一份主储备液 100 µM 通过将寡核苷酸重悬于TE缓冲液（10 mM 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris），1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA））中。通过反复轻柔涡旋振荡并以最高速度短暂离心，确保寡核苷酸充分重悬。
    3. 制备 10 µM 通过用 TE 缓冲液稀释母液的一份等分试样来制备储备液。将 10 µM 用超纯水（MQ水）定容，配制所需浓度的工作液 0.5 µM, 0.7 µM，或 2.5 µM 如上所述 表2.
  2. 配制并退火反应主混合液
    1. 使用工作液按照所提供的组合配制反应主混合液 表2 以及以……给出的体积 表3标准DNA连接酶实验及其他大多数实验的最终缓冲液组成为：50 mM Tris（pH 8.0）、50 mM NaCl、10 mM 二硫苏糖醇（DTT），并以10 mM Mg作为二价阳离子。
    2. 在PCR或微量离心管中通过加热使寡核苷酸退火 95 °C 使用加热块或PCR仪加热5分钟，然后室温冷却30分钟（体积 <1 mL）至1 h（体积 >1 mL）。对于较长的寡核苷酸（>40 nt），使用降温速率为 95 °C 至 25 °C 超过45分钟，或将含有退火混合物的离心管置于盛有沸水的1 L烧杯中漂浮，并过夜冷却至室温。
    3. 将核苷酸辅因子及其他对热敏感的缓冲液组分在冷却至室温后加入主混合液中。随后可直接加入酶（见下文步骤3）以终反应混合物进行检测，或将其储存于 -20 °C 以备将来使用。

3. 标准检测设置

  1. 实验反应的组装与启动
    1. 在 PCR 管中，将 22.5 µL 目标底物主混合液与 2.5 µL 目标 DNA 连接酶或其他酶混合。建议每个反应设置重复两到三份，尤其是当结果需要进行定量分析时。
    2. 在检测样本中应包含无蛋白对照（仅缓冲液）。如需要，此时也应设置无辅因子对照。
      注意：酶可在含 50% v/v 甘油的溶液中于 -20 °C 保存，因此可直接从溶液中吸取使用。在加入前，需通过移液混匀或轻柔涡旋，确保含甘油的酶溶液充分混匀。
  2. 立即将反应体系转移至 25 °C 的 PCR 仪中，孵育 30 分钟。根据酶活性的最适条件，可对温度和孵育时间进行调整。
  3. 加入 5 µL 上样染料（95% 甲酰胺，0.5 M 乙二胺四乙酸 (EDTA)，溴酚蓝）以终止反应，并在 95 °C 孵育 5 分钟。

4. 检测结果分析

  1. 按如下所述制备 Tris-硼酸-EDTA (TBE)-尿素聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE)。
    1. 配制 20% 丙烯酰胺、7 M 尿素和 1×TBE 溶液的储备液。对于本文所述的寡核苷酸体系，建议使用丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液（29:1 比例），以获得最佳分辨率。
    2. 每块凝胶，将 10 mL 20% 丙烯酰胺和 7 M 尿素溶液与 100 µL 过硫酸铵 (APS, 10%) 及 3 µL 四甲基乙二胺 (TMED) 混合，在凝胶模具中灌胶。
  2. 待凝胶完全凝固后，在 45–55 °C 条件下于 TBE 尿素凝胶上电泳样品。
    1. 使用 1×TBE 缓冲液对凝胶进行预电泳，每块凝胶 10 mA，持续 30 分钟，并配合外置加热装置。
    2. 用移液器吸取 1×TBE 缓冲液冲洗凝胶加样孔，以去除多余的尿素。
    3. 每样加载 10 µL 反应液，在外置加热条件下以 10 mA 电泳 1.0–1.5 小时。
  3. 根据所选荧光染料的特性，使用成像仪的适当设置对凝胶进行成像。对于 FAM 荧光染料，应使用激发/发射波长为 495/519 nm 的滤光片组，该设置通常已预存于大多数成像仪中。
  4. 使用成像仪自带的图像分析软件或 ImageJ49,50 等外部程序，对产物和底物条带的强度进行定量，并根据以下公式计算产物百分比：
    百分比公式：P/(P+S)×100；用于计算产率或浓度测定。
    其中 P 为产物条带的积分光密度值，S 为底物条带的积分光密度值。以 DNA 连接酶反应为例，产物条带迁移至 40 个核苷酸 (nt) 位置，底物条带迁移至 20 nt 位置。

5. 测试辅因子特异性的DNA连接酶去腺苷化反应

  1. 反应主混合液的制备
    1. 配制一组含有FAM标记的NL1寡核苷酸的主混合液，具体如表4所述。另配制一组不含FAM标记的NL1寡核苷酸的主混合液，具体如表4所述。
    2. 分别将两种DNA双链在95 °C下加热5分钟，然后在25 °C下冷却30分钟至1小时。两种主混合液中均不添加核苷酸辅因子。
  2. 去腺苷酰化反应的组装与启动
    1. 针对每种待测试的辅因子类型/浓度，通过将10 µL未标记的主混合液与2.5 µL连接酶混合，配制单个去腺苷酰化反应体系。
    2. 另设无辅因子对照组和无蛋白对照组（以2.5 µL缓冲液代替酶）。
    3. 将反应体系在酶最适活性所需的特定温度下孵育1–2小时。若酶仍处于腺苷酰化状态，可延长孵育时间。
  3. 在辅因子存在下进行连接反应
    1. 直接向去腺苷酰化反应体系中加入10 µL标记的主混合液和2.5 µL所需核苷酸辅因子（如ATP、NAD、ADP或GTP），使终浓度为0.1–1 mM。
    2. 向无核苷酸辅因子对照组中加入2.5 µL反应缓冲液。
    3. 在与之前相同的孵育时间和温度条件下进行反应。按步骤4所述进行终止反应和可视化检测。

6. 使用双标记底物进行夹板连接或多片段组装

  1. 设计并购买一种带有荧光基团的寡核苷酸，其激发/发射光谱应与已使用的荧光染料不同。
    1. 在本文所述的实验设置中，使用在3'端标记了5-羧基四甲基罗丹明（TAMRA）的NL2（TAMRA）寡核苷酸（表1）。
  2. 按以下说明配制主反应混合液。
    1. 混合步骤2中描述的反应组分，包括所有用于组装的寡核苷酸的等摩尔比例，以及缓冲液和二价阳离子。
    2. 在95 °C加热5分钟，然后在25 °C冷却30分钟至1小时进行退火。加入辅因子和酶，并按照步骤3所述进行孵育。
  3. 按照步骤4所述方法，使用底物中荧光染料对对应的适当通道运行并成像样品。对于FAM和TAMRA，应使用大多数成像仪上配备的荧光素（FITC）和四甲基罗丹明（TRITC）通道。

7. 采用非变性凝胶电泳迁移率变动分析（EMSA）评估DNA结合

  1. 按如下说明制备10%非变性TBE聚丙烯酰胺凝胶。
    1. 将2.5 mL 40%丙烯酰胺、1 mL 10×TBE、100 µL 10%过硫酸铵（APS）、3 µL 四甲基乙二胺（TMED）和6.5 mL超纯水混合，在凝胶铸模器中灌胶。
  2. 按如下说明组装结合反应。
    1. 根据表5配制EMSA探针，确保包含EDTA（10 mM）并省略金属离子。
    2. 在PCR管中将20 µL EMSA探针主混合液与5 µL蛋白混合。设置不含蛋白的对照样品。在25 °C孵育30分钟。
  3. 按如下说明进行非变性电泳分析。
    1. 向样品中加入5 µL 5×非变性上样染料（含100 mM EDTA、0.25%溴酚蓝、25% v/v甘油，加超纯水至1 mL）。
    2. 将样品上样至已制备的凝胶，在4°C水循环冷却条件下以60 V电泳2–3小时，直至染料前沿距凝胶底部几厘米处。
    3. 按照步骤4所述方法对凝胶进行成像和分析。

结果

DNA连接酶介导的连接反应
在尿素PAGE凝胶上观察时，DNA连接酶的酶活性会导致荧光标记的寡核苷酸分子大小增加。对于表2中列出的DNA和RNA连接反应底物，这种情况对应于片段长度从20 nt增加至40 nt，即大小翻倍（图3A）。可通过改变温度、蛋白浓度、孵育时间（图3B）、核苷酸辅因子或金属辅因子（图3C）等条件来确定连接酶的最佳活性。还可通过平行实验比较连接酶在不同底物上的相对活性（图3D）。

产物和底物条带的定量以发生连接的总底物的百分比表示，如图3所示，可用于评估酶的比活性，或确定酶的最适活性条件，如二价阳离子偏好、温度或pH值。

细菌DNA连接酶DV-1-1-Lig（图3）能够连接切口和错配的DNA底物，并可利用镁离子和锰离子进行连接反应，其中更偏好镁离子。该酶的更多详细信息见文献51。

DNA聚合酶介导的引物延伸
使用本文提供的寡核苷酸组合时，DNA聚合酶通过延伸20 nt的荧光标记引物，可导致产物大小最多增加40 nt。图4A）。部分延伸的产物将呈现为一条梯状条带，其大小直至模板的长度（图 4B 和 图 4C）。此处所示的引物延伸实验（图4C) 导致引物链的完全合成。

核酸酶降解
核酸酶活性在尿素PAGE凝胶上观察时，会导致荧光标记的寡核苷酸尺寸减小。具有特异性内切核酸酶活性的核酸酶可能产生一条单一的20 nt产物（图5A- C）。具有外切核酸酶活性的核酸酶将产生不同大小的荧光标记寡核苷酸（图 5D- F）。此处展示了南极细菌宏基因组来源的核酸酶蛋白的实验结果，该蛋白在双链无碱基位点底物上表现出特异性内切核酸酶活性，而在单链底物上则具有非特异性外切核酸酶活性（图 5C 和 图5F，分别）。

连接酶去腺苷化及核苷酸辅因子使用检测
许多重组表达的连接酶会从宿主中捕获ATP或NAD，并在纯化时已处于腺苷化状态51,52,53,54,55。去除这种共价结合的AMP中间体，对于准确鉴定该酶在核酸底物连接过程中可利用的核苷酸辅因子范围至关重要51。在无外源核苷酸辅因子的条件下，利用未标记底物对腺苷化的连接酶进行 turnover 反应，可耗尽其腺苷化中间体。通过使用荧光标记的DNA底物，并仅在第二步中加入核苷酸辅因子，此时在凝胶成像仪的荧光通道（荧光素-FITC）下所观察到的任何连接产物，均源于该步骤中加入的核苷酸辅因子所介导的腺苷化反应。

使用在 E. coli 系统中表达的细菌DNA连接酶进行的活性检测表明，该酶以预腺苷化形式被纯化，并在无额外辅因子的条件下对切口DNA具有本底连接能力（图6Ai-ii）。向腺苷化连接酶中添加ATP可增加反应中连接产物的生成量，但该结果并不总是可靠，因为这种基础活性可能错误地提示该酶具有广谱辅因子利用能力，或进一步添加核苷酸辅因子可能抑制底物的连接反应。通过首先将连接酶与未标记的切口DNA底物孵育，可实现AMP的 turnover，此时除非向反应中添加ATP，否则在标记的切口DNA底物上观察不到连接反应。第二项活性检测（图6B）显示，去腺苷化的DNA连接酶在添加ATP和ADP后，对切口DNA底物的连接活性有所提高。添加GTP也能在一定程度上提高连接活性，且高于无辅因子对照组中观察到的本底连接水平。而在添加NAD的反应中观察到的连接活性与无辅因子对照组相当，因此排除NAD作为该连接反应的辅因子。

双标记检测结果
正交荧光团可用于检测复杂底物不同区域的活性。图7展示了近期报道的DNA连接酶R2D56与T4 DNA连接酶在搭桥DNA/RNA双链结构底物上的活性比较。底物中RNA供体部分与DNA受体的连接通过6-FAM进行检测，而DNA供体与RNA受体的连接则通过5-TAMRA检测（图7A）。通过观察复合图像中6-FAM和5-TAMRA双通道均出现荧光信号的产物条带（呈现黄色），可评估DNA在RNA底物两端的相对连接程度，其中单独的6-FAM和5-TAMRA信号分别为绿色和黄色（图7B）。如先前文献所述56，仅R2D连接酶能够将DNA连接至RNA的5'端，而两种连接酶均可将DNA连接至RNA的3'端。当在单一反应体系中同时连接两个DNA分子至RNA时，R2D连接酶可将DNA寡核苷酸连接至RNA两端，表现为条带向上迁移，并观察到颜色变为黄色（图7C）。

第二个示例在 图8 采用双标记方法展示在不同 pH 条件下多个寡核苷酸的连接情况。底物由七种寡核苷酸混合组装而成，用于验证 R2D 连接酶组装短片段的能力。其中，5' 链包含一条 FAM 荧光标记的 14 nt 寡核苷酸，互补链则在 16 nt 寡核苷酸的 3' 端标记 TAMRA 荧光基团。成功连接可通过 FAM（绿色）寡核苷酸和 TAMRA（红色）寡核苷酸出现额外的更高条带得以观察。两种荧光信号的重叠产生黄色条带，代表长度相同且完全连接的核酸链。

利用电泳迁移率变动分析法检测DNA连接酶的DNA结合结果
DNA连接酶与带磷酸化的切口DNA结合后，形成一个分子量高于单独寡核苷酸的复合物（图9A）。此处展示了细菌ATP依赖性DNA连接酶与切口DNA底物的结合情况。在高蛋白浓度下，大部分标记的DNA底物被结合，并出现在较高分子量的条带中；而在较低蛋白浓度下，游离的DNA底物占主导地位（图9B）。

DNA/RNA 连接底物示意图；切口、平端、黏性末端、错配、缺口；生化实验设置。
图 1：用于检测连接酶酶活性的不同核酸底物的设计示意图。 星号表示在5'末端（5' FAM）用6-羧基荧光素进行标记。标记的链用黑色或深蓝色/红色线（在DNA/RNA双链的情况下）表示，而底物双链中未标记的部分用灰色或浅蓝色/红色线（在DNA/RNA双链的情况下）表示。标记的链长为20 nt，若链发生连接，则形成40 nt的产物。5'磷酸化位点用圆圈中的P表示。寡核苷酸链已标记，其名称在表 1和表 2中列出。(A) 含有不同类型断裂的双链DNA底物的设计，用于检测DNA连接酶的酶活性。(B) RNA及RNA/DNA双链底物的设计，包含DNA和RNA寡核苷酸。这些底物含有单一的切口位点，用于检测连接酶封闭RNA/DNA双链中切口的能力。红线代表RNA寡核苷酸，蓝线代表DNA寡核苷酸。请点击此处查看该图的放大版本。

DNA底物示意图：正常、修饰、损伤。显示序列、修饰、错配。
图2：用于检测核酸酶酶活性的不同核酸底物的示意图。 星号表示在5'末端用6-羧基荧光素标记（5' FAM）。标记的链用黑线表示，而底物双链中未标记的部分用灰色线表示。5'磷酸化位点用圆圈中的P表示。寡核苷酸链均已标注，其名称在表1和表2中列出。(A) 含有双链和单链区域的底物设计。( B) 双链DNA底物的设计经过修饰，以在3'或5'末端产生单链 flap（3'端flap、5'端flap，或两端均有flap（splayed））。(C) 在中央位置引入损伤碱基或错配的双链底物设计。请点击此处查看该图的放大版本。

DNA连接过程及变性尿素PAGE胶结果；40nt连接产物分析。
图3：细菌ATP依赖性DNA连接酶DV-1-1-Lig连接活性的检测。（A）在TBE尿素PAGE胶上分析DNA底物上连接酶活性的酶学检测示意图。星号表示在5'末端用6-羧基荧光素标记（5' FAM）。标记的链以黑线表示，而底物双链中在分析过程中不可见的部分以灰色线条表示。（B）DV-1-1-Lig在不同时间点对切口DNA的连接反应定量分析。每种底物的活性检测均设两个重复。反应在25 °C下孵育不同时间（0.5 h、1 h、2 h、3 h和4 h），终浓度分别为4 µM蛋白、1 mM ATP和10 mM镁离子。（C）在镁离子（Mg）或锰离子（Mn）存在下对切口DNA底物进行连接反应。反应条件为25 °C孵育3 h，ATP终浓度1 mM，金属离子终浓度10 mM。（D）在不同DNA底物上的连接反应结果。反应条件为20 °C孵育8 h，终浓度分别为2 µM蛋白、1 mM ATP和10 mM镁离子。反应中加入蛋白质以加号（+）表示，对照反应以C表示，未加蛋白质以减号（-）表示。产物（40 nt）和底物（20 nt）由红色箭头指示。活性检测结果通过成像系统可视化。条带信号强度使用ImageJ软件49进行积分定量，并通过绘图软件生成图表。请点击此处查看该图的放大版本。

DNA聚合酶反应与变性PAGE胶结果示意图；图示显示dNTP的添加及产物分析。
图4：DNA聚合酶实验。（A）在DNA底物上进行引物延伸实验的示意图。星号表示在5'末端（5' FAM）标记6-羧基荧光素。标记的链用黑线表示，而底物双链中在分析过程中不可见的部分用灰色线条表示。（B）预期的TBE尿素PAGE胶结果示意图，显示随着核苷酸的加入，标记引物的长度增加。（C）使用大肠杆菌（E. coli）Klenow片段DNA聚合酶进行引物延伸的示例。反应中加入蛋白质以加号（+）表示。泳道1：12.5 U；泳道2：2.5 U；泳道3：1.25 U。对照反应以C表示，未添加蛋白质以减号（-）表示。反应在25 °C下进行15分钟，反应体系包含5 mM MgCl2、50 mM Tris pH 8.0、50 mM NaCl2、1 mM DTT和0.25 mM dNTPs。产物（40 nt）和底物（20 nt）由红色箭头指示。活性实验结果通过成像系统进行可视化。请点击此处查看该图的放大版本。

DNA 切割实验；变性 PAGE 胶图；核酸酶活性；底物-产物分离。
图 5：使用不同底物、金属离子和孵育温度检测细菌南极宏基因组来源核酸酶的活性。 （A）核酸酶蛋白在脱碱基位点（以 x 表示）底物上特异性内切酶活性的示意图。星号表示在 5' 末端（5' FAM）标记 6-羧基荧光素。黑线代表标记的链，灰色线代表未标记的 DNA 链。核酸酶的特异性切割发生在脱碱基位点的右侧，但也可能发生在左侧。（B）变性尿素 PAGE 胶示意图，显示在无蛋白（以减号“-”表示）条件下未切割的底物（40 nt），以及在有核酸酶（以加号“+”表示）条件下产生的切割产物（20 nt）。（C）TBE 尿素 PAGE 胶示例，展示该核酸酶在含脱碱基位点的双链 DNA 底物上的特异性内切酶活性结果。实验中蛋白浓度为 1.0 µM，MgCl2 浓度为 1 mM。两个对照反应在 20 °C 下进行，分别为无蛋白（第 1 泳道）和无金属离子（第 2 泳道）。反应在 1 °C 至 50 °C 逐渐升高的温度下孵育 5 小时，温度如胶图上方所示。加号“+”表示添加蛋白，减号“-”表示未添加蛋白。底物和产物由红色箭头指示。（D）示意图显示核酸酶蛋白在单链底物上的非特异性外切酶活性。星号表示在 5' 末端（5'FAM）标记 6-羧基荧光素。黑线代表标记的链。核酸酶的非特异性切割产生不同长度的标记片段（<39 nt）。（E）示意图表示变性尿素 PAGE 胶，在未添加蛋白（-）时显示未切割的底物（40 nt），在添加蛋白（+）后显示产生不同长度的切割片段，可能源于非特异性外切酶活性。（F）TBE 尿素 PAGE 胶展示同一南极宏基因组来源核酸酶在单链底物上的非特异性外切酶活性示例。实验在 20 °C 下进行 4 小时，蛋白终浓度为 1.5 µM，金属离子终浓度为 10 mM。所用金属离子在图上方标明。加号“+”表示添加蛋白，减号“-”表示未添加蛋白。底物（40 nt）由红色箭头指示，不同长度的产物由红色夹子符号指示。所有核酸酶反应结果均通过成像系统进行可视化。请点击此处查看本图的放大版本。

DNA连接效率、电泳结果；图表和凝胶显示辅因子对连接反应的影响。
图6：腺苷酸化与去腺苷酸化的细菌DNA连接酶对切口DNA底物的连接结果。（A）i) 在有或无ATP条件下，腺苷酸化与去腺苷酸化的连接酶酶促连接反应的定量分析。图中各数据点代表每个反应重复的平均值，包含标准误差条。ii) TBE尿素PAGE凝胶显示腺苷酸化与去腺苷酸化的连接酶在有或无ATP条件下对切口DNA底物的连接结果。反应设三个重复。去腺苷酸化的酶在加入标记的切口DNA底物前，先与未标记的切口DNA底物和0.1 µM酶在25 °C预孵育2小时，随后再孵育1小时。腺苷酸化的酶未与未标记底物进行预孵育。ATP（1 mM）在加入标记DNA底物时一并加入反应体系。（B）i) 去腺苷酸化的连接酶在不同辅因子（ATP、NAD、ADP和GTP）存在下对切口DNA进行连接的定量分析。图中各数据点代表每种浓度的平均值，包含标准偏差误差条。ii) TBE尿素PAGE凝胶显示连接酶在添加或不添加不同辅因子条件下的连接结果。每种底物的活性检测设两个重复。反应在25 °C预孵育2小时，体系包含未标记的切口DNA底物、4 µM蛋白和5 mM镁离子；随后加入标记的切口DNA底物、5 mM镁离子以及终浓度为1 mM的不同辅因子，继续孵育4小时。反应中加入蛋白以加号（+）表示。对照反应不包含蛋白（对照，C）或不包含辅因子（无辅因子）。产物（40 nt）和底物（20 nt）由红色箭头指示。酶活性检测结果通过成像系统可视化，条带信号强度使用ImageJ软件进行积分定量49。图表由绘图软件生成。请点击此处查看该图的放大版本。

FAM、TAMRA 标记的 DNA 连接过程；包含凝胶电泳图解及分析结果
图 7：通过 DNA 模板介导，将短的荧光标记 DNA 寡核苷酸连接至 5' 磷酸化 RNA 寡核苷酸的两端。 （A）DNA 模板介导的 DNA-RNA 连接示意图，展示如何通过双标记策略可视化可能的连接产物。（B）预期在尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Urea-PAGE）中双通道成像所观察到的可能产物示意图。（C）双荧光探针连接实验结果。连接反应使用 T4 DNA 连接酶和 R2D 连接酶进行测试，分别在单独反应中将 DNA 连接到 RNA 的 5' 端（第 2–4 泳道）或 3' 端（第 5–7 泳道），或在同一反应体系中同时连接两条 DNA 寡核苷酸（第 8–10 泳道）。无蛋白对照（NPC）未添加酶。本示例中使用的反应条件和具体寡核苷酸序列同文献56中所述。 请点击此处查看该图的放大版本。

DNA连接示意图；不同pH、6-FAM、TAMRA标记及连接反应的凝胶电泳结果
图8：在不同pH条件下，利用三种R2D变体连接多个短寡核苷酸片段。 （A）多片段连接策略示意图。（B）代表性凝胶图像，显示多片段组装对pH的依赖性，通过FAM和TAMRA通道成像。泳道C为无酶对照，泳道1-3为pH 6.0，泳道4-6为pH 6.5，泳道7-9为pH 7.0，泳道10-12为pH 7.5。请点击此处查看该图的放大版本。

天然TBE PAGE凝胶电泳图，通过电泳显示蛋白质-底物结合；蛋白质浓度。
图9：EMSA 结果。 电泳迁移率偏移实验（EMSA）的示意图与天然TBE PAGE凝胶，用于可视化一种ATP依赖性DNA连接酶（来源于中国台湾M地区宏基因组数据）的结合活性c南极洲默多干谷）的DNA底物上。A) DNA连接酶在切口DNA底物上进行EMSA/ DNA结合活性的示意图。结合结果在非变性TBE PAGE凝胶上可视化。与连接酶结合的DNA底物在凝胶中迁移较慢，而无酶的底物迁移较快，从而在凝胶上产生条带大小的偏移（黄色框）。由于底物在非变性凝胶上显示，寡核苷酸保持退火状态，因此FAM标记链（黄色星号）在游离和结合的底物中均存在。可通过蛋白浓度梯度确定最佳结合的蛋白浓度。B在非变性TBE PAGE凝胶上进行EMSA可视化，显示ATP依赖性DNA连接酶在不同蛋白浓度下与切口DNA底物的结合能力。该酶与切口DNA底物在不同蛋白浓度下于30分钟内孵育。 25 °C，终浓度为1 mM ATP和40 mM EDTA。使用了三种不同的蛋白质浓度（5.5 µM, 2.3 µM，以及 1.5 µM). 反应产物在含有天然上样染料的10%天然TBE凝胶上进行电泳。含蛋白质的样品按不同蛋白质浓度设三个重复进行电泳。对照泳道包含切口DNA底物、终浓度1 mM ATP和EDTA，但不含蛋白质。 请点击此处以查看此图的放大版本。

表1：用于构建检测底物的DNA底物寡核苷酸序列。 损伤位点以粗体和下划线标出。最终双链中的错配和缺口位置以下划线标示。缩写：5' 羧基荧光素（5' FAM），8-氧代脱氧鸟苷（8OxodG），无碱基四氢呋喃（dSpacer）。请点击此处下载该表格。

表2：用于配制不同酶活性检测主混合液的寡核苷酸组合。 请点击此处下载该表格。

表3：最多包含四种寡核苷酸的检测反应主混合液的配制。 不同检测底物所用的寡核苷酸组合请参见表2，反应条件的详细信息见正文。至少需要一种标记的寡核苷酸——双链结构的其他部分以方括号表示。请点击此处下载本表格。

表4：制备切口DNA双链所用标记与未标记主混合液的组分。 请点击此处下载该表格。

表5：不同双链组合的EMSA主混合液配制方案。 不同EMSA底物所用的寡核苷酸组合见表3，反应条件的详细信息见正文。EMSA底物使用与活性检测相同的寡核苷酸进行设计。请点击此处下载该表格。

讨论

实验方案中的关键步骤
寡核苷酸设计与采购：在购买用于双链形成的寡核苷酸时，必须考虑序列设计。建议在订购前使用寡核苷酸分析工具预测核苷酸序列的性质，例如GC含量、熔解温度、二级结构以及二聚化潜力57。

核酸双链的组装与退火：在制备RNA/RNA-DNA双链时，应采取措施防止RNase污染，使用无RNase的试剂和水，或添加RNase抑制剂（前提是所研究的酶本身不是RNase）。在配制总混合液之前，应对实验设备、手套和操作台面使用RNase去污染溶液进行处理，以避免寡核苷酸降解58。RNA寡核苷酸的母液可分装成小份配制，以防污染。

DNA连接酶始终需要一种核苷酸辅因子，即ATP或NAD，终浓度介于0.1至1 mM之间。DNA聚合酶需要脱氧核苷三磷酸（dNTPs）以进行链的合成，通常以等摩尔比例添加，每种浓度为50 µM。在配制连接酶和聚合酶双链反应的预混液时，核苷酸辅因子（如ATP、NAD和dNTPs）必须在混合物加热后冷却至室温再加入预混液中，因为这些物质对热敏感。

退火寡核苷酸所用的10倍缓冲液需要添加DTT，而DTT的半衰期较短，最好在使用前新鲜配制或冻存。可预先配制小份的10倍缓冲液，于4 °C保存，并在使用前加入DTT。

寡核苷酸储备液和预混液应于 -20 °C 长期保存；荧光标记的寡核苷酸或预混液需用铝箔包裹，以防止荧光基团发生光漂白。为避免反复冻融导致寡核苷酸完整性受损，建议分装成小体积（>1 mL）并使用。

实验设置与结果分析：对照组的设置对于正确解读实验结果至关重要。 应使用无蛋白质对照（仅含DNA底物和缓冲液）以确保底物上观察到的活性确实来源于酶的作用。对于核酸酶实验，外源性底物降解会在对照中产生低分子量条带或梯状条带；而对于连接酶或聚合酶实验，若双链未完全变性，则会在对照中出现高分子量条带。预期产物大小的阳性对照见表2，应将其包含在实验中以验证产物大小是否正确。

成功进行检测产物电泳的重要参数已在先前的方案中有所描述59。这些参数包括确保丙烯酰胺的百分比适合底物大小，以及根据底物大小和结果可视化所需的凝胶类型选择合适的上样染料。示踪染料溴酚蓝的迁移速度大致相当于10个碱基的寡核苷酸，因此适用于本文所述的寡核苷酸组；然而，如果使用较短的核苷酸时，染料条带与荧光产物或底物条带发生重叠，则可将示踪染料更换为迁移较慢的二甲苯青60。

为了确保底物/产物条带的良好分辨率，凝胶电泳槽应通过水浴外部加热或使用高电压（例如 180 V）进行运行。预先运行尿素PAGE凝胶至少30分钟，并用移液器冲洗加样孔以去除多余的尿素，对于获得适合定量分析的清晰、笔直条带至关重要。

为了准确定量子底物和产物，应将总材料的20%至80%转化为产物，以便对荧光凝胶条带进行准确积分。若检测一种新酶，建议设置一系列蛋白质浓度梯度，以便后续测量落在该范围内。许多荧光成像仪内置有条带积分功能，可用于此目的。如果使用ImageJ49等外部程序，需确保以高质量的tiff格式导出凝胶图像。

技术的改进与故障排除
寡核苷酸设计与采购：本方案中提供的寡核苷酸可作为有用的起始点，可根据方法部分的建议，通过改变寡核苷酸序列并引入修饰来进一步扩展。

标准检测设置与结果分析：在测试新酶活性时，预实验至关重要，因为不同蛋白质的最适反应条件各不相同；本方案中提供的参数仅作为起始参考。在配制主混合液和进行检测反应时，可调整的因素包括酶浓度、反应温度、孵育时间、辅因子以及缓冲液组成/pH值。辅因子浓度尤为关键，因为核苷酸辅因子或金属离子过量均可能产生抑制作用，建议对每种辅因子进行浓度梯度测试。对于DNA聚合酶，推荐的dNTP总浓度范围为20至200 µM，但高浓度dNTP会降低保真度61。同样，多核苷酸连接酶通常在0.1–1.0 mM核苷酸辅因子条件下进行检测，但过高的浓度会导致DNA过度腺苷酰化，从而引起反应抑制62。

本标准方案使用 Mg 作为二价阳离子；然而，某些酶在锰（Mn）或锌（Zn）存在时活性更高。含有 Mn 或 Zn 的预混液应使用较低 pH 的缓冲液（<7.5）配制，且金属离子应在加热后添加。预混液应在配制当天使用，以避免沉淀产生以及酶活性受抑制。

添加剂，包括聚乙二醇（PEG）等拥挤剂或牛血清白蛋白等稳定剂，可用于提高某些酶的活性63,64。由于这些添加剂具有热不稳定性，应在退火步骤之后添加。所有生物来源的试剂均应为分子生物学级别，以避免引入污染性核酸酶。

本方案中使用的甲酰胺淬灭缓冲液的体积适用于基础寡核苷酸集合。然而，对于较长的寡核苷酸，甲酰胺体积应增加至10 µL至20 µL之间，以确保完全的链分离，淬灭后的反应样品可迅速在冰上冷却，并在4 °C保存直至进行电泳。

对于某些酶而言，蛋白质与底物/产物的紧密结合可能会阻碍寡核苷酸在电泳过程中进入凝胶，尤其是在酶的使用浓度较高时。这将表现为凝胶上缺乏产物/底物条带，并且通常会在加样孔中观察到荧光物质（与蛋白质结合的产物和/或底物）的积累。为了破坏这些复合物，可在加入淬灭缓冲液之前用蛋白酶K处理反应体系，或者在淬灭过程中加入十二烷基硫酸钠（SDS）。

DNA连接酶活性会产生两条清晰的条带，易于进行定量分析。该方法也可用于定量内切核酸酶在DNA损伤底物上的活性，此时预期产生一条20个核苷酸的单一产物，或用于EMSA实验中明显区分结合态与非结合态的情况。通过条带积分对聚合酶和持续性核酸酶活性进行准确定量较为困难，通常建议使用引物或信标探针的实时检测方法，具体如引言中所述。

DNA连接酶的去腺苷酸化及辅因子特异性：可能需要对该方案进行一些优化，以去除所有背景活性，随后通过添加核苷酸辅因子恢复活性。如果在去腺苷酸化后仍存在背景连接酶活性（表现为无辅因子对照组中出现连接信号），可延长去腺苷酸化步骤的孵育时间，或降低连接酶的浓度。确保未标记的DNA切口双链体浓度高于蛋白（> 4:1::底物:蛋白）。如果在存在标记DNA的情况下添加辅因子后，仍无法恢复任何测试辅因子的连接活性，则可能是酶已变性，此时应缩短去腺苷酸化步骤的时间。对于一种新的连接酶或新批次的重组酶，有必要先确定在无额外核苷酸辅因子条件下，腺苷酸化酶的背景连接程度。这需要设置另一个反应，将10 µL未标记主混合液、10 µL标记主混合液与2.5 µL未经去腺苷酸化处理的新鲜酶同时孵育。

使用双标记底物：本实验方案需要设计并购买一种带有荧光基团的寡核苷酸，该荧光基团的激发/发射光谱需与最初使用的荧光染料不同，然后将其组装成双链结构，使两种正交的荧光染料分别标记底物的不同部分。如有疑问，可使用多种在线光谱查看工具检查激发和发射光谱，例如 FPbase Spectra Viewer 和 BD Spectrum Viewer，这些工具可用于评估荧光染料组合的兼容性以及选择最合适的成像仪设置。用于观察凝胶的具体设置将取决于成像仪型号和所用的荧光染料。复合图像将在同一凝胶上记录两个通道的信号，而两个荧光染料均结合在同一产物上的条带将显示为中间颜色。可通过分析各通道的独立图像，定量评估不同标记链的连接或降解程度。

该技术的局限性
尽管使用荧光标记底物具有多种优势（例如对健康的危害较低），但在使用这类标记底物时仍需考虑一些局限性。其一是订购带有荧光基团标记或修饰（如引入损伤碱基）的寡核苷酸的成本相对较高，相较于实验室内部放射性标记而言更为昂贵。其二是检测标记链需要专用的成像设备和软件。然而，目前大多数新型凝胶成像系统已配备这些功能。此外，还应考虑荧光基团可能改变目标相互作用蛋白的结合特性。荧光素及其衍生物FAM常用于寡核苷酸标记，但其荧光信号对pH变化和碱基淬灭效应较为敏感65。因此，在设计双链寡核苷酸时，应仔细考虑荧光基团的类型及其在寡核苷酸上的位置。

披露

SEG 和 UR 是 ArcticZymes Technologies AS 的员工，该公司分销 R2D 连接酶。AW、ER-S 和 RS 不存在利益冲突。

致谢

AW 获得卢瑟福发现奖学金（20-UOW-004）的支持。RS 获得新西兰 南极后奖学金 SG 和 UR 感谢特罗姆瑟大学化学研究所的支持ø - 挪威北极大学提供技术支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液（29:1）BioRad1610156
三磷酸腺苷（ATP）多家供应商
过硫酸铵（APS）多家供应商
台式离心机多家供应商
硼酸盐多家供应商
溴酚蓝多家供应商
二硫苏糖醇（DTT）多家供应商
配备循环水浴的电泳系统多家供应商
乙二胺四乙酸（EDTA）多家供应商
荧光成像仪，例如 iBright FL1000Thermo Fisher ScientificA32752
甲酰胺多家供应商
凝胶灌注系统多家供应商
加热金属块多家供应商
氯化镁多家供应商根据所研究的蛋白质，可能更倾向于使用其他金属离子
微量离心管（1.5 mL）多家供应商
移液器及吸头多家供应商1 mL、0.2 mL、0.02 mL、0.002 mL
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）多家供应商
寡核苷酸Integrated DNA TechnologiesNAThermo Fisher、Sigma-Aldrich、 Genscript 等公司也提供此类产品
巴斯德吸管多家供应商
PCR 扩增仪多家供应商
PCR 管多家供应商
RNAse awayThermoFisher7002PK仅在处理 RNA 寡核苷酸时需要
RNase AWAYMerck83931-250ML用于去除表面 RNase 污染的表面活性剂
无 RNase 水New England BiolabsB1500L仅在处理 RNA 寡核苷酸时需要
氯化钠多家供应商
SUPERase IN RNase 抑制剂Thermo Fisher ScientificAM2694广谱 RNase 抑制剂（基于蛋白质）
SYBR GoldThermo Fisher ScientificS11494可用于凝胶染色后处理，以可视化未标记的寡核苷酸
四甲基乙二胺（TMED）多家供应商
Tris 或三（羟甲基）氨基甲烷多家供应商
超纯水（Milli-Q）Merck
尿素多家供应商
涡旋振荡器多家供应商

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