本研究介绍了一种快速提取RNA并比较转录水平的方法，用于分析缓步动物Hypsibius exemplaris中的基因表达。该高通量方法采用物理裂解，仅需一只缓步动物作为起始材料，即可高效生成适用于定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）的cDNA。
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摘要
摘要
缓步动物Hypsibius exemplaris是一种新兴的模式生物，以其耐受极端环境的能力而闻名。为了探究这种极端耐受性的分子机制和遗传基础，许多研究依赖于RNA测序（RNA-seq），该技术可用于从大规模群体到单个个体的不同样本量研究。随后通常使用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和RNA干扰（RNAi）分别验证RNA-seq结果，并评估候选基因的遗传必要性。此类研究需要一种高效、准确且经济的RNA提取方法，并能通过定量RT-PCR（qRT-PCR）测定转录本的相对表达水平。本文介绍了一种高效的单只缓步动物单管RNA提取方法（STST），该方法不仅能可靠地从单个缓步动物中分离RNA，还可显著减少每次提取所需的时间和成本。该RNA提取方法所获得的cDNA足以用于通过定量PCR（qRT-PCR）扩增和检测多个转录本。本方法通过分析两种热休克调控蛋白——热休克蛋白70 β2（HSP70 β2）和热休克蛋白90α（HSP90α）——编码基因在热处理个体中的动态表达变化加以验证，从而能够利用qRT-PCR评估其相对表达水平。STST方法有效补充了现有的批量及单只缓步动物RNA提取技术，使得通过qRT-PCR快速且低成本地检测单个缓步动物的转录水平成为可能。
引言
缓步动物是一类小型多细胞动物，以其在对大多数其他生命形式致命的极端条件下仍能存活的能力而闻名1。例如，这类动物能够承受几乎比对人类致死剂量高1000倍的电离辐射 2,3,4,5,6,7,8,9,10，能够耐受几乎完全脱水11,12,13,14,15，在无外源添加冷冻保护剂的情况下耐受冻结16,
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方案
图1：从单个缓步动物中提取RNA的单管操作流程。 （A）从单个缓步动物中提取RNA并进行后续cDNA合成的操作流程示意图，包括六次冻融循环。样品后续可用于RT-PCR和qRT-PCR分析。（B）用于去除水分的微移液管拉尖示意图。比例尺：2 mm。（C）在少量水中缓步动物的明场图像（虚线所示）。为成功提取RNA并防止裂解缓冲液被稀释，需将大部分水分去除至图示程度。比例尺：50 μm。（D）使用长镊子将样品浸入液氮中以安全快速进行冻融操作的示意图。部分图像使用BioRender制作。Kirk, M. (2022) BioRender.com/d93s511
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结果
单个缓步动物RNA提取方法的建立与优化
基于Ly等（2015）42报道的RNA提取方案，对STST系统进行了优化，以最大化提取物的产量和质量（图1A）。通过扩增跨越外显子1和2的527 bp区域，对肌动蛋白转录本进行RT-PCR分析（这些引物序列见表1）。使用ImageJ/FIJI软件将预期的肌动蛋白条带光密度量化为荧光强度。所有凝胶中被量化的感兴趣区域面积均相等。
首先，评估了用于破坏缓步动物角质层的机械裂解方法。与先前报道的单个秀丽隐杆线虫（C. elegans）RNA提取方案不同，后者仅需蛋白酶K裂解和热激即可有效裂解动物个体42，而缓步动物的提取至少需要六次冻融循环才能实现稳定且高效的RNA提取（图2A，补充图1）。在每次冻融循环之间，.......
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讨论
本研究提出了一种用于单个缓步动物qRT-PCR的高效RNA提取方法。将STST方法与现有的单个缓步动物RNA提取试剂盒直接比较后发现，STST RNA提取方法获得的肌动蛋白RNA转录本产量高出>200倍，每样本成本降低至一美元以下，且提取时间缩短了30%。为将STST应用于一个相关的生物学问题，我们评估了短期热激反应的表达谱。结果发现，正如预期，HSP70β2和HSP90α的转录本在热处理1小时后均显著上调。
尽管STST方案相较于先前的方法已有显著改进，但仍存在若干局限性，为后续优化与评估提供了空间。首先，我们尚未评估STST检测极低表达水平转录本的能力。对于低丰度转录本，可能需要针对模板浓度进行优化调试。其次，虽然STST方法的成功率约为80%（定义为获得肌动蛋白Ct值小于31的提取物所占百分比），但有时仍无法获得足量可用的cDNA，这可能是由于RNase活性或裂解不充分所致。优化对RNase活性的抑制可能有助于提高成功率。最后，该方法在RNA质量方面仍有提升空间。正如本研究所示，可采取措施规避RNA降解及随后片段化的影响，并减轻其对qRT-PCR结.......
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披露
作者声明无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢以下资助：NIH Ruth Kirschstein 博士后奖学金 #5F32AG081056-02、Errett Fisher 博士后奖学金（资助 Molly J. Kirk 博士）、Crowe 家族奖学金（资助 Chaoming Xu）、加州大学圣塔芭芭拉分校学术参议院资助，以及 NIH 资助项目 #R01GM143771 和 #2R01HD081266，这些资助支持了本研究工作。作者还感谢加州纳米系统研究所内的生物纳米结构实验室所提供的技术支持，该实验室由加州大学圣塔芭芭拉分校以及加州大学校长办公室资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 µL 优质低吸附屏障吸头，盒装，无菌 | Genesee Scientific | 23-401 | 简称无菌滤芯P 10移液器 吸头 |
| 1000 µL 优质低吸附移液吸头，盒装，无菌 | Genesee Scientific | 23-165RS | 简称无菌滤芯P 1000移液器 吸头 |
| 200 µL 优质低吸附屏障吸头，盒装，无菌 | Genesee Scientific | 23-412 | 简称无菌滤芯P 200移液器 吸头 |
| 4星直头强中等尖头镊子 | Excelta | 00-SA-DC | 简称长镊子 |
| 96孔PCR板架带盖，混装，每单位5个板架 | Genesee Scientific | 27-202A | 简称PCR板架 |
| Andwin Scientific 3M无铅高压灭菌指示胶带 1" | Thermo Fisher Scientific | NC0802040 | 简称高压灭菌胶带 |
| 高压灭菌胶带 | Thermo Fisher Scientific | AB1170 | 简称PCR板封膜 |
| Benchling v8 | Benchling | N/A | 简称Benchling |
| BioRad硬壳96孔PCR板 | BioRad | HSS9641 | 简称PCR板 |
| BULWARK FR实验服： | Grainger | 26CF64 | 简称实验服 |
| C1000 Touch Bio-rad热循环仪 | BioRad | 1851148 | 简称热循环仪 |
| 带CFX光学模块的C1000 Touch Bio-rad热循环仪 | BioRad | 1845097 | 简称qPCR热循环仪 |
| Chloroccoccum hypnosporum. | Carolina | 152091 | 简称藻类 |
| Corning PYREX可重复使用培养基储存瓶 | Thermo Fisher Scientific | 06-414-1E | 简称2 L耐高压玻璃瓶 |
| Daigger & Company Vortex-Genie 2实验室混匀器 | Thermo Fisher Scientific | 3030A | 简称涡旋振荡器 |
| Direct-zol Micro Prep | Zymo Research | R2060 | 简称RNA提取试剂盒 |
| Dumont 5生物镊子 | Fine Science Tools | 11254-20 | 简称精细镊子 |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | 简称EDTA |
| FIJI v 2.14.0/1.54f | ImageJ, | N/A | 简称FIJI/ImageJ |
| 移液器拉制仪用灯丝 | Tritech Research | PC-10H | 简称灯丝 |
| Fisherbrand经济型防冲击护目镜 | Fisher Scientific | 19-181-501 | 简称防溅护目镜 |
| 玻璃微量移液管外径1 mm，内径0.58 mm，长度10 cm | TriTech Research | GD-1 | 简称玻璃微量移液管 |
| Hypsibius exemplaris Z151品系 | Carolina | 133960 | 简称缓步动物 或H. exemplaris |
| 1 L液氮杜瓦瓶 | Agar Scientific | AGB7475 | 简称耐低温容器 |
| Maxima H Minus第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K1651 | 简称cDNA合成预混液 |
| Narishige双阶段玻璃微量移液管拉制仪 | Tritech Research | PC-10 | 简称微量移液管拉制仪 |
| 腈手套 | Fisher Scientific | 17-000-314 | 简称腈手套 |
| 培养皿，聚苯乙烯，35/10 mm，带通气孔 | Grenier | 627102 | 简称35 mm培养皿 |
| PIPETMAN P10，1–10 µL，金属弹射器 | Gilson | F144055M | 简称P 10移液器 |
| PIPETMAN P1000，100–1000 µL，金属弹射器 | Gilson | F144059M | 简称P 1000移液器 |
| PIPETMAN P200，20–200 µL，金属弹射器 | Gilson | F144058M | 简称P 200移液器 |
| Pound This四色油泥 | American Science Surplus | 96517P001 | 简称油泥 |
| Prism v10.0 | GraphPad | N/A | 简称Prism |
| 无RNase，8联管0.2 mL PCR管带盖 | Invitrogen | AM12230 | 简称无菌PCR管 |
| RNasin核糖核酸酶抑制剂 | Promega | N2111 | 简称RNase抑制剂 |
| 泉水 | Nestle Pure Life | 44221229 | 简称泉水 |
| SsoAdvanced通用SYBR Green预混液 | BIO RAD | 1725271 | 简称指示染料预混液 |
| 带光学系统和照明的体视显微镜系统 | TriTech Research | SMT1 | 简称解剖显微镜 |
| Supertek Scientific Tirrill本生灯 | Thermo Fisher Scientific | S09572B | 简称本生灯 |
| 台式离心机 | Qualitron | DW-41-115-NEW | 简称台式离心机 |
| Tempshield 低温手套 | Fisher Scientific | 11-394-305 | 简称低温手套 |
| Thermo Scientific Nunc培养皿 | Thermo Fisher Scientific | 08-757-099 | 简称100 mm培养皿 |
| Tris碱 | Fisher Scientific | T395-500 | 简称Tris或Tris碱 |
| Triton X-100 | Fluka | 93443 | 简称去污剂1 |
| TWEEN 20 | Sigma aldrich | P1379-500 | 简称去污剂2 |
| 水 - PCR/RT-PCR认证，无核酸酶 | Growcells | PCPW-0500 | 简称无菌无核酸酶水 |
参考文献
- Møbjerg, N., Neves, R. C. New insights into survival strategies of tardigrades. Comp Biochem Physiol Part A Mol Integr Physiol. 254, 110890(2021).
- Jönsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer. ....
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重印与许可
