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通过侧尾静脉注射在成年小鼠中稳定递送腺相关病毒

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DOI：

10.3791/66934

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2024年8月23日

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1Neuromuscular and Neurogenetic Disorders of Childhood Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2The Dubowitz Neuromuscular Centre, Molecular Neurosciences Section, Developmental Neurosciences Research and Teaching Department, Great Ormond Street Institute of Child Health, University College London, 3Department of Molecular Microbiology and Immunology, University of Southern California, 4NIHR Great Ormond Street Hospital Biomedical Research Centre, 5Genetics and Genomic Medicine Research and Teaching Department, Great Ormond Street Institute of Child Health, University College London

本文内容

摘要

本文详细介绍了一种优化的小鼠侧尾静脉注射方案，用于在成年小鼠中系统性给予腺相关病毒（AAV）。此外，我们还描述了常用的检测方法，以评估AAV的转导效率。

摘要

许多疾病会影响多个器官或累及身体的不同部位，因此必须通过全身给药方式将治疗药物递送至分布在各处的靶细胞。静脉注射是临床前研究中广泛使用的一种全身给药途径，适用于评估需在全身范围内发挥作用的治疗方法。在成年小鼠中，该方法是将治疗剂注入小鼠尾部侧面的静脉。一旦掌握，尾静脉注射操作安全、快速，且仅需简单并常见的实验工具。然而，尾静脉注射技术难度较高，需要经过大量训练和持续练习，以确保准确递送预定剂量。

本文介绍了一种基于我们自身经验以及先前其他研究团队所报告建议而优化的详细尾静脉侧向注射方案。除小鼠固定器和胰岛素注射器外，本方案仅需大多数实验室中常见的试剂和设备。我们发现，按照本方案操作可稳定、成功地将腺相关病毒（AAV）经静脉注射递送至未麻醉的7至9周龄小鼠尾静脉中。此外，我们还描述了用于评估AAV转导效率及生物分布的优化方案，包括荧光报告蛋白的组织学检测以及每二倍体基因组中病毒基因组拷贝数（vg/dg）的定量分析。本方案的目标是帮助实验人员更轻松、稳定且可重复地完成尾静脉注射操作，从而缩短掌握该技术所需的练习时间。

引言

单基因疾病占所有罕见病的80%，全球共有约3亿人受其影响1,2。目前，大多数此类严重致残的罕见病尚无获批的治愈性疗法1,2,3。然而，单基因疾病是基因治疗的理想适应症，可通过基因治疗实现对功能异常基因的替换、补充、校正或沉默4,5。目前，已有多种载体正在被开发并用于将基因治疗递送至特定细胞类型4,6。其中一种载体是腺相关病毒（AAV）。AAV是一种非致病性细小病毒，正越来越多地被用作基因治疗载体7。与其他病毒载体相比，AAV具有较低的免疫原性、较低的宿主基因组整合风险，并能高效转导多种组织中的分裂期和非分裂期细胞7,8。此外，已有多种方法被开发用于设计和筛选具有理想特性的AAV，例如特定的组织嗜性或进一步降低的免疫原性，这极大增强了AAV作为不同适应症病毒载体的多功能性9。这些因素使AAV成为被广泛研究的基因治疗载体，并推动了多种获美国食品药品监督管理局（FDA）批准的AAV基因疗法的开发10。

小鼠模型常用于测试潜在的基因疗法 体内 并更好地理解单基因疾病的发病机制。这得益于小鼠模型能够重现不同疾病的病理特征，其基因组与人类基因组具有高度相似性，以及小鼠在操作、饲养和繁育方面的相对便利性11,12,13. 体内 在研究影响身体多个系统或区域的疾病（如肌营养不良症）时，检测尤为重要。对于这类疾病， 体外 仅通过测试可能不足以全面评估经全身给药后拟作用于不同身体区域的治疗药物的安全性、有效性、药代动力学和药效动力学14.

可采用多种全身给药途径来递送药物。每种给药途径均有其优势、局限性，以及与所研究的动物模型和药物的相容程度15。在小鼠中，静脉（IV）尾侧静脉注射是腺相关病毒（AAV）全身递送的常用途径16。尾侧静脉注射可将注射物快速、直接地注入小鼠血液循环系统，确保药物在全身循环中具有较高的生物利用度17。此外，该方法所需操作工具相对简单且易于获取。然而，由于尾静脉管径较小且定位困难，尾侧静脉注射在技术上具有挑战性，需要较高的操作技能并持续练习，以避免注射失败或剂量递送不全16,17,18,19。若在注射过程中未能识别出剂量未完全注入的情况，可能导致昂贵试剂的浪费或实验结果不准确。本文总结的经验基于已有详尽文献报道的实验方案，我们对其进行了适应性改进，优化了尾侧静脉注射过程中的多个步骤，以确保注射操作持续成功20,21,22,23,24,25,26,27。

本文介绍了一种经过详细优化的侧尾静脉注射方案，使用简单且常见的工具，向未麻醉的7至9周龄小鼠递送腺相关病毒（AAV）。此外，我们还提供了用于评估AAV递送效率和生物分布的检测方法的操作流程。这些方案涵盖了注射后组织采集、组织固定、DNA提取，以及通过数字聚合酶链式反应（dPCR）定量每二倍体基因组中的载体基因组拷贝数（vg/dg）。本文提供的静脉注射方案及相关操作要点旨在提高侧尾静脉注射操作的成功率和便捷性，有望缩短掌握注射技术所需的时间，同时提升注射的准确性和重复性。

方案

所有动物操作和注射程序均经国家神经疾病与中风研究所（NINDS）动物护理委员会批准。所有动物实验均遵循NINDS动物护理和使用指南进行。

1. 注射前准备

  1. AAV 剂量配制
    1. 确定将要注射的小鼠的平均体重。
    2. 根据机构的动物护理指南，计算允许的最大注射体积，如公式（1）所示。最大注射体积通常以体积（µL）/小鼠体重（g）表示（例如，10 µL/g）。
      最大注射体积（µL）/小鼠 = （最大注射体积（µL/g）） × （小鼠平均体重（g））   （1）
      注：示例计算：每只小鼠最大注射体积 = 10 µL/g × 20 g/小鼠 = 200 µL/小鼠
    3. 设定每只小鼠需给予的 AAV 载体基因组（vg）剂量。
      注：该剂量可以是不同小鼠间相同的绝对值（例如，所有小鼠均接受 1.5 × 1012 vg，无论其体重如何）；或者剂量单位为 vg/kg，此时必须根据每只小鼠在注射当天的体重分别计算其所需注射的总 vg 数。
      1. 若剂量单位为 vg/kg，则在注射当天剂量配制前称量每只小鼠的体重。
      2. 根据小鼠体重，使用公式（2）计算每只小鼠需给予的载体基因组数量：
        特定小鼠需给予的载体基因组数（vg） = 预设的 vg/kg 值（vg/kg） × 小鼠体重换算公式；质量计算示意图，克转千克换算公式。    （2）
        注：在某些临床前研究中，使用 vg/kg 而非 vg/小鼠作为剂量单位可能更为合适，以确保注射剂量之间的有效比较。这是由于同龄小鼠中雄性和雌性之间，或可能同性别小鼠之间存在体重差异。
      3. 利用最大注射体积和 AAV（vg）剂量，计算配制所需剂量时所需的 AAV 原液和无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的体积（见公式（3–6））。确保实际注射体积等于或小于允许的最大注射体积。为补偿移液误差和注射器死体积，配制的注射液体积应始终比实际注射体积多至少 15 µL。
        注射液浓度（vg/µL） = 小鼠 AAV 载体剂量公式；关联载体基因组与注射体积，科研图表。    （3）
        配制注射液需加入的总 AAV 载体基因组数（vg） = 注射液浓度（vg/µL） × 配制体积（µL）    （4）
        配制注射液需加入的 AAV 原液体积（µL） = AAV 载体剂量计算公式；配制注射液体积的数学表达式。 （5）
        配制注射液需加入的 PBS 体积（µL） = 配制体积（µL） - 配制注射液需加入的 AAV 原液体积（µL）    （6）
        注：示例计算：
        对一只体重为 25 g 的小鼠，将以 200 µL/小鼠（注射体积）给予 6 × 1013 vg/kg（剂量）。AAV 原液滴度为 3.0 × 1013（vg/mL）
        该特定小鼠需给予的载体基因组数（vg） = 6 × 1013（vg/kg） × 质量换算公式，25 克转千克。 = 1.5 × 1012 vg/只小鼠
        注射液浓度 = 基因剂量计算公式，1.5e+12 vg/小鼠除以 200 µL/小鼠，公式示意图。 = 7.5 × 109（vg/µL）
        配制注射液需加入的总 AAV 载体基因组数 = 7.5 × 109（vg/µL） × （200（µL） + 15（µL）） = 1.6125 × 1012（vg）
        配制注射液需加入的 AAV 原液体积 = 病毒滴度计算，公式法，科研用途，比值计算。 = 53.75（µL）
        配制注射液需加入的 PBS 体积 = 215（µL） - 53.75（µL） = 161.25（µL）
    4. AAV 剂量配制步骤
      注：根据机构关于处理 AAV 的生物安全和个人防护装备（PPE）指南，在经高压灭菌、无 RNase 和 DNase 的 1.7 mL 微量离心管中，按照步骤 1.1.3.3 的计算结果，使用 AAV 原液和无菌 PBS 配制 AAV 注射液。始终将 AAV 原液和注射液置于冰上。使用洁净的微量移液器和新的移液器吸头盒以确保无菌。根据机构的废弃物管理指南丢弃被 AAV 污染的移液器吸头。
      1. 将 AAV 原液置于冰上解冻。
        注：避免反复冻融 AAV 原液。建议订购或制备成每份 100–200 µL 的分装液，以避免剂量配制后剩余过多需再次冷冻的 AAV。
  2. 注射工作站准备
    1. 清洁
      1. 用 70% 乙醇（EtOH）清洁工作区域。
      2. 使用具有杀菌、杀真菌和杀病毒作用的试剂对工作区域进行消毒。
      3. 用水和肥皂清洁小鼠固定管。
    2. 工作站工具设置
      1. 在试管架/支架中放置一个洁净的空 15 mL 锥形管。
      2. 设置一个抬高的平台用于放置小鼠固定管（图 1A，B）。
      3. 将洁净的小鼠固定管放置于工作区域。
      4. 若待注射小鼠明显小于现有小鼠固定管尺寸，可使用塑料啮齿类动物固定锥体制作一个适配的固定套管。参见步骤 2.1.3–4。
      5. 将用于注射的注射器放置于工作区域。使用 0.3 mL 胰岛素注射器，配备 29 G 针头。
      6. 将废物容器尽可能靠近注射站放置，以便立即丢弃被 AAV 污染的工具。
      7. 多次推拉每支注射器的活塞，确保其移动顺畅，避免注射过程中因注射器阻力影响操作。若活塞移动不顺畅，应丢弃该注射器并更换新的。
      8. 在注射区域附近备好小鼠电子秤和微型离心机。
      9. 将已配制好的 AAV 置于冰上，并提前放置于注射区域备用。
      10. 准备温水（38–40 °C）。注意水温不得超过 40 °C，以免烫伤小鼠尾部。

2. 注射步骤

  1. 小鼠固定
    1. 如有需要，称量每只小鼠的体重以计算以 vg/kg 为单位的给药剂量。
    2. 确保小鼠被完全固定，无法移动。
      注意：如果小鼠未被充分固定，在静脉注射过程中可能发生移动，导致针头移位。这可能导致针头脱离血管和/或对小鼠造成损伤。
    3. 使用管状固定器时：
      1. 在每只小鼠使用后，用温水和肥皂清洗固定器，以清洁并预热固定器。
      2. 将小鼠尾巴插入管状固定器顶部开口，然后缓慢将小鼠拉入固定器中。如果固定器尺寸适合小鼠体型，应在小鼠前方放置塞子，防止其逃脱。
        注意：塞子应足够靠近小鼠，以防止其在管内移动或旋转，但不应遮挡小鼠鼻部，确保其能自由呼吸。如果小鼠体型小于固定器尺寸，除管状固定器外，还需额外使用一次性柔性固定锥（具体操作见步骤 2.1.4）。
    4. 如需使用一次性柔性固定锥（为体型较小的小鼠制作固定套筒）：
      1. 在锥形前端进行切割，确保小鼠鼻部不被遮挡，有足够的呼吸空间。
      2. 沿锥体背部剪开，使锥体长度与小鼠基本一致（以便锥体可放入管中）（图 1A、B）。
      3. 如上文步骤 2.1.3 所述，将小鼠放入管状固定器中。在握住小鼠尾巴的同时，将固定锥的宽口端先插入管中。
      4. 在握住小鼠尾巴的同时，让小鼠自行走入锥体内，然后将剩余部分滑入管中。确保小鼠尾巴完全从管后端伸出，且小鼠在锥体内有足够呼吸空间。
      5. 立即在固定锥鼻部开口前方塞入管塞，确保小鼠被完全固定且有足够呼吸空间。
  2. 小鼠注射
    1. 在 15 mL 锥形管中装入温水。
    2. 将装有小鼠的管状固定器放置在抬高的平台上（图 1B）。
    3. 尽可能多地将被固定小鼠的尾巴浸入温水中至少 1 分钟，直至侧静脉明显扩张并可见（图 1B）。
    4. 在尾部加温过程中，将 AAV 剂量装入注射器。
      1. 将未加盖的含 AAV 的 1.7 mL 微量离心管置于试管架中。用惯用手将针头垂直插入管中。针头进入管内后，用非惯用手握住试管。
        注意：垂直插入针头可避免针头接触管壁而受损。也可采用其他注射器装液方法，但必须确保实验人员和被注射小鼠的安全。用非惯用手握住试管可防止在持管状态下插入针头时发生意外针刺伤。
      2. 针头插入管内后，同时将试管和注射器抬至 eye level，确保针头不接触管壁。双臂置于桌面上以保持稳定，缓慢将药液吸入注射器。
        注意：缓慢抽吸可防止细小气泡附着在注射器筒壁上。
      3. 排出注射器中的气泡。若注射 AAV，应确保在一次性吸水垫上排出气泡，该吸水垫随后需按生物危害废物处理。
      4. 持注射液至少 40 秒以使其升温。
        注意：注射前务必确保注射液已充分预热。若注射冷液体，除最初几 µL 外，液体可能无法顺利流入静脉。
      5. 每分钟检查一次尾静脉。
        注意：静脉必须清晰可见，直至注射部位（根据需要延长尾部加温时间并更换新鲜温水，直至静脉清晰可见，但不得超过机构动物操作规程允许的固定时间）。
      6. 确认静脉清晰可见后，将管状固定器从抬高平台上取下，直接放置于桌面上。调整小鼠在固定器中的位置，使其足部朝下而非侧向，以便于尾部操作。
        注意：小鼠在固定器内不应侧卧或仰卧。小鼠应被完全固定，无法在固定器内移动或旋转，也无法移动或拉扯尾巴。
      7. 迅速用纱布擦拭尾部以吸干水分，再用酒精棉片擦拭，最后用干纱布擦干。
        注意：使用干纱布使尾部足够干燥以便牢固抓握，但不要完全干燥。尾部完全干燥时更难看清静脉。
      8. 将尾部向左或向右旋转约 90°，使两条侧静脉之一朝上。在尾部中段三分之一范围内选择合适的注射位点。初次注射应从远端（靠近尾尖）开始，若因注射失败或实验设计需要再次注射，则向近端移动。
        注意：不要尝试在先前注射位点的远端注射，否则注射液可能从先前穿刺点渗出。每条尾侧静脉的失败注射尝试不应超过 3 次，以避免造成小鼠痛苦或剂量不准确。可选操作：用非惯用手拇指和食指在注射位点近端（上游/靠近小鼠身体方向）施加压力 10 秒，手指起到止血带作用，进一步扩张注射位点静脉。10 秒止血带操作后立即松开手指，并确保两条侧静脉之一朝上且清晰可见。
      9. 用非惯用手拇指和食指在注射位点远端紧贴处握住尾部。将尾部弯过食指，使注射位点平贴于食指上。向后牵拉尾部，使其伸展，注射位点完全水平（0°，与水平桌面平行）（图 1C）。
      10. 用惯用手的食指和中指夹住注射器筒身凸缘两侧，拇指置于推杆处待命。
        注意：此持针方式有助于在针头进入静脉后避免拇指或针头移动（图 1C）。
      11. 双手置于桌面以保持稳定，将针头直接置于尾部和静脉上方，针尖斜面朝上，并与尾部平行。保持注射位点靠近握持尾部的食指，以提高注射位点的控制性和稳定性。
        注意：管状固定器应足够深入桌面，以确保双手均能获得支撑。
      12. 保持针头与尾静脉平行，并对针头施加向下的压力，将针头向前滑入静脉。
        注意：向下的压力应足以使针头以正确角度进入静脉。静脉极浅，因此进针时针头应尽可能平放。
      13. 缓慢将溶液注入静脉。给药完成后，缓慢拔出针头，并立即用纱布在注射位点施压至少 10 秒以止血。
        注意：施压时间应足够长，直至出血完全停止，以避免注射试剂的潜在损失。拔针后通常会出现血滴，表明针头已穿透静脉。但有时即使注射成功也可能不出现血滴。血滴并不表示注射成功，仅表明针头已进入静脉。可靠的注射成功指标是在注射过程中推杆完全无阻力。若针头位于静脉内，注射时推杆应无任何阻力，且注射位点近端静脉会短暂变浅（发白）（发白现象在某些小鼠品系中可能不明显）。若存在阻力和/或注射位点出现肿胀，则表明针头未正确进入静脉。此时应将针头完全从尾部拔出，并在失败位点近端（靠近小鼠身体方向）的新位点重新尝试注射。
      14. 根据机构的废弃物管理指南，丢弃被 AAV 污染的注射器和试管。
      15. 将小鼠从固定器中释放，并放回新笼子，与未注射小鼠分开饲养。观察小鼠 10 分钟，确保其注射后活动水平正常。
        注意：若注射的是可传播物质，此措施可避免试剂在未注射小鼠间传播。
      16. 使用杀菌、杀真菌和杀病毒试剂及 70% 乙醇对工作区域进行消毒。用清水和肥皂清洗小鼠管状固定器。

3. 解剖及组织采集与固定27

  1. 组织采集工作站准备
    1. 根据制造商说明，使用DNA降解试剂清洁工作台，以降解可能存在于工作区域的污染性DNA。
    2. 将甲基丁烷置于金属容器中，再将该金属容器放入泡沫塑料箱内，随后用干冰包围金属容器，使干冰的高度超过容器内甲基丁烷的液面高度。
    3. 标记并放置空的2 mL微量离心组织储存管于干冰上。在开始冷冻组织前，将甲基丁烷和组织储存管在干冰中预冷至少20分钟。同时将组织转移镊子置于干冰上冷却。
    4. 标记另一组2 mL微量离心组织储存管，并加入新鲜的4%多聚甲醛（PFA），室温保存。向每根管中加入足量的4% PFA，确保放入的组织完全浸没于溶液中。
  2. 组织采集与固定
    1. 根据机构的动物护理指南实施小鼠安乐死。
      注：此处采用异氟烷吸入法对小鼠进行深度麻醉，随后立即通过颈椎脱位法实施安乐死。
    2. 用70%乙醇（EtOH）彻底喷洒小鼠体表。
    3. 采集所需组织。
      注：本方案中所述的组织采集与固定方法已在骨骼肌和肝脏组织上进行过测试。
    4. 对于将用于DNA提取的组织：
      1. 将组织迅速投入预先用干冰预冷的甲基丁烷中，保持至少1分钟。使用预冷的转移镊子将冷冻后的组织从甲基丁烷转移至已预冷的空2 mL微量离心组织储存管中。于-80 °C保存组织。
        注：可选步骤：可在投入甲基丁烷前将组织切成约20 mg的小块，以便后续直接用于第4.1.4步。
    5. 对于将用于组织学分析及报告蛋白荧光信号保存的组织：
      1. 使用专用于PFA操作、且保持在室温的镊子，将组织放入含有4% PFA（室温保存）的相应微量离心管中，确保组织完全浸没于4% PFA溶液中。
        注：PFA污染可能对多种下游分子检测产生不利影响。处理PFA时仅使用专用镊子，以防止PFA污染其他组织或实验工具。
      2. 将微量离心管置于试管架上，并用铝箔纸覆盖试管架以避光。将覆盖后的试管架置于4 °C摇床中，轻柔振荡过夜孵育。
      3. 过夜孵育后，通过剧烈振荡将5.0 g蔗糖溶解于70 mL 1×PBS中，配制5%蔗糖溶液（w/v）。再加入适量1×PBS，定容至100 mL，获得终浓度为5%的蔗糖溶液（w/v）。
      4. 使用0.22 µm注射器滤器对5%蔗糖溶液进行灭菌。标记并用新配制的5%蔗糖溶液填充2.0 mL微量离心管。
      5. 将组织从4% PFA溶液中转移至含有5%蔗糖（室温保存）的相应微量离心管中，确保组织完全浸没于5%蔗糖溶液中。
      6. 将微量离心管置于试管架上，并用铝箔纸覆盖试管架以避光。将覆盖后的试管架置于4 °C摇床中，轻柔振荡过夜孵育。
      7. 过夜孵育后，通过剧烈振荡将20.0 g蔗糖溶解于70 mL 1×PBS中，配制20%蔗糖溶液（w/v）。再加入适量1×PBS，定容至100 mL，获得终浓度为20%的蔗糖溶液（w/v）。
      8. 使用0.22 µm注射器滤器对20%蔗糖溶液进行灭菌。标记并用新配制的20%蔗糖溶液填充2.0 mL微量离心管。
      9. 将组织从5%蔗糖溶液中转移至含有20%蔗糖（室温保存）的相应微量离心管中，确保组织完全浸没于20%蔗糖溶液中。
      10. 将微量离心管置于试管架上，并用铝箔纸覆盖试管架以避光。将覆盖后的试管架置于4 °C摇床中，轻柔振荡过夜孵育。
      11. 过夜孵育后，将甲基丁烷置于金属容器中，再将该金属容器放入泡沫塑料箱内。用干冰包围金属容器，使干冰的高度超过容器内甲基丁烷的液面高度。
      12. 标记并放置空的2 mL微量离心组织储存管于干冰上。在开始冷冻组织前，将甲基丁烷和组织储存管在干冰中预冷至少20分钟。同时将转移镊子置于干冰上冷却。
      13. 使用精密擦拭纸迅速吸去组织表面多余的20%蔗糖溶液。将组织迅速投入预先用干冰预冷的甲基丁烷中，保持至少1分钟。
      14. 使用预冷的转移镊子将冷冻后的组织从甲基丁烷转移至已预冷的空2 mL微量离心组织储存管中。于-80 °C保存组织。

4. 用于 vg/dg 定量的数字PCR

  1. 从组织中提取 DNA 及初始 RNA 消化
    注意：本 DNA 提取方案基于材料表中所列 DNA 提取试剂盒的说明书制定。含有冷冻组织块的离心管应始终置于干冰上。
    1. 准备一桶冰。
    2. 针对每个 DNA 样品，标记一个 1.5 mL 裂解珠管和两个无 RNase 且无 DNase 的 1.7 mL 微量离心管。
    3. 向每个珠管中加入 180 µL 的第一种 DNA 提取试剂盒缓冲液。将装有缓冲液的第一个珠管去皮重。
      ​注意：如果组织未在步骤 3.2.4.1 中预先切割，请使用在干冰上预冷的剃刀片将组织切成约 20 mg 的小块。此步骤必须在保持于 -20 ˚C 或更低温度的洁净冷冻切片机内进行。
    4. 将一块组织加入管中；称重并记录组织重量（约为 20 mg）。
    5. 立即将装有组织的裂解珠管置于冰上。缓冲液可能会结晶。
    6. 对每个组织样品重复上述步骤。
    7. 将离心管转移至裂解珠管均质仪中，在 4 ˚C 下以最大速度（速度 10）运行 1 分钟。
    8. 将样品置于冰上并转移至离心机。在 4 ˚C 下以 20,000 × g 离心 1 分钟。
    9. 在离心过程中，向第一组 1.7 mL 微量离心管中各加入 20 µL 蛋白酶 K。离心结束后，将匀浆上清液转移至含蛋白酶 K 的 1.7 mL 管中并充分混匀。在 56 ˚C 下孵育 15 分钟，同时以 500 RPM 混合。
    10. 使用小型离心机离心 1–2 秒，收集管壁和管盖上的液滴。在室温下孵育 2 分钟。
    11. 加入 4 µL RNase A，短暂脉冲涡旋混匀。在室温下孵育 2 分钟。再次脉冲涡旋 15 秒。
    12. 使用小型离心机离心 1–2 秒，收集管壁和管盖上的液滴。加入 200 µL 第二种 DNA 提取试剂盒缓冲液。脉冲涡旋 15 秒。
    13. 使用小型离心机离心 1–2 秒，收集管壁和管盖上的液滴。加入 200 µL 100% 乙醇（EtOH）。脉冲涡旋 15 秒。
    14. 使用小型离心机离心 1–2 秒，收集管壁和管盖上的液滴。将裂解物转移至 DNA 提取离心柱中。在 6,000 × g 下离心 1 分钟。
    15. 将离心柱放入新的收集管中。向离心柱中加入 500 µL 第三种 DNA 提取试剂盒缓冲液。在 6,000 × g 下离心 1 分钟。
    16. 将离心柱放入新的收集管中。向离心柱中加入 500 µL 第四种 DNA 提取试剂盒缓冲液。在 20,000 × g 下离心 3 分钟。
    17. 将离心柱放入新的 1.7 mL 微量离心管中。向离心柱中加入 100 µL 分子级水。在室温下孵育 1 分钟。在室温下以 6,000 × g 离心 1 分钟。
    18. 如有需要，测定 DNA 浓度。短期储存可置于 4 ˚C，长期储存则置于 -20 ˚C。
  2. 从 FACS 分选细胞中提取 DNA
    注意：本 DNA 提取方案基于材料表中所列 DNA 提取试剂盒的说明书制定。
    1. 细胞分选完成后，以 300 × g 离心 5 秒，使管壁和管盖上的所有液滴沉降至管底。确保所有液滴均已收集。
      注意：若样品体积小于 1.5 mL，可直接进入下一步。若样品体积大于 1.5 mL，使用移液器小心吸除并弃去上清液的上层部分，保留 1–1.5 mL 样品。
    2. 通过反复吹打混匀样品，并将其转移至 1.7 mL 微量离心管中。在室温下以 515 × g 离心 1 分钟。
    3. 弃去上清液，仅保留最后 50 µL。将沉淀重悬于 50 µL 第一种 DNA 提取试剂盒缓冲液中，最终体积为 100 µL。
    4. 按照制造商提供的从小体积血液中提取基因组 DNA 的方案进行操作（见材料表）。
      1. 加入 10 µL 蛋白酶 K 和 100 µL 第二种 DNA 提取试剂盒缓冲液；脉冲涡旋 15 秒混匀。在 56 °C 下孵育 10 分钟，同时以 300 RPM 混合。孵育期间轻柔翻转混匀两次。
      2. 使用小型离心机离心 1–2 秒，收集管壁和管盖上的液滴。加入 50 µL 100% 乙醇（EtOH），脉冲涡旋 15 秒混匀。在室温下孵育 5 分钟。
      3. 使用小型离心机离心 1–2 秒，收集管壁和管盖上的液滴。将样品转移至 DNA 提取柱中（柱置于 2 mL 收集管内），注意勿润湿边缘。以 6,000 × g 离心 1 分钟。
      4. 将柱放入洁净的 2 mL 收集管中，弃去含有穿流液的收集管。向柱中加入 500 µL 第三种 DNA 提取试剂盒缓冲液，注意勿润湿边缘，以 6,000 × g 离心 1 分钟。
      5. 再次将柱放入洁净的 2 mL 收集管中，弃去含有穿流液的收集管。向柱中加入 500 µL 第四种 DNA 提取试剂盒缓冲液，注意勿润湿边缘，以 6,000 × g 离心 1 分钟。
      6. 将柱放入洁净的 2 mL 收集管中，弃去含有穿流液的收集管。以 20,000 × g 离心 3 分钟。
      7. 将柱放入洁净的 1.7 mL 微量离心管中，弃去含有穿流液的收集管。向柱膜中心加入 20 µL 分子级水用于洗脱；盖上管盖，在室温下孵育 5 分钟。
      8. 以 20,000 × g 离心 1 分钟。洗脱的 DNA 可在 4 ˚C 下短期储存，或在 -20 °C 下长期储存。
  3. RNA 消化与纯化
    注意：本 DNA 纯化方案基于材料表中所列 DNA 提取试剂盒的说明书制定。根据数字 PCR（dPCR）条件、试剂以及引物和探针设计的不同，可能需要在进行 dPCR 的 vg/dg 定量前确保 DNA 样品中完全无 RNA。在某些 dPCR 条件下，RNA 污染可能导致不同程度的 vg/dg 值不准确。
    1. 在 0.2 mL PCR 管或 1.7 mL 微量离心管中，向每个提取的 DNA 样品中加入最多 20 µL 样品和 1.5 µL 无 DNase 的 RNase。若 DNA/RNase 混合液体积小于 21.5 µL，加入适量分子级水至终体积为 21.5 µL，并通过反复翻转混匀 25 次。在 37 ˚C 下孵育 30 分钟，每隔 10 分钟翻转混匀一次。
      注意：加入管中的核酸总量应在 175 ng 至 700 ng 之间。若 DNA 样品的体积或核酸含量超出此范围，或 DNA 样品采用不同方法提取，则可能需要调整操作。
    2. 置于冰上 2 分钟。向每个 DNA/RNase 混合液中加入适量分子级水，使终体积达到 100 µL。
      注意：此处推荐的 RNase 可有效消化污染 RNA，而不会对目标 DNA 或下游 PCR 检测产生负面影响。
    3. 按照制造商提供的基因组 DNA 纯化方案进行操作（见材料表）。
      1. 加入 10 µL 第一种 DNA 提取试剂盒缓冲液和 250 µL 第二种 DNA 提取试剂盒缓冲液。脉冲涡旋 10 秒混匀。
      2. 将样品转移至置于 2 mL 收集管中的 DNA 提取柱中，注意勿润湿边缘。以 6,000 × g 离心 1 分钟。
      3. 将柱放入洁净的 2 mL 收集管中，弃去含有穿流液的收集管。向柱中加入 500 µL 第二种 DNA 提取试剂盒缓冲液，注意勿润湿边缘。以 6,000 × g 离心 1 分钟。
      4. 将柱放入洁净的 2 mL 收集管中，弃去含有穿流液的收集管。以 20,000 × g 离心 6 分钟。
      5. 将柱放入洁净的 1.7 mL 微量离心管中，弃去含有穿流液的收集管。向柱膜中心加入 20 µL 分子级水用于洗脱，盖上管盖，在室温下孵育 5 分钟。
      6. 以 20,000 × g 离心 1 分钟。短期储存可置于 4 ˚C，长期储存则置于 -20 °C。
      7. 使用终点 PCR、dPCR 或定量 PCR（qPCR）检测 RNase 消化样品中是否存在 RNA 污染，所用 PCR 引物对应扩增跨越多个外显子（而非仅单个外显子）的 mRNA 区域。
        注意：所选 mRNA 目标基因应在目标组织/细胞类型中高表达，以确保若存在 mRNA 污染可被正确识别。扩增跨越多个外显子的产物可区分由污染 mRNA 和基因组 DNA 产生的条带。应始终设置未经 RNase 消化的 DNA 样品作为 PCR 反应的阳性对照，以确保若存在 mRNA 污染可被检测到。
  4. 数字 PCR（dPCR）
    1. 终点 PCR 检测引物特异性及最佳 PCR 条件（可选）
      1. 设计用于检测载体基因组的 dPCR 引物对和探针，以及用于定量样品中二倍体基因组的鼠源参考基因的 dPCR 引物对和探针。
        注意：扩增子大小应控制在 60 bp 至 150 bp 之间。所选鼠源参考基因应为每个二倍体基因组中拷贝数恒定的基因。本方案中列出的计算基于参考基因（Polr2a），其在每个二倍体基因组中有两个拷贝。
      2. 对于 10 µL 终点 PCR 反应，使用后续 dPCR 反应中将使用的试剂及终浓度配制 PCR 混合液。向 RNase 消化后的模板 DNA 样品（核酸含量范围为 56–223 ng）中加入终浓度为 1× 的 dPCR 预混液（含 DNA 聚合酶和 dNTPs）、每种正向引物 0.8 µM、每种反向引物 0.8 µM、每种探针 0.4 µM，以及 0.025 U/µL 限制性内切酶（限制酶终浓度取决于所用酶种类和品牌）。加入分子级水至终体积为 10 µL。
        注意：PCR 混合液中应至少包含两对引物和两个探针：一对引物和一个探针用于检测载体基因组，另一对引物和一个探针用于检测鼠基因组。
      3. PCR 热循环条件：95 °C 初始激活 2 分钟，随后进行 35–45 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 25 秒，以及 58–62 °C 退火/延伸 1 分钟。
        注意：每个扩增子和引物对的最优退火温度需单独确定。循环数可根据样品中模板 DNA 的量进行调整。
      4. 通过琼脂糖凝胶电泳观察 PCR 产物，判断目标扩增条带是否存在以及是否有非特异性扩增条带。
      5. 确认引物对和循环条件可特异性扩增目标序列后，进入下一步 dPCR 操作。
    2. dPCR 反应
      1. 对于 40 µL dPCR 反应，向终浓度为 1× 的 dPCR 预混液（含 DNA 聚合酶和 dNTPs）、每种正向引物 0.8 µM、每种反向引物 0.8 µM、每种探针 0.4 µM，以及 0.025 U/µL 限制性内切酶（限制酶终浓度取决于所用酶种类和品牌）中加入最多 4 µL RNase 消化后的模板 DNA 样品（核酸含量范围为 50–330 ng）。加入分子级水至终体积为 40 µL。
      2. dPCR 热循环条件：95 °C 初始激活 2 分钟，随后进行 40–50 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 25 秒，以及 58–62 °C 退火/延伸 1 分钟。
        注意：每个扩增子和引物对的最优退火温度需单独确定。循环数可根据样品中模板 DNA 的量进行调整。此处列出的体积、浓度和条件已针对材料表中所列 dPCR 板、试剂和设备进行了优化，以降低潜在 dPCR 抑制剂对反应准确性的影响。
      3. 完成 dPCR 反应并获得载体基因组和鼠参考基因的绝对值后，使用公式（7–8）计算样品中的 vg/dg。
        对于每个二倍体基因组含两个拷贝的参考基因：
        二倍体基因组绝对值（dg）= 绝对拷贝数计算，公式；示意图；基因定量分析结果。    （7）
        vg/dg = 载体与二倍体基因组比值（vg/dg）；表达分析；遗传图谱。    （8）
      4. 检查 dPCR 反应的一维散点图，以确认检测和定量的有效性（图 3A、C）。为确保检测有效，需确认一维散点图满足以下所有标准：存在阳性和阴性分区；阳性和阴性分区之间有清晰分离，以便准确设定阈值；阳性和阴性分区之间（即“雨滴”）无或仅有极少液滴，否则会降低 dPCR 定量的准确性。

结果

7至9周龄的雄性小鼠通过尾静脉侧向注射方式给予AAV，每只小鼠注射剂量为1.5 × 1012 vg，注射体积为150–200 µL。所使用的单链DNA AAV携带由CMV启动子驱动的Cre重组酶转基因。注射的小鼠在Cre报告基因Ai14等位基因上为纯合子。当暴露于Cre重组酶时，含有Ai14等位基因的细胞会表达荧光蛋白tdTomato。由于tdTomato的表达是由Cre介导的基因组重组所引发的，因此表达tdTomato的细胞表明这些细胞要么是直接被AAV转导的细胞，要么是转导细胞的子代细胞。此处展示的数据来自注射了AAV9-CMV-Cre的小鼠，剂量为每只小鼠1.5 × 1012 vg，注射体积为160 µL（相当于5.8–5.9 × 1013 vg/kg）。小鼠在注射后28天被处死，组织按上述方法收集。部分骨骼肌和肝叶经消化处理，并通过FACS收集细胞。部分肝叶立即使用预冷的甲基丁烷冷冻，用于核酸提取。部分骨骼肌和肝叶则进行固定-冷冻处理，以便对荧光tdTomato进行组织学成像。tdTomato在肝脏（图2A）和股四头肌（图2C）中广泛表达，表明AAV9能够广泛到达并转导这两种组织的不同区域。

采用新鲜冷冻肝脏和FACS分选细胞中提取的DNA，通过数字PCR（dPCR）定量病毒基因组拷贝数与二倍体基因组拷贝数的比值（vg/dg）。vg/dg的定量可用于评估注射的一致性以及AAV在分析样本中的转导效率。新鲜冷冻肝脏组织样本和FACS分选细胞的1D液滴散点图用于验证检测的有效性（图3A、C）。散点图显示存在阳性和阴性分区，阳性和阴性分区之间有清晰的分离，可准确确定检测阈值，并且在阳性和阴性分区之间几乎没有或仅有少量液滴，从而避免降低dPCR检测的准确性。满足上述所有标准表明dPCR检测结果有效。通过定量各样本中Polr2a基因的拷贝数来确定小鼠二倍体基因组的数量（每个小鼠二倍体基因组含2个Polr2a基因拷贝），并使用针对Cre重组酶转基因序列的引物/探针来定量病毒基因组（每个病毒基因组含1个转基因拷贝，表1）。对新鲜冷冻肝脏组织样本和FACS分选细胞的vg/dg值进行定量，结果显示其vg/dg值分别为187.7和4.7（图3B、D）。PBS注射小鼠的样本以及不含核酸的非模板对照作为阴性对照使用。

基因编辑装置；PCR工作站；微量移液器；凝胶电泳；DNA分析实验。
图1：静脉注射操作站概览。（A）进行静脉注射所需的工具。图中显示：（1）计时器，（2）小鼠管状固定器，（3）未切割和（4）已切割的塑料固定锥形套，（5）酒精棉片，（6）空的移液器吸头盒（用作抬高小鼠管状固定器的平台），（7）一次性吸水垫，（8）装有温水的15 mL锥形管，（9）15 mL管架，（10）纱布，以及（11）胰岛素注射器。（B）首先将小鼠放入管状固定器中。如果小鼠体型过小，仅靠管状固定器无法有效固定，则插入已切割的固定锥形套，在小鼠周围形成一个固定套筒。确保固定装置不会阻碍小鼠呼吸。将管状固定器置于抬高的平台上，以便将小鼠尾巴浸入温水中。（C）注射前小鼠尾巴的位置及持针角度。向后轻拉尾巴使其伸展，使注射部位完全水平。针头应与尾巴及静脉平行，针尖斜面朝上。请点击此处查看该图的放大版本。

AAV9-CMV-Cre 病毒在肝脏和股四头肌中的基因表达；与 PBS 的荧光显微镜比较。
图 2：静脉注射后荧光报告蛋白的检测。 对携带 Cre 报告基因 Ai14 等位基因的 7 至 9 周龄雄性小鼠，通过静脉注射给予 AAV9-CMV-Cre 病毒（每只小鼠 1.5 × 1012 vg，溶于 160 µL，相当于 5.8–5.9 × 1013 vg/kg）或 PBS。图中显示的是静脉注射 AAV9 递送 Cre 后小鼠（A）肝脏或（C）股四头肌切片的代表性荧光图像。（B）肝脏或（D）股四头肌切片来自注射 PBS 的小鼠，作为阴性对照。组织在静脉注射后 28 天采集，并进行固定冷冻处理。Cre 暴露后，荧光 tdTomato 蛋白在被转导的细胞及其子代细胞中表达。切片厚度为 10 µm，放大倍数为 10×。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

DNA结合分析的流式细胞术结果；分析后的分区样本的散点图和图表。
图3：每二倍体基因组的载体基因组（vg/dg）定量。 对注射了AAV9-CMV-Cre或PBS的小鼠所获取的（A）肝组织或（C）FACS分选细胞样本中，通过dPCR定量载体基因组的1D散点图。散点图显示了dPCR的阳性与阴性分区，以及横跨各样本的检测阈值线。（B,D）在对（B）肝组织或（D）FACS分选细胞样本中的小鼠二倍体基因组和载体基因组进行定量后得到的vg/dg值。本图结果来自一只注射AAV9的小鼠和一只注射PBS的小鼠，每只小鼠均设有dPCR技术重复。误差线表示每个样本的95%置信区间。缩写：NTC = 无模板对照；dPCR = 数字PCR；FACS = 荧光激活细胞分选。 请点击此处查看该图的放大版本。

引物序列
Cre 正向引物CTGACGGTGGGAGAATGTTAAT
Cre 反向引物CATCGCTCGACCAGTTTAGTT
Cre 探针/56-FAM/CGCAGGTGT/ZEN/AGAGAAGGCACTTAGC/3IABkFQ/
Polr2a 正向引物GACTCCTTCACTCACTGTCTTC
Polr2a 反向引物TCTTGCTAGGCAGTCCATTATC
Polr2a 探针/5HEX/ACGAGATGC/ZEN/TGAAAGAGCCAAGGT/3IABkFQ/

表1：用于vg/dg定量的引物和探针序列。Cre 引物和探针用于定量载体基因组。Polr2a 引物和探针用于定量小鼠二倍体基因组。

讨论

基于AAV的疗法因其作为基因治疗载体的高度可塑性，在单基因遗传病治疗中展现出巨大潜力，使得研究人员能够定制AAV以满足不同疾病的各种递送需求4,5,7,9。在临床前小鼠模型中，AAV通常通过静脉注射给药，以评估潜在治疗手段的安全性和有效性16。由于不同注射剂量的AAV可能导致实验结果出现显著差异，因此实验人员必须能够稳定地注入目标AAV剂量，以确保所获得的in vivo数据具有有效性和可重复性28。静脉注射虽广泛应用，但技术难度较高，需要经过长期训练并持续练习，才能建立并维持确保注射成功率的技术水平16,17,18,19。除了准确完成AAV注射外，通常还需采用检测方法评估注射后AAV在靶组织或靶细胞中的生物分布及递送效率29,30。

本方案旨在通过详细描述一种优化的静脉注射操作流程，帮助实验人员对7至9周龄、未麻醉的小鼠成功且稳定地进行腺相关病毒（AAV）给药，从而简化静脉注射的操作。需要特别注意的是，若小鼠体型明显小于或大于同龄野生型小鼠，由于静脉可视性降低或与本方法所用固定装置不匹配，可能会增加操作难度。 已被  先前报道过尾部IV 注射不是 适用于试剂的添加 在小鼠中通过静脉注射 小于6周龄，因体型较小 血管尺寸31尽管可能实现，但对体重小于22.0 g的小鼠进行稳定注射可能存在困难。使用非典型体型小鼠的研究人员可能需要对操作步骤进行相应调整。本方案还概述了多种可用于评估AAV生物分布和转导效率的检测方法。

在执行本方案时，需牢记一些关键要点。注射过程中，若针头未进入静脉，29 G针头会提供更大的阻力。这有助于减少因注射失败导致药液意外注入血管外而造成的损失量。胰岛素注射器的死腔体积小于常规注射器。如果使用与本方案所列不同的注射器和/或针头，则可能需要在步骤1.1.3.3中准备额外的注射液体积，以补偿较大的死腔体积（例如，将预期剂量增加30 µL，而非15 µL）。

若在将AAV剂量吸入注射器时，注射器壁上产生细小的由抽吸引起的气泡，可缓慢继续将药液向上吸入注射器中，以去除大部分微小气泡。应比计划注射体积多吸入至少10–15 µL的AAV。额外加入的体积用于补偿在排出气泡过程中或因注射尝试失败可能导致的液体损耗。（例如，若目标注射体积为150 µL，则应将165 µL的液体吸入注射器中（位于注射器刻度160 µL与170 µL标记的中间位置）。若针头正确置于静脉内，且在成功注射前注射器内液体体积为165 µL，则应持续推注试剂，直至注射器内剩余15 µL液体（位于10 µL与20 µL刻度标记的中间位置），从而确保实际注射量为150 µL（165 µL – 15 µL = 150 µL）。将针尖斜面开口（斜面朝上）与注射器刻度对齐，可在注射过程中准确追踪已注射的体积。

一些实验人员可能更倾向于将小鼠侧放，以便使其一条静脉保持平直，相比让小鼠直立时更易于穿刺。然而，当小鼠侧放时，其尾巴会因个体大小不同而呈现不同倾斜角度，这要求在对不同体型的小鼠进行注射时调整进针角度。这种变化可能对操作成功率的一致性产生不利影响。在初期练习阶段，实验人员可尝试两种不同的固定方式，以确定自己偏好的操作方法。让小鼠保持直立状态可快速、方便地接触两侧尾静脉，当多次注射尝试失败需交替使用两侧静脉时，这种方式可缩短固定时间。

若在靠近尾根部（更接近小鼠身体）的侧静脉注射（尤其适用于体重>30 g的小鼠），由于尾根部的静脉位置略深于远端，应将注射角度从与静脉平行调整为与静脉成5°–10°。

此处列出的RNase消化和RNA污染检测方案已在从新鲜冷冻肝组织中分离的DNA样本上得到验证，这些样本在20 µL体积中含有175-700 ng的核酸。RNase消化方案还测试了从新鲜冷冻肝组织和FACS分选细胞中分离的DNA样本，以确认RNase消化后载体基因组和小鼠基因组的存在。结果通过琼脂糖凝胶电泳对目标扩增子进行终点PCR扩增后可视化。

遵循所述方法可减少掌握静脉注射技术所需的培训和练习时间，并提高注射成功率，从而节约试剂。本方案采用简单且常用的工具，无需使用可能不易获得的先进设备或装置。此外，此处列出的静脉注射步骤可适用于多种需静脉给药的注射物，例如反义寡核苷酸（ASOs），仅需根据具体注射物对注射物制备步骤进行相应调整即可。

披露

作者无任何与本文发表内容相关的披露事项。

致谢

作者谨向美国国立神经疾病与卒中研究所（NINDS）动物护理设施工作人员表示感谢，感谢他们的支持。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）NINDS所内研究部门资助（年度报告编号：1ZIANS003129）。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 µm 注射器滤器MilliporeSLGVM33RS
0.3 mL 胰岛素注射器，配29G针头BD 生物科学324702
1.7 mL 微量离心管  管Crystalgen23-2051
10 mL 注射器BD 生物科学302995
100% 乙醇华纳·格雷厄姆公司201096
10×磷酸盐缓冲液（PBS）康宁46-013-CM用于配制 1x PBS 以进行组织固定
15 mL 一次性离心管康宁430766
15 mL 锥形管架多个来源N/A
190 proof 乙醇华纳·格雷厄姆公司6810-01-113-7320用于配制70%乙醇
1× 无菌 PBSGibco10010023
2 mL 微型离心组织保存管Eppendorf022363344
4% 多聚甲醛（PFA）电子显微镜科学公司157-4
腺相关病毒（AAV）查尔斯河实验室N/A单链DNA（ssDNA）AAV被包装用于递送由CMV启动子驱动的Cre重组酶作为转基因
酒精棉片BD 生物科学326895
珠磨裂解管下一步进展GREENE5
BsuRI（HaeIII）限制性内切酶赛默飞世尔科技ER0151 
子弹头研磨器下一步进展BBX24B
杰克逊实验室007914品系（遗传背景：C57BL/6J）来源的Ai14小鼠N/AN/A携带 Ai14 Cre 报告等位基因的小鼠购自 JAX（目录号：007914）
一次性吸水垫Fisherbrand1420662
解剖镊精细科学工具（F.S.T）11251-35
解剖剪精细科学工具（F.S.T）14085-08
DNA降解试剂（DNAZap）InvitrogenAM9890
DNA提取 RNase AQiagen19101用于核酸提取过程中的RNA消化
用于DNA纯化的无DNase的RNase F. Hoffmann-La Roche11119915001核酸提取后用于RNA消化
dPCR 探针 PCR 试剂盒Qiagen250102
dPCR 软件 Qiagen N/A QIAcuity 软件套件 
高架平台多个来源N/A使用一个空的移液器吸头盒在尾部加温过程中垫高小鼠固定器
荧光显微镜多个来源N/A此处使用的型号：Nikon Eclipse Ti
荧光显微镜软件 多个来源 N/A 此处使用的软件：NIS-Elements 
纱布Covidien9022
加热块EppendorfThermomixer 5350
高速离心机Eppendorf22620689
金属容器Vollrath80125
甲基丁烷J.T. BakerQ223-08
分子生物学级水高质量生物学351-029-131
小鼠管式固定器Braintree ScientificTV-RED-150-STD
Myfuge迷你离心机Benchmark ScientificC1012
聚合酶链式反应热循环仪伯乐生命科学公司1851148型号：C1000 Touch
精密擦拭布Kimberly-Clark Professional7552
蛋白酶KQiagen19131
QIAcuity dPCR 纳米板 26k 24孔Qiagen250001
QIAcuity One dPCR 系统Qiagen911020
Qiagen DNeasy 血液 & 组织试剂盒Qiagen69504用于从组织中提取 DNA
Qiagen QIAamp DNA Micro 试剂盒Qiagen56304用于基因组DNA的纯化，以及从小体积血液中分离DNA；该方案也用于FACS分选细胞的DNA提取
啮齿类动物固定器锥形管Braintree ScientificMDC-200
比例尺Ohaus72212663
泡沫箱多个来源N/A
蔗糖Sigma-AldrichS9378-1kg
表面清洁剂和消毒剂Peroxigard29101 
计时器多个来源N/A
转移镊子精细科学工具（F.S.T）91113-10
涡旋Daigger &安普公司22220A型号：Daigger Vortex Genie 2

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通过侧尾静脉注射在成年小鼠中稳定递送腺相关病毒
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