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方法文章

单动物单管RNA提取法结合qRT-PCR比较缓步动物Hypsibius exemplaris中的相对转录水平

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DOI：

10.3791/66935

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2025年1月3日

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Cellular and Developmental Biology, University of California, Santa Barbara, 2Neuroscience Research Institute, University of California, Santa Barbara

本文内容

摘要

本研究介绍了一种快速提取RNA并比较转录水平的方法，用于分析缓步动物Hypsibius exemplaris中的基因表达。该高通量方法采用物理裂解，仅需一只缓步动物作为起始材料，即可高效生成适用于定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）的cDNA。

摘要

缓步动物Hypsibius exemplaris是一种新兴的模式生物，以其耐受极端环境的能力而闻名。为了探究这种极端耐受性的分子机制和遗传基础，许多研究依赖于RNA测序（RNA-seq），该技术可用于从大规模群体到单个个体的不同样本量研究。随后通常使用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和RNA干扰（RNAi）分别验证RNA-seq结果，并评估候选基因的遗传必要性。此类研究需要一种高效、准确且经济的RNA提取方法，并能通过定量RT-PCR（qRT-PCR）测定转录本的相对表达水平。本文介绍了一种高效的单只缓步动物单管RNA提取方法（STST），该方法不仅能可靠地从单个缓步动物中分离RNA，还可显著减少每次提取所需的时间和成本。该RNA提取方法所获得的cDNA足以用于通过定量PCR（qRT-PCR）扩增和检测多个转录本。本方法通过分析两种热休克调控蛋白——热休克蛋白70 β2（HSP70 β2）和热休克蛋白90α（HSP90α）——编码基因在热处理个体中的动态表达变化加以验证，从而能够利用qRT-PCR评估其相对表达水平。STST方法有效补充了现有的批量及单只缓步动物RNA提取技术，使得通过qRT-PCR快速且低成本地检测单个缓步动物的转录水平成为可能。

引言

缓步动物是一类小型多细胞动物，以其在对大多数其他生命形式致命的极端条件下仍能存活的能力而闻名1。例如，这类动物能够承受几乎比对人类致死剂量高1000倍的电离辐射 2,3,4,5,6,7,8,9,10，能够耐受几乎完全脱水11,12,13,14,15，在无外源添加冷冻保护剂的情况下耐受冻结16,17,18，甚至在脱水状态下耐受太空的真空环境19,20。由于其在极端环境中独特的生存能力，这类动物已成为研究复杂多细胞生物耐受极端环境机制的基础模型1,21,22,23。

直到最近，对这些非凡动物进行稳定的遗传操作（包括转基因和生殖系基因修饰）仍然难以实现24,25。因此，目前揭示极端耐受性分子机制的大多数实验均通过RNA测序进行转录谱分析。已有大量有价值且信息丰富的RNA测序数据集，涵盖了缓步动物在多种极端条件下的响应，包括辐射8,9,26,27,28、热应激29、冷冻应激12以及干燥脱水27,30,31,32,33。其中一些研究采用了总RNA提取与纯化方法，增进了我们对极端耐受性的分子理解。然而，从大量个体中提取总RNA会阻碍对基因表达个体间差异的分析，从而错失更精细数据集可能提供的丰富信息。尤为重要的是，这些研究通常分析的是异质性动物群体，其中既包括能够耐受环境胁迫的个体，也包括未能存活的个体。因此，这类研究的结果往往因对多种甚至差异极大的应答状态进行平均化处理而受到干扰。为解决这一问题，Arakawa 等人于2016年34开发了一种精巧的低输入量RNA-seq流程，该流程采用RNA提取试剂盒，并结合线性PCR扩增步骤，可使用单个34,35,36或 多个30,37,38动物作为起始材料。这些研究为我们理解缓步动物的极端耐受性奠定了基础22。有趣的是，该方案还已被应用于以七只动物为起始材料的qRT-PCR分析24。

在大多数模式生物中，通过 RNA-seq 鉴定出潜在靶基因后，通常会进一步进行 qRT-PCR，以验证 RNA-seq 所发现的转录水平变化，并高分辨率地评估候选基因的表达动态变化过程。为了验证所鉴定基因的功能，此类研究常继之以 RNAi 介导的分子靶点敲低实验。39,40 极端耐受能力的分析12,41每个RNAi敲降的效率通常通过qRT-PCR检测转录本丰度的下降来直接验证。然而，在缓步动物中，RNAi是一个劳动密集型过程，因为每条dsRNA必须通过个体的显微注射手动递送。39,40由于该策略通量较低，因此开发一种适用于从单个缓步动物个体进行qRT-PCR的快速、低成本RNA提取方法，将对缓步动物研究具有重要价值。尽管已有方法可用于从单个缓步动物中提取RNA，但这些方案尚未将其提取过程与qRT-PCR相结合，而是依赖基于光密度的检测方法12,40,41. 鉴于这些挑战，我们致力于开发一种能够从单个样本中稳定提取出适用于qRT-PCR的足量且高质量RNA的实验方案 H. exemplaris.

该方法改编自为秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）开发的单个动物RNA提取方案42，并针对H. exemplaris进行了优化。该提取方法包含六次快速冻融步骤，通过物理方式破坏角质层，从而实现RNA提取及后续的cDNA合成。与Boothby 2018年描述的批量RNA提取方法相比43，STST方法将提取时间缩短了24倍以上；与Arakawa等人2016年描述的单个缓步动物RNA提取试剂盒相比34，时间缩短了30%。此外，与RNA提取试剂盒制备过程相比，样本与实验人员的操作交互次数从5次减少至仅1次，从而降低了外源性核糖核酸酶污染的风险。在检测高表达基因时，STST方法可从单个缓步动物中获得足够的cDNA，用于进行25次定量RT-PCR反应，每次反应仅需总cDNA体积（25 μL）中的1 μL。然而，对于低丰度转录本，模板浓度需通过实验经验确定。

通过研究短时间热激（35°C下持续20分钟）条件下编码热休克蛋白90α（HSP90α）和热休克蛋白70β2（HSP70β2）的基因差异表达，评估了STST方法在分析基因表达动态变化方面的有效性。在大多数真核生物中，HSP70β2和HSP90α在短时间热激暴露（20分钟）后会迅速上调42。在H. exemplaris中的分析显示，从单个经热处理的缓步动物提取的HSP70β2和 HSP90α编码RNA在短时间热暴露后，其表达量均呈现统计学上显著增加。这些结果表明，STST方案可用于随时间分析个体动物中基因表达的动态变化。

STST提取方法可通过实现快速且低成本的RNA提取，并随后通过qRT-PCR比较转录水平，从而作为RNA-seq等现有实验方法的有效补充。该方法还将有助于比仅使用光密度测定更定量地评估人工注射个体中RNA干扰的效率和渗透性。最后，由于其他缓步动物物种具有相似的角质层结构和物理特性，该方法很可能也适用于分析其他缓步动物物种的基因表达44。

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方案

缓步动物cDNA合成过程：冻融循环、RT-PCR分析、移液装置示意图。
图1：从单个缓步动物中提取RNA的单管操作流程。 （A）从单个缓步动物中提取RNA并进行后续cDNA合成的操作流程示意图，包括六次冻融循环。样品后续可用于RT-PCR和qRT-PCR分析。（B）用于去除水分的微移液管拉尖示意图。比例尺：2 mm。（C）在少量水中缓步动物的明场图像（虚线所示）。为成功提取RNA并防止裂解缓冲液被稀释，需将大部分水分去除至图示程度。比例尺：50 μm。（D）使用长镊子将样品浸入液氮中以安全快速进行冻融操作的示意图。部分图像使用BioRender制作。Kirk, M. (2022) BioRender.com/d93s511 请点击此处查看该图的放大版本。

注意：图1A 展示了该实验流程的示意图。有关缓步动物和藻类培养的详细步骤，请参考已发表的文献45,46,47。

1. 矿泉水的灭菌

  1. 从5加仑的水桶中倒入2升泉水至一个2升耐高压玻璃瓶中（具体信息参见材料表）。
  2. 将瓶盖盖在耐高压瓶上，并用少量高压灭菌胶带封口。不要拧紧瓶盖，仅将其放置在瓶口上方。
  3. 在湿循环模式下对泉水进行高压灭菌，不进行干燥步骤，持续50分钟。
  4. 让水冷却至室温（RT），然后拧紧瓶盖，并在室温下储存。

2. 玻璃微电极拉制（使用微电极拉制仪）

  1. 将一根玻璃微量移液管（外径：1 mm，内径：0.58 mm，长度：10 cm）固定在微量移液管拉制仪上。避免与加热丝接触，以免改变移液管形状并损坏加热丝。
    1. 针对每根加热丝和不同的拉制仪，需通过实验经验确定移液管的拉制参数。但作为优化的起始参考，可采用 78 °C 的加热温度，并以 182.2 g 的拉力进行单步拉制。
  2. 使加热丝升温，利用重力将玻璃微量移液管拉成两根具有尖锐尖端的玻璃微量移液管（图 1B）。
  3. 将制备好的玻璃微量移液管存放于带盖的 100 mm 培养皿中，并用石蜡或黏土固定，以防止尖端折断。

3. 玻璃微电极拉制（无微电极拉制仪）

  1. 将本生灯或其他可控火焰源调至低档并点燃。
  2. 用双手各持一根玻璃微量移液管的一端。
  3. 将玻璃微量移液管的中部置于火焰上加热，直至玻璃开始熔化。随后迅速将两端拉开，形成两个非常精细且尖锐的尖端。
  4. 用一对无菌精细镊子轻轻折断尖端以使其开口。
  5. 将这些拉制好的玻璃微量移液管存放于一个密闭的 100 mm 培养皿中，并使用石蜡或黏土固定，以防止尖端折断。

4. RNA 提取

  1. 在耐低温容器中取 0.5 L 液氮。
    注意：液氮具有极低温性质，接触皮肤或眼睛可能造成冻伤。操作时应穿戴防护服、防溅护目镜、腈手套、低温手套、实验服及包趾鞋。运输液氮前须确认容器适用于液氮。此步骤也可使用乙醇-干冰浴替代。
  2. 配制 cDNA 合成主混合液：将 1 µL 随机六聚体引物、2 µL DNase、4 µL 5x RT Buffer、1 µL 酶混合液、1 µL H2O 和 1 µL 10 mM dNTPs 混合，总体积为 10 µL。将该溶液置于冰上保存。
  3. 配制缓步动物裂解缓冲液（5 mM Tris (pH = 8)、0.5% (v/v) 去垢剂 1、0.5% (v/v) 去垢剂 2、0.25 mM EDTA 溶于无核酸酶的无菌水中）。
    注意：该溶液可在室温下存放 6 个月。但需保持无菌状态，并避免接触可能含有 RNA 酶的污染源。
  4. 根据提取需要，分装足够量的裂解缓冲液（每只缓步动物 2 μL）。
  5. 向缓步动物裂解缓冲液中加入 RNA 酶抑制剂，使其终浓度为 4 U/μL。
  6. 涡旋混匀后，在室温下使用台式离心机以 2000 × g 离心 5 秒，随后将溶液置于冰上保存。
  7. 使用无菌滤芯吸头 P1000 移液器从培养物中取出实验所需数量的缓步动物，并将其转移至无菌 35 mm 培养皿中。
    注意：可按需处理任意数量的缓步动物。通常每个实验条件处理三只缓步动物用于提取。
  8. 使用 1 mL 高压灭菌的无菌泉水和无菌滤芯吸头 P1000 移液器对缓步动物清洗三次。缓慢反复吹打有助于去除藻类污染物。
  9. 在 25x 至 50x 放大倍数的解剖显微镜下，使用无菌滤芯吸头 P10 移液器将一只已清洗的缓步动物转移至新的无菌 35 mm 培养皿中。
  10. 使用无菌滤芯吸头 P200 移液器，用 100 μL 无菌无核酸酶水清洗单个缓步动物。
    注意：此清洗步骤用于进一步去除包括核糖核酸酶在内的污染物。
  11. 使用无菌滤芯吸头 P10 移液器，将已清洗的缓步动物连同 1–2 μL 无菌无核酸酶水转移至洁净无菌的 PCR 管底部，注意确保缓步动物未粘附在吸头侧壁上。
  12. 在 25x 放大倍数的解剖显微镜下观察缓步动物。
  13. 为便于去除水分，将拉制的玻璃毛细移液管尖端在管外轻轻折断。确保其孔径足够大以吸取水分，但不足以吸入缓步动物。
  14. 利用拉制玻璃毛细移液管的毛细作用，吸除水分，直至缓步动物周围仅残留一个直径约为两个缓步动物体长的小水泡。
  15. 通过解剖显微镜监测去水过程，确保水位适当且缓步动物保持湿润。
    注意：图 1C 展示了应去除的水量示例。此为关键步骤。残留的小水泡可防止缓步动物干燥，但应尽可能去除多余水分，以避免稀释裂解缓冲液。有关残留水量的示例，请参见 图 1C。
  16. 去水后立即向管底加入 2 μL 缓步动物裂解缓冲液，短暂涡旋混匀，并在台式离心机中室温下以 2000 × g 离心 5 秒。
  17. 立即将含有缓步动物的样品放入 PCR 管架中，并确保样品被管架牢固固定。
  18. 使用一对长柄粗齿镊夹住管架，轻轻将装有样品的管架浸入液氮中，直至完全冻结（图 1D）。
  19. 将管架从液氮中取出，立即置于冰上，使其融化（约需 45 秒至 1 分钟）。每隔 15 秒将样品从冰上取出目视检查一次。当样品变得明显透明时，进入下一步。
  20. 重复步骤 4.18–4.19 五次。总共需进行六次冻融循环，以实现最大程度的裂解与提取（图 2A、B）。
  21. 完成冻融后，将样品置于冰上，并立即进入下一步。此时切勿将样品冷冻保存，否则会降低可用于 cDNA 合成的 RNA 量。

5. cDNA 合成

  1. 向含有缓步动物裂解液的PCR管中加入2 μL cDNA合成预混液。轻轻弹动管壁混匀，然后使用台式离心机在室温下以2000 × g 离心5秒，随后将样品放回冰上。
  2. 将样品放入热循环仪中，先在25 °C孵育10分钟以退火引物，再在55 °C进行逆转录反应30分钟，最后在85 °C加热5分钟以灭活酶。
  3. 孵育结束后，立即将PCR管置于冰上，并加入21 μL无菌无核酸酶水，将样品稀释至总体积25 μL。对于低拷贝数的转录本，可根据实验经验调整此稀释步骤。

6. qPCR

  1. 使用从较大量缓步动物中提取的总RNA确定引物对的退火温度，例如，采用Boothby, 201843中介绍的批量提取方法。
  2. 运行PCR温度梯度以确定最佳退火温度，然后进行qRT-PCR（本方案中使用的所有PCR设置，请参见表1和表2）。
  3. 将一管指示染料预混液置于冰上避光融化。将96孔qPCR板置于冰上，在所需数量的孔中分别加入5 μL预混液、2 μL水、各1 μL引物（10 μM）以及1 μL cDNA产物。
  4. 用PCR板封膜密封反应板，并使用适用于该引物对的退火温度运行qRT-PCR（本文中使用的所有qRT-PCR设置，请参见表3）。

7. 定量分析与结果解读

  1. 将结果与一个或多个对照管家基因进行定量比较，这些管家基因的表达量在所施加的条件下应保持恒定。本研究中使用了肌动蛋白基因（actin gene）。
  2. 获取并比较每个孔的Ct值（循环阈值）与对照管家基因反应的Ct值。使用以下公式计算基因表达的变化倍数：
    qPCR分析公式：ΔCt = Ct(目标基因) - Ct(管家基因)，公式对比。
    比较基因表达分析的ΔΔCt方法公式，显示ΔCt(样品)−ΔCt(对照)。
    基因表达倍数变化公式，2^(-ΔΔCt)，用于分析基因调控；公式。
    注：每个转录本及缓步动物的基因表达倍数以2-(ΔΔCt)48的形式作图表示。
  3. 为根据Ct值粗略估算转录本数量，使用以下公式：
    指数衰减公式 N=10×2^(35-ct)，数学表达式。
    其中N为转录本数量，2为假设的PCR扩增效率，即每轮PCR循环荧光信号增加的倍数48。

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结果

单个缓步动物RNA提取方法的建立与优化
基于Ly等（2015）42报道的RNA提取方案，对STST系统进行了优化，以最大化提取物的产量和质量（图1A）。通过扩增跨越外显子1和2的527 bp区域，对肌动蛋白转录本进行RT-PCR分析（这些引物序列见表1）。使用ImageJ/FIJI软件将预期的肌动蛋白条带光密度量化为荧光强度。所有凝胶中被量化的感兴趣区域面积均相等。

首先，评估了用于破坏缓步动物角质层的机械裂解方法。与先前报道的单个秀丽隐杆线虫（C. elegans）RNA提取方案不同，后者仅需蛋白酶K裂解和热激即可有效裂解动物个体42，而缓步动物的提取至少需要六次冻融循环才能实现稳定且高效的RNA提取（图2A，补充图1）。在每次冻融循环之间，...

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讨论

本研究提出了一种用于单个缓步动物qRT-PCR的高效RNA提取方法。将STST方法与现有的单个缓步动物RNA提取试剂盒直接比较后发现，STST RNA提取方法获得的肌动蛋白RNA转录本产量高出>200倍，每样本成本降低至一美元以下，且提取时间缩短了30%。为将STST应用于一个相关的生物学问题，我们评估了短期热激反应的表达谱。结果发现，正如预期，HSP70β2和HSP90α的转录本在热处理1小时后均显著上调。

尽管STST方案相较于先前的方法已有显著改进，但仍存在若干局限性，为后续优化与评估提供了空间。首先，我们尚未评估STST检测极低表达水平转录本的能力。对于低丰度转录本，可能需要针对模板浓度进行优化调试。其次，虽然STST方法的成功率约为80%（定义为获得肌动蛋白Ct值小于31的提取物所占百分比），但有时仍无法获得足量可用的cDNA，这可能是由于RNase活性或裂解不充分所致。优化对RNase活性的抑制可能有助于提高成功率。最后，该方法在RNA质量方面仍有提升空间。正如本研究所示，可采取措施规避RNA降解及随后片段化的影响，并减轻其对qRT-PCR结...

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披露

作者声明无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢以下资助：NIH Ruth Kirschstein 博士后奖学金 #5F32AG081056-02、Errett Fisher 博士后奖学金（资助 Molly J. Kirk 博士）、Crowe 家族奖学金（资助 Chaoming Xu）、加州大学圣塔芭芭拉分校学术参议院资助，以及 NIH 资助项目 #R01GM143771 和 #2R01HD081266，这些资助支持了本研究工作。作者还感谢加州纳米系统研究所内的生物纳米结构实验室所提供的技术支持，该实验室由加州大学圣塔芭芭拉分校以及加州大学校长办公室资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 µL 优质低吸附屏障吸头，盒装，无菌Genesee Scientific23-401简称无菌滤芯P 10移液器 吸头
1000 µL  优质低吸附移液吸头，盒装，无菌Genesee Scientific23-165RS简称无菌滤芯P 1000移液器 吸头
200 µL  优质低吸附屏障吸头，盒装，无菌Genesee Scientific23-412简称无菌滤芯P 200移液器 吸头
4星直头强中等尖头镊子 Excelta 00-SA-DC简称长镊子
96孔PCR板架带盖，混装，每单位5个板架Genesee Scientific27-202A简称PCR板架
Andwin Scientific 3M无铅高压灭菌指示胶带 1"Thermo Fisher Scientific NC0802040简称高压灭菌胶带 
高压灭菌胶带Thermo Fisher ScientificAB1170简称PCR板封膜
Benchling v8BenchlingN/A简称Benchling 
BioRad硬壳96孔PCR板BioRad HSS9641简称PCR板 
BULWARK FR实验服： Grainger 26CF64简称实验服
C1000 Touch Bio-rad热循环仪 BioRad1851148简称热循环仪 
带CFX光学模块的C1000 Touch Bio-rad热循环仪 BioRad1845097简称qPCR热循环仪 
Chloroccoccum hypnosporum.  Carolina152091简称藻类
Corning PYREX可重复使用培养基储存瓶Thermo Fisher Scientific06-414-1E简称2 L耐高压玻璃瓶
Daigger & Company Vortex-Genie 2实验室混匀器 Thermo Fisher Scientific 3030A简称涡旋振荡器 
Direct-zol Micro Prep Zymo Research R2060简称RNA提取试剂盒 
Dumont 5生物镊子Fine Science Tools 11254-20简称精细镊子
EDTA Fisher ScientificS311-500 简称EDTA 
FIJI v 2.14.0/1.54f ImageJ,N/A简称FIJI/ImageJ
移液器拉制仪用灯丝 Tritech ResearchPC-10H简称灯丝
Fisherbrand经济型防冲击护目镜Fisher Scientific19-181-501简称防溅护目镜 
玻璃微量移液管外径1 mm，内径0.58 mm，长度10 cmTriTech ResearchGD-1 简称玻璃微量移液管
Hypsibius exemplaris Z151品系 Carolina133960简称缓步动物 或H. exemplaris 
1 L液氮杜瓦瓶Agar Scientific AGB7475简称耐低温容器 
Maxima H Minus第一链cDNA合成试剂盒 Thermo Fisher ScientificK1651简称cDNA合成预混液 
Narishige双阶段玻璃微量移液管拉制仪 Tritech Research PC-10简称微量移液管拉制仪 
腈手套Fisher Scientific17-000-314简称腈手套 
培养皿，聚苯乙烯，35/10 mm，带通气孔Grenier627102简称35 mm培养皿 
PIPETMAN P10，1–10 µL，金属弹射器GilsonF144055M简称P 10移液器
PIPETMAN P1000，100–1000 µL，金属弹射器GilsonF144059M简称P 1000移液器
PIPETMAN P200，20–200 µL，金属弹射器Gilson F144058M简称P 200移液器
Pound This四色油泥 American Science Surplus 96517P001简称油泥 
Prism v10.0 GraphPadN/A简称Prism 
无RNase，8联管0.2 mL PCR管带盖 InvitrogenAM12230简称无菌PCR管
RNasin核糖核酸酶抑制剂Promega N2111简称RNase抑制剂 
泉水 Nestle Pure Life44221229简称泉水
SsoAdvanced通用SYBR Green预混液BIO RAD1725271简称指示染料预混液 
带光学系统和照明的体视显微镜系统 TriTech ResearchSMT1简称解剖显微镜
Supertek Scientific Tirrill本生灯Thermo Fisher ScientificS09572B简称本生灯 
台式离心机Qualitron DW-41-115-NEW简称台式离心机 
Tempshield 低温手套Fisher Scientific11-394-305简称低温手套 
Thermo Scientific Nunc培养皿Thermo Fisher Scientific08-757-099简称100 mm培养皿 
Tris碱Fisher ScientificT395-500 简称Tris或Tris碱 
Triton X-100Fluka 93443简称去污剂1 
TWEEN 20Sigma aldrichP1379-500 简称去污剂2
水 - PCR/RT-PCR认证，无核酸酶GrowcellsPCPW-0500简称无菌无核酸酶水

参考文献

  1. Møbjerg, N., Neves, R. C. New insights into survival strategies of tardigrades. Comp Biochem Physiol Part A Mol Integr Physiol. 254, 110890(2021).
  2. Jönsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer. Int J Radiat Biol. 81 (9), 649-656 (2005).
  3. Horikawa, D. D., et al. Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum. Int J Radiat Biol. 82 (12), 843-848 (2006).
  4. Bruckbauer, S. T., Cox, M. M. Experimental evolution of extremophile resistance to ionizing radiation. Trends Genet. 37 (9), 830-845 (2021).
  5. Jönsson, K. I., Hygum, T. L., Andersen, K. N., Clausen, L. K. B., Møbjerg, N. Tolerance to gamma radiation in the marine heterotardigrade, Echiniscoides sigismundi. PLoS One. 11 (12), e0168884(2016).
  6. Jönsson, K. I. Radiation tolerance in tardigrades: Current knowledge and potential applications in medicine. Cancers (Basel). 11 (9), 1333(2019).
  7. Yoshida, Y., et al. RNA sequencing data for gamma radiation response in the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus. Data Brief. 36, 107111(2021).
  8. Clark-Hachtel, C. M., et al. The tardigrade Hypsibius exemplaris dramatically upregulates DNA repair pathway genes in response to ionizing radiation. Curr Biol. 34 (9), 1819-1830.e6 (2024).
  9. Anoud, M., et al. Comparative transcriptomics reveal a novel tardigrade specific DNA binding protein induced in response to ionizing radiation. Elife. 13, RP92621(2024).
  10. Jönsson, K. I., Schill, R. O. Induction of Hsp70 by desiccation, ionising radiation and heat-shock in the eutardigrade Richtersius coronifer. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 146 (4), 456-460 (2007).
  11. Boothby, T. C. Desiccation of Hypsibius exemplaris. Cold Spring Harb Protoc. 2018 (11), 871-873 (2018).
  12. Boothby, T. C., et al. Tardigrades use intrinsically disordered proteins to survive desiccation. Mol Cell. 65 (6), 975-984.e5 (2017).
  13. Horikawa, D. D., Higashi, S. Desiccation tolerance of the tardigrade Milnesium tardigradum collected in Sapporo, Japan, and Bogor, Indonesia. Zoolog Sci. 21 (8), 813-816 (2004).
  14. Halberg, K. A., Jørgensen, A., Møbjerg, N. Desiccation tolerance in the tardigrade Richtersius coronifer relies on muscle mediated structural reorganization. PLoS One. 8 (12), e3330(2013).
  15. Sørensen-Hygum, T. L., Stuart, R. M., Jørgensen, A., Møbjerg, N. Modelling extreme desiccation tolerance in a marine tardigrade. Sci Rep. 8 (1), 11495(2018).
  16. Lyons, A. M., Roberts, K. T., Williams, C. M. Survival of tardigrades (Hypsibius exemplaris) to subzero temperatures depends on exposure intensity, duration, and ice-nucleation - as shown by large-scale mortality dye-based assays. bioRxiv. , (2024).
  17. Møbjerg, A., et al. Extreme freeze-tolerance in cryophilic tardigrades relies on controlled ice formation but does not involve significant change in transcription. Comp Biochem Physiol Part A Mol Integr Physiol. 271, 111245(2022).
  18. Tsujimoto, M., Imura, S., Kanda, H. Recovery and reproduction of an Antarctic tardigrade retrieved from a moss sample frozen for over 30 years. Cryobiology. 72 (1), 78-81 (2016).
  19. Jönsson, K. I. Tardigrades as a potential model organism in space research. Astrobiology. 7 (5), 757-766 (2007).
  20. Jönsson, K. I., Rabbow, E., Schill, R. O., Harms-Ringdahl, M., Rettberg, P. Tardigrades survive exposure to space in low Earth orbit. Curr Biol. 18 (17), R729-R731 (2008).
  21. Kasianchuk, N., Rzymski, P., Kaczmarek, Ł The biomedical potential of tardigrade proteins: A review. Biomed Pharmacother. 158, 113983(2023).
  22. Arakawa, K. Examples of extreme survival: Tardigrade genomics and molecular anhydrobiology. Annu Rev Anim Biosci. 10 (1), 519-542 (2022).
  23. Hvidepil, L. K. B., Møbjerg, N. New insights into osmobiosis and chemobiosis in tardigrades. Front Physiol. 14, 1274522(2023).
  24. Tanaka, S., Aoki, K., Arakawa, K. In vivo expression vector derived from anhydrobiotic tardigrade genome enables live imaging in Eutardigrada. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (5), e2216739120(2023).
  25. Kondo, K., Tanaka, A., Kunieda, T. Single-step generation of homozygous knockout/knock-in individuals in an extremotolerant parthenogenetic tardigrade using DIPA-CRISPR. PloS Genet. 20 (6), e1011298(2024).
  26. Yoshida, Y., Hirayama, A., Arakawa, K. Transcriptome analysis of the tardigrade Hypsibius exemplaris exposed to the DNA-damaging agent bleomycin. bioRxiv. , (2024).
  27. Yoshida, Y., et al. Time-series transcriptomic screening of factors contributing to the cross-tolerance to UV radiation and anhydrobiosis in tardigrades. BMC Genomics. 23 (1), 405(2022).
  28. Yoshida, Y., et al. RNA sequencing data for gamma radiation response in the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus. Data Brief. 36, 107111(2021).
  29. Neves, R. C., et al. Differential expression profiling of heat stressed tardigrades reveals major shift in the transcriptome. Comp Biochem Physiol Part A Mol Integr Physiol. 267, 111143(2022).
  30. Yoshida, Y., et al. Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus. PLoS Biol. 15 (7), e2002266(2017).
  31. Wang, C., Grohme, M. A., Mali, B., Schill, R. O., Frohme, M. Towards decrypting cryptobiosis - analyzing anhydrobiosis in the tardigrade Milnesium tardigradum using transcriptome sequencing. PLoS One. 9 (3), e92663(2014).
  32. Mali, B., et al. Transcriptome survey of the anhydrobiotic tardigrade Milnesium tardigradum in comparison with Hypsibius dujardini and Richtersius coronifer. BMC Genomics. 11 (1), 168(2010).
  33. Förster, F., et al. Transcriptome analysis in tardigrade species reveals specific molecular pathways for stress adaptations. Bioinform Biol Insights. 6, 69-96 (2012).
  34. Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Sci Data. 3 (1), 160063(2016).
  35. Arakawa, K. Transcriptome assembly of Richtersius coronifer with annotated BLAST result against Ramazzottius varieornatus. Figshare. Dataset. , (2019).
  36. Yoshida, Y., Konno, S., Nishino, R., Murai, Y., Tomita, M., Arakawa, K. Ultralow input genome sequencing library preparation from a single tardigrade specimen. J Vis Exp. (137), (2018).
  37. Murai, Y., et al. Multiomics study of a heterotardigrade, Echiniscus testudo, suggests convergent evolution of anhydrobiosis-related proteins in Tardigrada. bioRxiv. , (2020).
  38. Yoshida, Y., Sugiura, K., Tomita, M., Matsumoto, M., Arakawa, K. Comparison of the transcriptomes of two tardigrades with different hatching coordination. BMC Dev Biol. 19 (1), 24(2019).
  39. Tenlen, J. R. Microinjection of dsRNA in tardigrades. Cold Spring Harb Protoc. 2018 (11), (2018).
  40. Tenlen, J. R., McCaskill, S., Goldstein, B. RNA interference can be used to disrupt gene function in tardigrades. Dev Genes Evol. 223 (3), 171-181 (2013).
  41. Giovannini, I., et al. Production of reactive oxygen species and involvement of bioprotectants during anhydrobiosis in the tardigrade Paramacrobiotus spatialis. Sci Rep. 12 (1), 15888(2022).
  42. Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 2, 59-63 (2015).
  43. Boothby, T. C. Total RNA extraction from tardigrades. Cold Spring Harb Protoc. 2018 (11), 905-907 (2018).
  44. Czerneková, M., Vinopal, S. The tardigrade cuticle. Limnol Rev. 21 (3), 127-146 (2021).
  45. Goldstein, B. Hypsibius dujardini. collection notes and culture protocol from Bob McNuff. , At http://tardigrades.bio.unc.edu/protocols/CollectionCulture.pdf (2007).
  46. McNuff, R. Laboratory culture of Hypsibius exemplaris. Cold Spring Harb Protoc. 2018 (11), 867-870 (2018).
  47. Gabriel, W. N., et al. The tardigrade Hypsibius dujardini, a new model for studying the evolution of development. Dev Biol. 312 (2), 545-559 (2007).
  48. Ruiz-Villalba, A., Ruijter, J. M., van den Hoff, M. J. B. Use and misuse of cq in qPCR data analysis and reporting. Life (Basel). 11 (6), 508(2021).
  49. Antonov, J., et al. Reliable gene expression measurements from degraded RNA by quantitative real-time PCR depend on short amplicons and a proper normalization. Lab Invest. 85 (8), 1040-1050 (2005).
  50. Toussaint, J., et al. Improvement of the clinical applicability of the genomic grade index through a qRT-PCR test performed on frozen and formalin-fixed paraffin-embedded tissues. BMC Genomics. 10, 424(2009).

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单动物单管RNA提取法结合qRT-PCR比较缓步动物Hypsibius exemplaris中的相对转录水平
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