α-突触核蛋白聚集体鼻内给药技术

摘要

本方案描述了一种鼻内给予α-突触核蛋白聚集体的方法。该方法有助于研究帕金森病中α-突触核蛋白从嗅黏膜向嗅球的传播过程。

摘要

帕金森病（PD）是一种神经退行性疾病，其特征是存在路易小体，即α-突触核蛋白（α-Syn）的聚集物。最近有研究提出，该疾病通过α-Syn聚集物从嗅球（OB）或迷走神经背核以类朊病毒方式传播而发生和发展。尽管OB中α-Syn聚集物的来源尚不明确，但最近有研究提示其可能从嗅黏膜传播而来。我们先前在小鼠模型中证实，鼻内给予α-Syn聚集物可诱导小鼠OB中出现α-Syn病理改变。在本研究中，我们介绍了一种可诱导小鼠OB中α-Syn病理改变的α-Syn聚集物鼻内给药方法。该方法操作极为简便直接，我们相信它将成为阐明OB中α-Syn病理起源及α-Syn经嗅觉系统传播通路研究中的有力工具。

引言

帕金森病（Parkinson's disease, PD）是第二常见的神经退行性疾病，其特征为运动症状，如运动迟缓、静止性震颤和肌肉僵直¹。PD 还表现为非运动症状，包括嗅觉功能障碍、认知损害、抑郁、幻觉、便秘和直立性低血压。其病理特征为黑质中多巴胺能神经元的死亡以及α-突触核蛋白（α-synuclein, α-Syn）聚集形成的路易小体（Lewy bodies）²。

值得注意的是，α-Syn 是一种由 140 个氨基酸组成的蛋白质，在正常情况下以可溶性单体（或四聚体）的形式存在。然而，在异常条件下，可溶性单体会转化为不溶性的高分子量聚集体，包括寡聚体和纤维。据报道，α-Syn 向寡聚体和纤维的转变与细胞毒性相关³。

近期研究表明，α-突触核蛋白（α-Syn）聚集体可在神经元之间以类朊病毒的方式传播。基于大量尸检研究，Braak 等人于2003年提出假说，认为路易小体病理以某种相对刻板的模式在脑内进行渐进性扩散（Braak假说）^4,5。2008年，对接受胎儿中脑移植的帕金森病（PD）患者进行尸检发现，来源于胎儿组织的多巴胺能神经元中出现了路易小体

方案

本研究使用了2月龄的C57BL/6J雄性小鼠。所有实验操作均按照国家指导原则进行。京都大学动物研究委员会已批准本研究的伦理审查并授予许可（MedKyo 23,544）。

1. α-突触核蛋白预制纤维的鼻内给药

1. 根据先前报道的方法在 PBS 中制备小鼠 α-突触核蛋白（α-Syn）纤维溶液（4 mg/mL）¹¹。用透明薄膜包裹管子以防止污染。
2. 使用水浴式超声仪（材料表）对 200 µL 的 α-Syn 纤维溶液进行超声处理，以生成预先形成的 α-Syn 纤维（PFFs）。在超声水浴中加入水并放入冰块，冷却至 4 °C 后进行超声处理。总超声时间为 5 分钟，每次循环包括 30 秒超声和 30 秒间歇（共五个循环）。
   注意：请佩戴个人防护装备，如一次性手套、口罩和护目镜，以避免接触 α-Syn。
3. 准备一支 P10 移液器（材料表）并装上 10 µL 吸头。通过腹腔（i.p.）注射使用盐酸美托咪啶、咪达唑仑和布托啡诺（MMB）混合物对每只小鼠进行麻醉。MMB 麻醉剂包含咪达唑仑（0.3 mg/kg）、美托咪啶（4 mg/kg）和酒石酸布托啡诺（5 mg/kg）。当混合咪达唑仑（1 mg/mL）0.3 mL、美托咪啶（5 mg/mL）0.8 mL、酒石酸布托啡....

结果

图3 展示了嗅球（OB）中α-突触核蛋白（α-Syn）聚集体的多个示例。在本研究中，我们将α-Syn聚集体注入单侧鼻腔。两个鼻腔由鼻中隔分隔，每个嗅球分别将嗅觉感觉神经元投射至对应的鼻腔。因此，对侧的嗅球可作为对照。

在治疗侧的嗅球中，给药后1个月和3个月均未观察到磷酸化α-突触核蛋白（P-α-Syn）病理改变（图3A、B）。给药后6个月和12个月，在治疗侧嗅球的嗅小球层中观察到类似路易神经突的磷酸化α-突触核蛋白聚集物（图3C、D、F、G）。在对照侧的嗅球中未观察到此类聚集物（图3E）。

我们可以通过计数α-Syn聚集体或使用ImageJ（材料表）检测其大小等参数来评估α-Syn病理变化。.......

讨论

在之前的一项研究中，将α-Syn聚集体注入猕猴的鼻腔后，虽未观察到α-Syn聚集体本身，但可诱导黑质中多巴胺能细胞死亡及铁沉积²¹。据报道，连续28天每日将A53T人源α-Syn聚集体注入朊病毒启动子驱动的α-Syn转基因小鼠（M83小鼠）鼻腔，可诱导小鼠脑内出现α-Syn病理改变并产生运动症状^19,22。在本研究中，我们证明单次给予野生型小鼠鼻腔α-Syn聚集体即可诱导嗅球（OB）中出现α-Syn病理改变。这一简单方法可能对研究α-Syn从鼻黏膜向嗅球传播具有重要价值。

在此方法中，α-突触核蛋白（α-Syn）纤维的充分超声处理至关重要，因为先前的研究表明，较小尺寸的α-Syn聚集体在诱导α-Syn病理方面效率最高^23,24。若α-Syn纤维超声处理不足，将导致嗅球（OB）中α-Syn传播极少。由于不.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
一体化荧光显微镜 BZ-X710	KEYENCE	N/A	一体化显微镜
氨苄青霉素钠盐	Nacalai tesque	02739-32
Bioruptor II	Sonicbio	BR2006A	水浴式超声破碎仪
酒石酸布托啡诺	明治制药	WAK-52850
纤维素管	MISUMI	UC20-32-100
DeepWellMaximizer	TAITEC	MBR-022UP	摇床
DynaCompetent Cells Zip BL21(DE3)	BioDynamics Laboratory Inc.	DS255	感受态细胞
Entellan	Sigma-Aldrich	107961	显微镜快速封片剂
Graefe 超细镊子 弯齿型	FST	11152-10	镊子
硬化精细剪刀	FST	14090-09	剪刀
Histofine Simple stain mouse MAX-PO (R)	日清医工	414341	通用免疫过氧化物酶聚合物，抗兔抗体
ImageJ 版本 1.52p	NA	NA	https://imagej.net/
innova4200	New Brunswick scientific	9105085	恒温摇床
异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷	Nacalai tesque	19742-94
LB 培养基，Lennox 型	Nacalai tesque	20066-24
Leica EG 1150 H	Leica	14 0388 86 108	模块化组织包埋中心
Leica TP 1020	Leica	14 0422 85108	全自动组织脱水机
美托咪定	Fuji Film	135-17473
Microm HM325 旋转式切片机	Thermo Scientific	902100
咪达唑仑	丸石制药	4987-211-76210-0
新型G型苏木精染液	武藤化学	65-9197-38	苏木精溶液
新型静脉穿刺带翼针头 D型，25G	TERUMO	NN2332R	25G 针头
Optima TLX 超速离心机	Beckman Coulter	8043-30-1197	超速离心机
P10 移液器	Gilson	FA10002P
石蜡	Leica	39601095
多聚甲醛	Nacalai tesque	30525-89-4
过氧化物酶DAB染色试剂盒	Nacalai tesque	25985-50
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Scientific	23225	BCA 法蛋白定量
pRK172	Addgene	#134504	质粒
Q-Sepharose Fast Flow.	cytiva	17051001	离子交换树脂