用于小型猪单阶段组织工程尿路上皮管的手术模型

摘要

用于重建手术的组织工程植入物由于费力的制备过程，很少能超越临床前试验阶段 离体 培养过程，其中包括复杂且昂贵的支架组分。在此，我们介绍一种单阶段手术方案，用于尿流改道，采用一种含有自体微移植组织的、易于获取的胶原基管状支架。

摘要

重建手术常面临移植物组织不足的挑战。在泌尿生殖系统畸形的治疗中，传统方法是采集胃肠道组织用于异位重建，因其来源丰富，可恢复患者的正常功能。然而，通过在体内重新排列自体组织所获得的临床效果常伴随显著的并发症；因此，组织工程在此类外科领域具有特殊潜力。尽管已有显著进展，组织工程支架尚未成为有效的外科治疗替代方案，主要原因是材料、生产和植入过程成本高昂且操作复杂。本方案介绍一种基于胶原蛋白的管状支架，内嵌自体器官特异性组织颗粒，设计作为尿流改道的导管。该支架在初次手术过程中构建，由常规外科材料制成，仅需标准外科技术即可完成。其次，本方案描述了一种用于评估短期 体内 植入后的效果可能存在差异，且手术过程亦可能有其他变化。本文旨在逐步展示该手术流程，特别关注自体组织的应用以及管状结构的构建。

引言

在泌尿生殖系统畸形中，重建手术可能是恢复功能解剖所必需的，通常具有重要的临床指征^1,2传统的外科手术方法利用来自其他器官系统（如胃肠道）的自体组织来重建畸形或缺失的器官；然而，这种方法常伴随严重的术后并发症风险。^3,4对于需要长期导尿的神经源性膀胱功能障碍患者，在进行尿流改道时，常使用阑尾或经重塑的小肠节段构建尿路通道^5,6组织工程提供了一种可定制的替代性移植组织，能够根据器官特异性特征进行设计，从而最大限度地减少患者术后的并发症。^7,8尽管各种类型的支架可单独植入，但已有研究表明，对支架进行额外的细胞化处理，尤其是使用自体细胞，可改善植入后的再生效果^{9,10,11,12,13,14}然而，组织工程支架通常由复杂且昂贵的成分组成，其次，其所需条件为 离体 细胞培养和支架接种过程繁琐且资源消耗大。尽管该领域已研究数十年，这些因素仍阻碍了组织工程支架的临床转化。通过降低其复杂性以及金钱和材料成本，组织工程支架有望在现代外科手术中实现广泛应用，涵盖罕见手术和更常见的手术类型。

胶原蛋白此前已被确立为一种可用于细胞扩增的可行平台，并且在将细胞或组织黏附到支架上以用于外科植入时，还具有良好的生物黏附性^15,16,17围手术期自体微移植避免了对异体移植的需求 离体 通过在初次手术过程中获取目标组织并直接重新植入来进行细胞培养。将切除的组织切碎成更小的颗粒，可增加其表面积和生长潜能，从而提高在支架上的扩增倍数¹⁸基于胶原的支架并不特异性地适用于泌尿生殖系统重建，但从理论上讲，可应用于空腔器官重建的多个领域。

本文中，我们介绍了一种结合胶原蛋白与自体尿路上皮微移植片构建管状支架的实验方案，以及用于评估该支架技术可行性、安全性及再生性能的迷你猪模型。 体内采用本文所述方案与方法，对10只成年雌性小型猪进行了模型评估。该支架的主要优势在于结构简单，且可实现单阶段植入，避免了患者接受多次后续手术。该操作可在常规手术条件下由普通外科人员完成，仅需标准设备与材料。该动物模型为研究植入过程提供了可控环境，动物在术后可迅速恢复正常的生理行为，同时允许对支架结构及手术方案进行多种改良与调整。

方案

本实验在符合欧洲关于实验动物使用法规并经AAALAC认证的实验设施中进行，并已获得丹麦食品与农业部的伦理许可（参考编号：2022-15-0201-01206）。

1. 手术操作

1. 动物准备
   1. 术前至少禁食一只成年雌性哥廷根小型猪12小时。
   2. 按照下述要求，将所有无菌器械准备在手术台上。
   3. 对于成年标准体型的迷你猪，通过肌肉注射给予每10 kg体重1.0–1.4 mL的镇静混合液进行镇静，该混合液由125 mg唑拉西泮和125 mg替来他明溶于1.25 mL氯胺酮（100 mg/mL）、6.25 mL赛拉嗪（20 mg/mL）、1.25 mL美沙酮（10 mg/mL）以及2 mL布托啡诺（10 mg/mL）组成（后文简称镇静混合液）。
   4. 在可视引导下进行气管插管，将二氧化碳波形监测作为麻醉监护参数，并确认导管位置正确。通过生命体征及瞳孔和趾间反射测试确认麻醉深度。双侧眼睑涂抹眼用软膏。
   5. 安装双侧耳静脉导管，并以丙泊酚（10–15 mg/kg/h）和芬太尼（5–15 mg/kg/h）维持麻醉。
   6. 插入8 Fr导尿管，使用适当大小的鲁尔锁注射器向膀胱内注入250 mL生理温度的等渗盐水。
   7. 将猪置于仰卧位，然后剃除并刷洗腹部。随后用70%乙醇和氯己定擦拭液交替进行两轮皮肤清洁。 用无菌手术巾铺巾，界定手术区域。
2. 组织采集与外科支架植入 
   1. 使用手术刀和电凝进行标准的下腹正中切口，切开皮肤、肌肉和腹膜，将腹腔内的膀胱牵出至切口处。
   2. 使用电凝在膀胱前壁进行预防性止血，并切除一块2 cm的组织² 完整管壁节段，保留近端1 cm开口² 用快速可吸收单股缝线缝合剩余的膀胱壁 连续缝合
   3. 仔细解剖切除标本的黏膜层，并将约2 cm的组织剪碎² 将黏膜标本切成1 mm² 用于支架包埋的微移植物（详见下文第2节）。
   4. 支架构建完成后，使用可缓慢吸收的单丝连续缝线将管状结构与膀胱前壁残余的开口进行吻合。
   5. 利用耻骨膀胱韧带的腹膜瓣覆盖管状支架，并将一根14 Fr顺行结肠灌肠（ACE）塞子经腔内置入管状支架中。
   6. 用可缓慢吸收的4-0单丝缝线结扎导管远端，以防止尿液外漏，并通过膀胱导管用注射器注入总共250 mL无菌生理盐水，以确认吻合口通畅。
   7. 在右侧乳头尾侧2-3 cm处，沿中线外侧钝性分离一条穿过筋膜的通道，并将导管置于皮下 pocket 中。使用两根经皮不可吸收单丝缝线固定远端导管，以标记其在皮肤表面的位置。
   8. 用可缓慢吸收的单股连续缝线缝合腹肌的前鞘筋膜，用快速吸收的编织连续缝线缝合皮下组织，并用不可吸收的单股连续缝线缝合皮肤。
   9. 停止麻醉后，拔除动物的气管插管，并在马厩中观察，直至其完全恢复自主活动能力，并能安全地饮水和进食。

2. 支架构建

1. 复合支架的制备
   1. 在手术前（最长2小时），按照先前所述方法制备大鼠尾部I型胶原蛋白的液体溶液¹⁷。简言之，向胶原蛋白溶液中加入4:1体积的10倍浓度最低必需培养基（MEM），用1 M NaOH将pH值调至约7.4，最后加入1倍浓度MEM，使最终胶原蛋白浓度达到1.64 mg/mL。将溶液储存于无菌瓶中并置于冰上，待后续使用。
   2. 在手术切除组织并剪碎后，使用镊子将黏膜颗粒（即微移植片）手动放置于尺寸为2 cm × 6 cm、扩增比例为1:6的适配型可降解网格上（例如，将2 cm²的黏膜组织扩展至12 cm²的网格）。
   3. 在无菌钢板上准备一个尺寸为1 cm × 3 cm × 6 cm（高×宽×长）的无菌矩形钢模具，将带有微移植片朝上的网格放入钢模具中。缓慢倒入20 mL胶原蛋白溶液，注意避免将微移植片从网格上冲走。将整个结构转移至38 °C的无菌加热舱中，静置5分钟使其凝固。
   4. 待充分凝固后，将水凝胶滑移到置于穿孔钢板上的尼龙网上，并轻轻移除钢模具。
   5. 通过在凝胶上方依次放置尼龙网和钢板，并在钢板上方放置一个120 g的重物（本例中该重物重量相当于用于包埋的钢模具）进行被动压缩5分钟，以挤出水凝胶中的水分。
   6. 压缩完成后，将压平的支架围绕一个尺寸为5 cm × 0.6 cm（长度×内径）的可降解支架管卷起，使微移植片朝向支架管内侧，并使用缓慢吸收的单股连续缝线沿纵向将支架固定缝合。至此，完成的导管即可用于外科植入。

3. 术后管理

1. 镇痛与抗生素预防
   1. 术后前3天给予布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg/8 h，静脉注射），前4天给予美洛昔康（0.4 mg/kg/天，肌肉注射或口服），前5天给予甲氧苄啶（2.7 mg/kg/天，肌肉注射或4.2 mg/kg/天，口服）和磺胺多辛（13.3 mg/kg/天，肌肉注射或20.8 mg/kg/天，口服）。动物仍处于麻醉状态时，术后立即给予肌肉注射。
   2. 将动物单笼饲养，以避免啃咬外部静脉导管和缝合材料。通过聚碳酸酯窗为相邻围栏内的小型猪提供视觉接触，并允许鼻部接触。每日提供新鲜稻草和干草，以及玩具和饮水供应 随意摄取 每日饲喂两次。
   3. 每天观察动物的自然行为、进食情况、尿液和粪便生成，每周评估体重。
   4. 在观察期结束时（6周），使用1-1.4 mL/10 kg的镇静混合物进行肌肉注射以镇静动物，并通过静脉注射致死剂量的戊巴比妥（100 mg/kg）处死动物。

4. 死后评估

1. 大体解剖
   1. 动物处死后，在皮肤水平切开远端输出道，并移除 ACE 塞子。用塑料夹闭合尿道，通过远端输出道开口使用导管注入 250 mL 碘海醇与等渗盐水按 1:20 配制的对比剂溶液。
   2. 使用 64 层计算机断层扫描仪对动物进行评估。采用多平面重建技术观察图像，并使用医学图像处理软件分析所有图像。
   3. 经天然尿道插入 16.2 Fr 可弯曲膀胱镜，对膀胱及输出道管腔进行内镜检查。
   4. 在仔细评估任何大体解剖学发现的同时，将输出道整体切除。此外，取距离输出道吻合口 2 cm 边缘的全层膀胱组织活检标本，并以类似方式处理，作为参考值对照。
2. 组织学处理
   1. 将切除的标本置于 10% 甲醛溶液中固定 24 小时。
   2. 使用手术刀将输出道垂直均匀分割为近端、中段和远端三部分。将标本依次经梯度乙醇脱水后，包埋于石蜡中，再进行切片机切片。
   3. 对 5 µm 厚切片进行苏木精-伊红（H&E）染色和广谱细胞角蛋白 CK-AE 染色，并使用数字病理切片扫描仪进行扫描。

结果

在本研究中， 体内 尿路上皮组织在基于胶原蛋白的管状支架中实现扩增。通过将围手术期采集并处理的自体组织颗粒嵌入支架，该技术可实现单阶段支架植入，术后无需联合使用免疫抑制治疗。支架通过可生物降解的网状材料和支架管加强，从而确保手术操作的可行性。图1）。经过6周的观察，大体组织学评估未发现宿主排斥或感染迹象，管状支架保持通畅且无阻塞（图2）。组织学评估显示，来源于尿路上皮的复层腔面上皮完全覆盖支架，且在植入6周后仍可见增强用生物材料的残留。图3).

图 1：支架构建与植入。 术中对膀胱组织进行解剖（左上）。将切碎的黏膜微移植物扩展至外科网片上（中上），并包埋于固化的胶原中（右上）。胶原经压缩以排出水分，并制备支架（左下）。将支架围绕支架管卷成管状，并在支架管内放置ACE堵头（中下）。膀胱部分闭合，最终将构建物植入组织切除的原始部位（右下）。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：支架的大体评估。 6周后，处死动物，并在皮肤水平解剖取出支架（箭头所示）（左上图）。膀胱内注入造影剂（黄色），进行CT扫描，以评估导管（箭头所示）是否通畅以及是否存在狭窄迹象（右上图）。通过尿道进行膀胱镜检查，以评估6周后的膀胱及吻合口情况（箭头所示）（左下图）。通过体外开口插入导管（箭头所示）进入膀胱，再次测试导管的通畅性（右下图）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：支架的显微评估。切除的导管被固定后，进行正交横切面切片，以评估导管在近端至远端方向的结构。术后6周时，对导管管腔（1）进行评估，以确认上皮化形成（上方放大图）。此时仍可见可生物降解支架（2）和网状材料的残留（下方放大图）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方案介绍了一种简便且易于实施的技术，适用于未来的重建手术。组织工程领域（包括自体细胞扩增）普遍存在一个常见缺点，即在手术植入前需要昂贵且复杂的前期准备步骤。自体微移植技术可能简化其中多个步骤，并有望实现单阶段手术操作。通过自体移植复杂的组织学结构，可诱导促再生的旁分泌信号通路¹⁸在之前的研究中，我们发现微组织移植物若未适当地固定在支架上，则容易受到物理环境的影响而受损^15,19胶原蛋白已被研究作为组织扩张的可行环境 体外 并且因其良好的生物相容性和商业可获得性而被选用于本研究目的。本文所介绍的复合支架此前已在研究中经过优化 体外 评估微移植物包埋和胶原蛋白浓度变化的实验^20,21,22. 在……之前 在体 已评估支架在渗透性、生物力学和降解方面的性能 体外²⁰此外， 体内 基于支架的组织扩张技术此前已在啮齿类动物和兔模型中得到验证^21,22.

选择该手术模型旨在评估一种管状支架，以模拟儿童或青少年患者因神经源性膀胱功能障碍而进行尿流改道的临床场景。关键步骤包括精确分离黏膜微移植物，并从切除至支架植入的整个过程中维持湿润环境。另一个关键步骤是确保水凝胶充分固化；在胶原蛋白移液过程中需格外小心，以避免凝胶内产生气泡，同时正确的温度设置和组分溶液可确保凝胶正常固化。若未能形成固化的凝胶，则会增加胶原层分离和微移植物脱落的风险。在手术操作部分，植入过程中需谨慎操作，以避免因机械损伤或解离而损害微移植物。在关闭腹腔前，应通过向膀胱内灌注液体仔细评估其通畅性。

该技术的局限性包括支架的厚度，从直观上看，支架厚度对外部环境向微移植物扩散营养物质的能力存在上限。另一方面，支架厚度过小可能导致通透性过高，从而引起尿液渗漏。我们目前的成分设计基于先前的研究 体外 评估不同胶原蛋白浓度下细胞再生的情况²⁰自体组织微移植同样依赖于健康的移植物组织，因此目前该手术不适用于恶性疾病，因为在这些病例中无法完全排除癌细胞重新移植的风险²³然而，当前技术是针对存在功能性排尿障碍且不考虑此风险的病例而设计的。尽管该模型模拟了临床环境中的多个步骤（即阑尾膀胱造瘘术），但由于远端通道被结扎，本实验并未使用完全功能性的造口进行尿流改道。此外，由于临床并发症可能终身发生，为期6周的观察期对于了解狭窄和控尿等特定结局所提供的信息可能有限。因此，可在将愈合后的通道与皮肤水平吻合后，增加一项为期6个月的随访研究。

该技术的优势在于其设计简单，若将微移植物的组织来源及支撑性生物材料替换为其他相关替代物，则可实现广泛的通用应用。这些组分可根据支架强度、弹性及生物降解性等器官特异性需求进行调整。最后，该技术操作便捷且成本低廉，有利于实验的可重复性以及技术的广泛转化应用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x MEM	Gibco，Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆	2517592	胶原蛋白制备
1x MEM	Gibco，Thermo Fisher Scientific，Waltham，美国	2508924	胶原蛋白制备
Ambu aScope 4 Cysto	Ambu A/S，巴勒鲁普，丹麦	1000682507	膀胱镜
Aquaflush ACE 封口塞	Abena，Taastrup，丹麦	ACE12/220501	ACE抑制剂帽
Borgal兽用注射液200 + 40 mg/mL	Ceva Animal Health A/S	510460	磺胺类药物/甲氧苄啶
Bupaq 多剂量兽用 0.3 mg/mL	Salfarm Danmark A/S，丹麦	502763	布托啡诺
Butomidor 注射液 10 mg/mL	Salfarm Danmark A/S，丹麦	531943	布托啡诺
Comfortan vet 注射液 10 mg/mL	Dechra Veterinary Products A/S，丹麦	492312	美沙酮
3-0 Ethilon 缝合线	Ethicon, Johnson & Johnson，新不伦瑞克，美国	SGBCXV	单丝不可吸收缝线
芬太尼注射液 50 µg/mL(hamel)	Hameln Pharma ApS, DK	432520	芬太尼
Ketador vet 注射液 100 mg/mL	Salfarm Danmark A/S，丹麦	115727	氯胺酮
美达佳注射液 20 mg/mL，适用于牛/猪/马	勃林格殷格翰动物保健，德国	6443	美洛昔康
美达佳口服混悬液 15 mg/mL 猪用	勃林格殷格翰动物保健，德国	482780	美洛昔康
Omnipaque	GF Healthcare，奥斯陆，挪威	16173849	CT对比度
广谱细胞角蛋白 CK-AE	DAKO Agilent，美国	GA053	克隆 AE1/AE3
PDS 缝线 3-0	Ethicon, Johnson & Johnson，新不伦瑞克，美国	SEMMTQ	单丝慢吸收缝线
Prolene 4-0 缝合线	Ethicon, Johnson & Johnson，新不伦瑞克，美国	PGH187	单丝不可吸收缝线
Propolipid t.inj/inf 10 mg/mL	弗雷泽纽斯卡比，丹麦	21636	丙泊酚
大鼠尾胶原蛋白 I 型	First Link Ltd，沃尔夫汉普顿，英国	60-30-810	0.6% 乙酸溶液中的蛋白质浓度为 2.06 mg/mL
Suprim vet  20 + 100 毫克（饮水中使用的溶液）	Dechra 兽药产品 A/S，丹麦	33661	磺胺类药物/甲氧苄啶
SX-ELLA 可降解胆道支架	ELLA-CS，特雷贝斯，CZ	S23000056-01	ø 6 mm × 60 mm
薇乔网片	Ethicon, Johnson & Johnson，新不伦瑞克，美国	VM1208	网筛
Vicryl 4-0 缝线	Ethicon, Johnson & Johnson，新不伦瑞克，美国	SMBDGDR0	可快速吸收编织线
Xysol兽用注射液 20 mg/mL	ScanVet 动物健康有限公司，丹麦	54899	赛拉嗪
Zoletil 50 vet plv/sol t.inj 25 + 25 mg/mL	Virbac Danmark A/S, 丹麦	568527	替来他明和唑拉西泮