完整及再生墨西哥钝口螈肢体中软骨的原子力显微镜测量

摘要

在本实验方案中，我们展示了如何制备蝾螈组织以进行原子力显微镜（AFM）检测，并在完整及再生肢体软骨中进行压痕测量。

摘要

机械力为细胞正常功能和发育组织中的模式形成提供了重要的信号，其在胚胎发生和病理发生过程中的作用已被广泛研究。相比之下，人们对动物再生过程中这些信号的作用了解较少。

由于具有在损伤后完全再生多种器官和组织（包括缺失的软骨和骨骼）的能力，墨西哥钝口螈（axolotl）是研究再生过程的重要模式生物。由于骨骼组织在脊椎动物体内起着主要的支撑作用，因此在再生过程中恢复其功能不仅需要重建缺失的结构，还需恢复其机械性能。本实验方案介绍了一种用于原子力显微镜（AFM）检测的墨西哥钝口螈肢体样本制备方法，该方法是高空间分辨率下探测细胞和组织机械性能的金标准。

利用墨西哥钝口螈的再生能力，本研究测量了肢体软骨在稳态以及肢体再生两个阶段（组织溶解和软骨凝聚）期间的硬度。结果表明，原子力显微镜（AFM）是研究组织动态重构及再生过程中力学变化的有力工具。

引言

骨骼，尤其是软骨和骨组织，为脊椎动物体内软组织提供了主要的机械支撑。因此，骨骼系统的任何损伤都可能严重损害其功能，甚至影响生存。在人类中，骨折是最常见的创伤性损伤之一¹，其中大多数在数周内可自行修复，但仍有5%–10%的病例会出现愈合延迟或无法完全恢复^2,3。此外，人类无法自行修复大范围的骨或软骨缺损^4,5。然而，某些蝾螈能够再生多种身体结构，包括完整的肢体⁶，这使其成为研究骨骼再生的理想模型。

墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）是一种被广泛研究肢体再生的蝾螈。该过程可分为四个主要的连续且部分重叠的阶段：1）伤口愈合，2）炎症/组织溶解，3）芽基形成，以及 4）芽基生长/分化（详见文献^7,8）。截肢后，损伤部位边缘的角质形成细胞迅速迁移，封闭伤口并形成伤口上皮（WE）。在随后的炎症和组织溶解过程中，病原体被清除，碎片和受损细胞被移除，截肢面下方的细胞外基质（ECM）被重塑⁹。组织溶解对于肢体再生的发生至关重要¹⁰，其中蛋白水解酶的分泌不仅对整体ECM重塑至关重要，而且有助于释放形成芽基的细胞以及ECM中储存的生物活性分子⁸。事实上，多种再生模型和模式生物的研究表明，在组织溶解期间ECM独特的材料特性能够诱导细胞去分化过程，或引导细胞向损伤部位迁移（详见文献¹¹）。此外，在组织溶解后期，钙化组织的吸收已被证明对新生肢体骨骼结构的正确整合具有关键作用¹²。在组织溶解阶段之后，芽基在伤口上皮（WE）下方形成，表现为由成熟组织细胞去分化或组织驻留干细胞产生的未分化、多谱系前体细胞的聚集。芽基细胞增殖并分化为所有缺失的细胞类型。最后发生肢体形态发生，骨骼组织通过来自骨周细胞和转分化的真皮成纤维细胞所衍生的软骨前体细胞的聚集而再生^13,14,15。

尽管许多调控细胞身份改变和细胞外基质（ECM）成分变化的生化信号分子已被鉴定^{10,13,14,16,17,18}，但在肢体再生的不同阶段中，组织的力学特性及其对再生过程的影响仍 largely 未被深入研究。大量研究表明，在多种生理环境中，细胞能够感知并整合机械信号，从而调控其命运和行为（详见综述^19,20）。因此，将肢体再生的细胞与分子机制研究与组织力学测量相结合，将极大促进我们对这些生物学过程的理解。

已开发出多种技术，可用于生物样品的力学表征和力操控²¹。在这些技术中，原子力显微镜（AFM）已成为力学生物学领域的金标准，该技术通过使用超灵敏力传感器——AFM悬臂——对样品进行压痕，以高空间分辨率探测生物样品的黏弹性特性²²。由于该技术需要与样品直接接触，通常需制备组织切片，这在某些情况下可能具有挑战性。因此，必须针对每种特定样品调整和优化制备条件，以尽可能保持接近生理状态，并尽量减少人为假象的产生²³。本 方案描述了如何利用AFM测量墨西哥钝口螈肢体组织的刚度，重点关注完整状态下的软骨组织、发生组织溶解过程中的组织以及软骨凝聚阶段的组织（图1 和 图2）。该方法也可拓展用于其他类型组织的测量。

方案

墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）饲养于德累斯顿工业大学（TUD）德累斯顿再生治疗中心（CRTD）的墨西哥钝口螈养殖设施中。饲养条件的完整描述见文献²⁴。简而言之，饲养室温度保持在20–22 °C，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。所有操作和手术程序均遵循当地伦理委员会指南，并经德国萨克森州地方管理局（Landesdirektion Sachsen）批准。

本研究所有实验均使用白色（d/d）墨西哥钝口螈，这是一种自然发生的突变品系，缺乏体表色素（黑色素细胞和黄色素细胞极少或缺失），仅在眼睛虹膜中存在虹彩细胞。所用墨西哥钝口螈从吻端到尾端体长为8-15 cm，年龄为5-7个月，无性别特异性偏好。

1. 准备

1. 配制10% (w/v) 苯佐卡因储备液，用于蝾螈的麻醉和安乐死（见下文）。将50 g苯佐卡因与100%乙醇在容量瓶中混合，定容至500 mL。
2. 配制0.03% (w/v) 苯佐卡因储备液。
   1. 配制1 L溶液：将50 mL 10倍浓度Tris缓冲盐水（TBS）与30 mL 10% (w/v) 苯佐卡因溶液、5 mL 4000% (w/v) Holtfreter溶液混合，再加入915 mL蒸馏水，并用磁力搅拌器搅拌过夜。
   2. 配制1 L 10倍浓度TBS溶液：将24.2 g Trizma碱和90 g NaCl溶于990 mL去离子水中，用磁力搅拌器充分混合。然后加入约10 mL浓盐酸（12 M或37%），调节pH至8。
   3. 配制1 L 4000% (w/v) Holtfreter溶液：将158.4 g NaCl、11.13 g MgSO₄·7H₂O、5.36 g CaCl₂·2H₂O和2.88 g KCl溶于去离子水中，定容至1 L。
3. 通过将0.03% (w/v) 储备液按1:3比例稀释于饲养箱水中，配制0.01% (w/v) 的苯佐卡因工作液用于麻醉。
   1. 配制1 L溶液：取333 mL苯佐卡因储备液与666 mL饲养箱水混合。
4. 配制5 mg/mL酒石酸布托啡诺储备液用于镇痛。将100 mg酒石酸布托啡诺（+）盐溶于20 mL超纯水中。分装后于4 °C保存。
5. 在截肢当天，将储备液用饲养箱水按1:10,000比例稀释，新鲜配制0.5 mg/L酒石酸布托啡诺工作液，以减轻动物术后疼痛。
   1. 对于体长小于8 cm的动物，将20 µL储备液加入200 mL饲养箱水中。
   2. 对于较大的动物，将60 µL储备液加入600 mL饲养箱水中。
6. 配制无菌两栖类磷酸盐缓冲液（APBS），即80% (v/v) PBS溶液，将800 mL DPBS与200 mL去离子水混合，室温（RT）保存。
7. 配制1 mg/mL胰岛素储备液。将250 mg胰岛素粉末溶于25 mL 0.1 M HCl中，缓慢振荡至溶解。在持续振荡下加入225 mL APBS，直至溶液澄清。经无菌过滤后，分装为4 mL每份，于-20 °C保存。
8. 配制无菌培养基（所有成分为v/v%）：62.5% L15培养基、10%热灭活胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素、1%胰岛素、1% L-谷氨酰胺，并于4 °C保存至使用当天。实验当天使用前平衡至室温。
   1. 配制400 mL培养基：取250 mL L15培养基、40 mL热灭活FBS、4 mL青霉素/链霉素、4 mL胰岛素溶液（来自步骤1.7）、4 mL L-谷氨酰胺和98 mL无菌去离子水，在无菌条件下混合，混合后经无菌过滤。分装为15 mL每份。
9. 配制2.5%和3% (w/v) 低熔点（lmp）-琼脂糖APBS溶液，于70 °C加热使琼脂糖完全溶解。将溶液分装至1.5 mL离心管中，4 °C保存至使用当天。
   1. 配制20 mL 2.5% (w/v) lmp-琼脂糖溶液：在50 mL离心管中将0.5 g lmp-琼脂糖与20 mL APBS混合，于70 °C水浴中加热至琼脂糖完全融化。溶液应变为澄清透明。趁热分装。
   2. 配制20 mL 3% (w/v) lmp-琼脂糖溶液：将0.6 g lmp-琼脂糖与20 mL APBS混合，其余操作同上。
   3. （可选）：配制20 mL 1% (w/v) lmp-琼脂糖溶液：将0.2 g lmp-琼脂糖与20 mL APBS混合，其余操作同上。
      注意：融化时间取决于lmp-琼脂糖浓度，大约为15–40分钟。
10. 用于截肢和组织固定时，使用明场体视显微镜。
11. 准备直径100 mm的塑料培养皿、镊子、手术刀和手术剪，用于截肢和组织采集。
12. 准备直径35 mm的塑料培养皿，用于压痕测量。
13. 制备长约1 cm、直径约1 cm的圆柱体。将纸板切割刀在本生灯火焰上加热，用加热后的刀片切割15 mL离心管。
14. 裁剪若干1 cm²大小的Parafilm膜小片并储存备用。
15. 将金属块或冷块置于-20 °C冰箱中至少1小时，使其充分冷却。
16. 准备塑料巴斯德吸管。
17. （可选）：配制固定液MEMFa溶液（0.1 M MOPS，pH 7.4，2 mM EGTA，1 mM MgSO₄·7H₂O，3.7%甲醛）。将10.465 g MOPS、0.123 g MgSO₄·7H₂O、2 mL 0.5 M EDTA（pH 8.0）溶于水中，定容至45 mL。加入5 mL 37% (w/v) 甲醛，最终体积为50 mL。

2. 试剂

1. 有关本研究所用试剂，请参见材料表，但也可使用其他商业供应商提供的试剂。

3. 墨西哥钝口螈截肢与肢体再生

1. 在进行所有实验操作之前，将动物置于含有0.01%（w/v）苯佐卡因的养殖水（步骤1.3）中麻醉20分钟，确保动物已深度麻醉且对触觉刺激无反应。
2. 将美西螈从麻醉液中取出，放置于一个直径100 mm的培养皿上，皿内垫有经含麻醉剂的水润湿的滤纸。将肢体调整至与身体纵轴垂直，并将培养皿置于体视显微镜下以获得更清晰的视野。
   注意：本实验使用带有紧凑型鹅颈灯的体视显微镜。
3. 使用锋利且无菌的手术刀，在中胚节肢骨区域（桡骨/尺骨）钙化区远端立即截除肢体（图1A）。
   注意：根据动物福利的3R原则，建议将最初截下的肢体作为完整对照使用。
4. 将动物留在培养皿中，并用浸有含苯佐卡因水的湿滤纸覆盖15分钟，以促进血液凝固和伤口闭合。
5. 将动物转移至含有新鲜养殖水和镇痛剂（酒石酸布托啡诺，0.5 mg/L，来自步骤1.5）的水箱中。
6. 术后镇痛处理24小时后，将动物转移回含有新鲜养殖水的原始水箱中。
7. 让动物再生至所需的研究阶段。
   注意：在5月龄动物中，完整阶段的样本取自截肢当天，组织溶解阶段的样本取自截肢后第5天；在7月龄动物中，软骨凝聚阶段的样本取自截肢后第21天。

4. 用于测量的组织安装与处理

1. 将含有2.5%或3%（w/v）低熔点琼脂糖（来自步骤1.9）的1.5 mL离心管置于70 °C的加热金属块上加热，直至琼脂糖完全融化。随后将离心管转移至37 °C的另一加热金属块中，平衡温度后使用。
   注：本实验中，2.5%低熔点琼脂糖用于再生组织的检测，3%用于完整组织。
2. 用一片Parafilm膜（步骤1.14）密封1 cm长圆柱体（步骤1.13）的一端，确保其底端完全封闭。
3. 将15 mL培养基（来自步骤1.8）平衡至室温（RT）。
4. 将动物浸入含麻醉剂的水中（0.01%（w/v）苯佐卡因溶于饲养水）至少20分钟，以实现麻醉。
5. 在体视显微镜下使用可进行定量测量的软件对肢体成像。测量目标结构的长度，并计算需从肢体远端切除多少组织才能暴露目标切片区域。
6. 对于再生肢体，使用解剖刀和/或手术剪在肘部水平切断并收集肢体，去除多余组织。在准备下一步操作时，将组织暂时保存在APBS溶液中。确保切面与前臂轴线垂直（90°），以获得平整表面。对于完整肢体，通过腕部切断去除手部。
7. 通过暴露于致死剂量的麻醉剂（0.1%苯佐卡因）至少20分钟处死动物。为此，加入适量10%（w/v）苯佐卡因溶液，使终浓度达到0.1%（w/v）。
   1. 若动物此前在100 mL 0.01%（w/v）苯佐卡因溶液中麻醉，则加入900 µL 10%（w/v）苯佐卡因溶液。
8. 将肢体浸入APBS溶液中清洗。
9. 确保移液管和已预热至37 °C并装有琼脂糖的加热金属块靠近工作台。从-20 °C冰箱中取出冷金属块，将圆柱体底部（覆盖Parafilm膜的一端）朝下放置于其上。
10. 取出发离的肢体，用纸巾轻轻吸去多余液体。将肢体置于洁净培养皿中，加入融化的低熔点琼脂糖覆盖其上，并轻微移动肢体以排除皮肤表面残留的APBS。
11. 迅速将肢体放入圆柱体内，确保其垂直放置，且目标区域朝上。
12. 用镊子轻轻夹持肢体，向圆柱体内加入低熔点琼脂糖直至完全覆盖组织。在琼脂糖凝固前轻轻移除镊子。
13. 将圆柱体从冷金属块上取下，在室温下静置约30秒，使琼脂糖完全凝固。
14. 立即将含组织的琼脂糖块连同无菌培养基分装液和APBS一起转移至振动切片机操作室，保持室温。
15. 去除圆柱体底部的Parafilm膜，使用氰基丙烯酸酯胶水将含组织的琼脂糖块固定于振动切片机载物台上。确保琼脂糖和样品均牢固粘附于载物台。
16. 将载物台浸入APBS中进行切片。
    注：完整组织包含较硬的骨/软骨，而再生组织质地较软。因此需相应调整振动切片机参数。本研究采用以下参数：完整组织（振幅1.2 mm，速度0.1 mm/s）；再生组织（振幅0.9 mm，速度0.4 mm/s）。
17. 以短步进方式（例如每次100 µm）开始切削琼脂糖，直至到达组织尖端。随后继续切削组织块，直至去除步骤4.5中计算出的远端部分组织。如此可使目标区域的横截面清晰暴露。
    注：所切除的组织部分紧邻原子力显微镜（AFM）探测区域，可作为组织结构的参考样本，可用于直接互补分析或固定后进行后续染色（见第6节）。
18. 用刀片小心地将含组织的琼脂糖块从振动切片机载物台上取下，并彻底清除所有胶水残留。立即将该琼脂糖块用外科组织粘合胶固定于35 mm塑料培养皿中，并加入约2 mL室温培养基，确保组织完全浸没。
    注：琼脂糖块中暴露的组织表面即为待探测表面。

5. 原子力显微镜测量

1. 测量前至少 1 天，准备用于测量的悬臂梁。
   注意：本研究中，无针尖的硅悬臂梁用聚苯乙烯微珠（直径 20 µm）进行功能化处理，并将微珠-悬臂梁的结合在用于压痕测量前至少放置 1 天以增强其强度。
   1. 使用固化时间为 5 分钟的环氧胶将微珠粘附到悬臂梁上。
   2. 迅速将悬臂梁轻轻接触涂有胶的玻璃载片，使其末端形成一小滴胶，随后立即将其与合适的微珠接触。
   3. 保持悬臂梁与微珠接触约 10 分钟，然后将带有微珠的悬臂梁从表面提起。
2. 在测量前校准悬臂梁。
   注意：每次实验前，均使用原子力显微镜（AFM）软件内置程序通过热噪声法对改性后的悬臂梁进行校准。
3. 将含有组织块（步骤 4.18）和培养基的培养皿放入 AFM 的培养皿支架中，并在明场显微镜下获取概览图像（图 1B）。
   注意：压痕测试使用配备电动载物台的正置光学显微镜系统。安装 AFM 探头，将悬臂梁定位至组织上方，并使其接近组织表面。
4. 选择特定的兴趣区域，并记录一组力-距离曲线（图 2A）。
   注意：为使不同刚度的组织达到约 1–4 µm 的可比压痕深度，采用相对力设定值为 2–25 nN，接近和回撤速度为 7.5 µm/s，z 方向长度为 50 µm，网格大小为 70 µm × 70 µm，共 3 × 3 个测量点。
5. 对每个探测区域，均获取一幅明场显微镜图像，以便将所得数据与肢段切片中的具体区域相对应。
6. 对所有样品，每种组织类型至少探测 3 个不同区域。
   注意：在所有情况下，本研究均在软骨中心测量 4 个区域，在软骨周边区域测量 3 个区域，并将组织在显微镜下最多保留 1 小时。
7. 完成压痕测量后，丢弃组织或将其固定以进行后续分析。
   注意：测量结束后，将样品置于含有 2 mL MEMFa 溶液的离心管中，在 4 °C 下固定过夜。使用 MEMFa（步骤 1.17），但也可使用含 4%（w/v）甲醛的 PBS 溶液。

6. （可选）相邻组织切片的处理

1. 如果相邻的组织切片用于后续染色，则在切片后立即放入含有固定液的小型 2 mL 管中，并在 4 °C 下固定过夜。
   1. 为了通过标记肌动蛋白细胞骨架和细胞核来显示组织结构，用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟，以去除固定液，然后在摇床上用含 Alexa Fluor 488 标记的鬼笔环肽（1:250）和 Hoechst 33258（1:10000）的 PBS 溶液室温避光孵育 1 小时进行染色。
   2. 接着，将染色后的样本置于玻璃底培养皿上，使用在 37 °C 平衡的 APBS 中配制的 1%（w/v）低熔点琼脂糖（来自步骤 1.9）进行固定。确保待观察的表面朝向玻璃。待琼脂糖凝固后，用 PBS 覆盖样本以防止脱水。
      注意：完整组织与组织溶解样本使用倒置共聚焦显微镜成像（10 倍放大，光学切片厚度为 8 µm）。图 1C 中的图像为 8 层光学切片的最大投影图像。
2. 如果相邻组织切片用于需要新鲜组织的即时下游分析（如 RNA 提取、活体染料孵育等），请务必快速操作，并使用细胞培养基（来自步骤 1.8）以最大程度保持组织完整性。

7. 数据分析与展示

1. 为计算表观杨氏模量，使用 JPK/Bruker 数据处理软件，基于球形压头的赫兹/斯内登模型（公式1）分析力-距离曲线，假设泊松比为 0.5。
       (公式1)
   其中 R：压头半径，E：弹性模量，ν：泊松比，a：压头与样品之间接触区域的圆形半径，δ：压入深度。
2. 对于粘弹性分析，使用 PyJibe 0.15.0 软件中的“基于 Kelvin-Voigt-Maxwell (KVM) 模型修正的赫兹模型”扩展功能（由 Paul Müller 编写，https://github.com/AFM-analysis/PyJibe）分析力-压入曲线的接近段²⁵。该拟合函数基于 Abuhattum 等人²⁶描述的模型，整合了 Kelvin-Voigt-Maxwell 模型元件。
   1. 对力-压入曲线进行预处理，通过分段拟合方法估计接触点：使用直线（基线）和多项式拟合函数对接近段进行拟合。
   2. 将力-压入曲线拟合至“基于 Kelvin-Voigt-Maxwell (KVM) 模型修正的赫兹模型”。从拟合结果中获取未弛豫杨氏模量、表观杨氏模量和表观黏度。该模型还可提供 Maxwell 弛豫时间和压入时间。
      注意：在多个分析的力-压入曲线中（特别是完整组织），Maxwell 弛豫时间显著大于或小于压入时间，分别表明材料表现出更接近弹性行为或 Kelvin-Voigt 力学行为。
3. 将所有测量数据导出至电子表格，并计算每种组织类型及每个样品的表观杨氏模量中位数。
4. 使用适当的软件绘制图形并进行统计分析。
   注意：本研究使用 GraphPad Prism 软件；在描述结果时，引用的是每个样品表观杨氏模量中位数的均值 ± 标准差（见图 2D-F）。
5. 通过 Fiji 软件的最大投影功能对共聚焦图像的光学切片进行投影显示。调整每个独立通道的亮度和对比度，以实现荧光染色的最佳可视化效果。
6. 使用适当的软件生成图像图版。
   注意：使用 Affinity Designer 生成图版，图 1A中的模型由 Affinity Designer 绘制。

结果

利用上述方案，我们在稳态（“完整”）条件下、软骨组织早期溶解阶段以及后期软骨凝聚阶段，测量了软骨状墨西哥钝口螈肢体组织的表观杨氏模量（图1A）。我们还检测了骨骼结构不同区域（包括中心和周边区域）的力学特性，如显示悬臂位置的图像所示（图1B）。为了展示组织结构并将其与刚度测量结果相关联，我们对横向组织切片或进行测量的组织块进行固定，并分别使用Alexa Fluor 488标记的鬼笔环肽和Hoechst对肌动蛋白丝和细胞核进行染色（图1C）。在完整肢体中，桡骨明显大于尺骨，但这两个软骨性骨骼元件具有相似的形态，其中心区域分布着均匀的圆形细胞核，外围则环绕着一层扁平细胞核，对应于软骨膜²⁴。在组织溶解阶段，组织结构发生显著变化，骨骼元件内部的细胞核排列紊乱且密度降低。在后期软骨凝聚阶段，细胞核重新趋于有序排列，新生软骨与周围再生组织之间界限清晰。然而，在此阶段大多数细胞核呈扁平状，中心与周边之间无明显形态学差异。

当测量前肢中段区域存在的两块骨骼结构（桡骨和尺骨）的横截面时，在完整肢体中检测到无法区分的表观杨氏模量，其平均值分别为 10.95 ± 11.69 kPa 和 15.71 ± 6.49 kPa（图 2D，左侧），这与其解剖学上的相似性一致（图1C）。有趣的是，对软骨中心的分析 与 中心区域与周边区域的比较显示，在完整条件下，中心区域的表观杨氏模量高于周边区域，中位数分别为16.48 ± 6.86 kPa与7.53 ± 4.63 kPa（图2E，左侧）。截肢后第5天，对应于组织溶解阶段，桡骨和尺骨的表观杨氏模量显著降低（分别为0.03 ± 0.02 kPa和0.13 ± 0.09 kPa， 图 2D，右侧），且中心与周边区域之间的差异也消失，其杨氏模量中位数分别为 0.11 ± 0.07 kPa 和 0.27 ± 0.34 kPa（图2E，右侧）。在分析软骨再生后期（即软骨开始凝聚时）的软骨特性时，检测到表观杨氏模量显著增加，达到完整期与组织溶解期之间的中间值（0.77 ± 0.29 kPa， 图 2F).

从提供的示例曲线（图2B）可以看出，大多数接近和回撤曲线对之间出现了滞后现象，表明组织在受力时表现出黏弹性响应。我们进一步对不同组织的黏弹性特性进行了更详细的分析。由于在多个频率下进行振荡测量耗时较长，且在保持组织完整性方面存在一定挑战，尤其是在对多个组织区域进行扫描时，因此我们采用了一种由Abuhattum等人先前发表的方法，该方法可通过拟合悬臂梁立即回撤前的力-距离曲线接近段部分来提取参数²⁶。该模型基于Kelvin-Voigt和Maxwell模型元件，此前已被用于分析细胞和水凝胶²⁶以及胰腺组织²⁷的黏弹性特性。在组织再生的不同阶段所获得的中位未松弛模量（完整组织：23.05 kPa，组织溶解期：0.20 kPa，软骨凝聚期：1.60 kPa）和表观杨氏模量（完整组织：17.54 kPa，组织溶解期：0.07 kPa，软骨凝聚期：1.54 kPa）显示出显著差异（图2G-H）。总体而言，在选定的变形速率下，组织对变形主要表现为弹性响应，这体现在未松弛模量与表观弹性模量之间高度相似（图2G、H）。与完整组织（2.06 Pa·s）和软骨凝聚期（2.32 Pa·s）相比，组织溶解期的中位表观黏度值显著更低（0.72 Pa·s）（图2I）。如预期所示，PyJjibe分析所得的表观杨氏模量（图2H）与JPK数据处理软件获得的结果高度一致（图2F）。

综上所述，力学表征反映了再生过程中动态的组织重构。这些测量结果与解剖学观察一致，即组织硬度随着组织结构的观察变化而降低（图1C），并在再生过程中逐渐恢复。

图 1：墨西哥钝口螈肢体软骨再生过程中的压痕测量。（A）再生阶段的示意图。虚线表示使用振动切片机生成的横截面的大致位置，测量在此处进行。（B）肢体软骨中心（上）和外围（下）测量的代表性图像。黑色尖端为悬臂。比例尺：100 µm。（C）完整肢体组织（左）、发生组织溶解的组织（中）以及正在凝聚的软骨（右）的组织结构。绿色：细胞核（Hoechst染色），品红色：肌动蛋白丝（Phalloidin染色）。比例尺：500 µm。C' 为图中框选区域的放大图。比例尺：100 µm。70 µm × 70 µm 的压痕网格由白色（中心）和黄色（外围）虚线方框标出。在图 B 和图 C 中，字母 R 和 U 分别表示桡骨和尺骨。请点击此处查看该图的放大版本。

图2利用原子力显微镜测量墨西哥钝口螈肢体再生过程中的软骨硬度 (AAFM压痕实验示意图，显示力随时间变化（上图）以及力随压头与样品间距离变化（下图）。接近曲线和回缩曲线分别以蓝色和红色表示。接触点由一条黑色垂直虚线标示。力-压痕曲线的拟合在曲线的接近阶段进行，拟合方法采用赫兹/斯内登模型（使用JPK数据处理软件和Pyjibe）或Pyjibe中的粘弹性KVM模型扩展。B) 完整肢体和再生肢体在组织溶解期和软骨凝聚期的原子力显微镜测量所得的代表性力-距离曲线。每条曲线右上角所示为可分析曲线（即无伪迹）所占百分比。C) 典型的力-压痕曲线中常见伪影示例，例如由于压头与表面接触不当所致。图中所示为完整肢体的示例，但在所有条件下均观察到类似类型的伪影。对于 B-C：代表性力-距离曲线使用 Pyjibe 进行拟合并展示。浅蓝色曲线表示曲线的接近段，浅红色曲线表示回缩段。深蓝色线条为球形压头对应的赫兹/斯内登（Hertz/Sneddon）拟合曲线。下方显示了底部力-距离曲线的相应拟合残差。绘制的残差表示拟合值与实际力值之间的差异。D完整肢体与发生组织溶解的肢体中测得的桡骨和尺骨中心的表观杨氏模量。E完整肢体及组织溶解过程中软骨中心与周边（Peri）的表观杨氏模量。F) 在软骨再生分析阶段测得的中心区域表观杨氏模量。对于 D-F：每个点代表一条成功分析的力-距离曲线，较大的点对应中位数值 每 样品的表观杨氏模量通过JPK Bruker软件的赫兹/斯内登模型拟合获得。G-我未松弛模量G），表观杨氏模量（H）和表观黏度（我) 使用 PyJibe（KVM 扩展）基于软骨中心在再生各分析阶段的测量数据计算得出。每个数据点来源于一条成功分析的力-距离曲线。线条代表所有测量值的中位数 每 条件。对于 D-I：Kruskal-Wallis 检验结合 Dunn 多重比较检验。不同的字母代表彼此间具有统计学差异的实验条件（p < 0.05). 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

本文展示了利用原子力显微镜（AFM）测量墨西哥钝口螈肢体软骨硬度的技术。然而，该方法也可扩展应用于其他组织类型的检测。成功的AFM测量关键步骤在于样品制备，而墨西哥钝口螈样品的制备尤为困难。我们发现，对仍嵌入琼脂糖块中的组织表面进行检测是保持组织完整性的最佳方式。原因是墨西哥钝口螈皮肤会在表皮表面分泌大量黏液，从而阻碍切片组织在琼脂糖中稳定包埋。

某些样品可能会带来额外的挑战，例如具有较高的黏附性。我们在组织溶解阶段的样品中遇到了这一问题，这些样品相对柔软且具有黏性。在这些样品上，我们还观察到多条力-距离曲线，其压痕部分呈现出"锯齿状"的形态，表明探针小球以非连续的方式使样品表面发生变形（图2C），例如由于表面在应力作用下发生局部塌陷所致。此类力-距离曲线必须舍弃，因其无法用赫兹-斯内登（Hertz-Sneddon）模型进行拟合。为降低黏附性，可对压头进行钝化处理²⁸，例如用聚乙二醇（PEG）或牛血清白蛋白等降低其黏附性的试剂对压头小球进行包被。此外，也可采用其他模型对力-距离曲线进行拟合，例如JKR（Johnson-Kendall-Roberts）模型²⁹。由于本研究中分析的组织在相邻区域及不同实验条件下，其弹性模量的变化范围较大，超过一个数量级，因此选择单一理想的悬臂梁/压头（弹簧常数/压头尺寸）变得十分困难。组织刚度的显著差异也要求调整施加的接触力，以使压痕深度保持在可比范围内，并处于合适的区间（约为压头直径的5%–25%）。

为了尽可能保持组织力学特性的生理状态，另一个关键参数是维持组织的最大完整性。这一点通过测量新鲜样品来实现，样品在采集后立即进行处理，并在pH值稳定的细胞培养基中于适宜温度下保存。

最近，其他研究团队采用不同的样品处理方法，对墨西哥钝口螈的骨骼元件进行了微压痕测量³⁰然而，在这些实验中，组织被预先冷冻，再生的骨骼片段需从周围组织中手动解剖分离后进行测量 原位在得到实证之前，尚不清楚这些操作是否会影响软骨组织的完整性和机械性能。已有针对蝾螈肌肉和芽基的分析报道。^31,32在这些情况下，皮肤被去除，且样本未进行切片，因此仅能获得去除上皮层后紧邻表面的信息。尽管此类定量方法是准确的，但它主要提供的是关于 肌肉的侧面，从而忽略了来自肌肉内部层次的力学信息。我们使用了20 µ微压头，这意味着测量并非整体测量，而是如文献报道的微压痕测量^30,31,32，而是反映细胞实际所暴露的机械信号，并揭示组织的异质性（图2D-I).

在测量中，完整的骨骼元件边缘检测到较低的表观杨氏模量值，表明墨西哥钝口螈的软骨膜比软骨更柔软。然而，由于采用了70 µm × 70 µm的网格设置，我们不能排除也探测到了骨骼元件邻近组织的可能性。在溶组织期，此类差异未被观察到，提示墨西哥钝口螈再生肢体中的溶组织过程可能在软骨、其周围的软骨膜以及邻近组织中以相似程度进行。桡骨和尺骨具有相似的结构，但存在显著的解剖学差异，例如桡骨直径更大，而尺骨更长²⁴。尽管如此，迄今为止尚未见对二者刚度的比较分析报道，仅有关于其在医学目的下对机械负荷响应的研究³³。本文中，我们描述了在完整和再生肢体中这两种骨骼元件横截面上的压痕测量结果。我们发现，在墨西哥钝口螈肢体中，桡骨 与尺骨之间的刚度无显著差异，这与在人类对应骨骼中检测到的等效骨矿物质密度一致³⁴。然而，在溶组织期，尤其是桡骨表现出表观杨氏模量较低的趋势。为确定该现象是否具有生物学意义，建议使用更多的样本数量。根据本研究获得的数据，我们建议每种条件至少使用5个样本。在溶组织阶段，两种骨骼元件均变得更柔软，这与该阶段发生的细胞外基质重塑现象一致⁹。最后，本研究的测量结果表明，在后期软骨凝聚阶段，软骨刚度逐渐增加。这些观察结果与近期报道的完整骨骼和凝聚中软骨的压痕测量结果一致²⁹，同时也与利用布里渊共聚焦显微镜对软骨力学性质进行的体内评估结果相符³⁵。

总体而言，这项工作拓展了原子力显微镜（AFM）作为研究墨西哥钝口螈肢体机械性能的有力工具的应用潜力。通过该技术，我们旨在补充对基因表达和细胞转分化轨迹的认知。^16,13 为了更好地理解组织力学如何塑造并影响再生过程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Affinity Designer	Affinity	version 1.10.4	用于图像组装
低熔点琼脂糖	Roth	6351.1	用于样品制备
Alexa Fluor 488 鬼笔环肽	Invitrogen	A12379	用于组织染色
Axiozoom	Zeiss		用于在原子力显微镜（AFM）下成像样品
苯佐卡因	Sigma-Aldrich	E1501	用于动物麻醉
丁丙诺啡 (+)-酒石酸盐	Sigma-Aldrich	B9156	作为镇痛剂
悬臂梁	NanoWorld	Arrow TL1	用于原子力显微镜（AFM）压痕测量
配备电机载物台的 Cellhesion 200 装置	JPK/Bruker		用于原子力显微镜（AFM）压痕测量
CellSense Entry			用于在 Olympus UC90 体视显微镜下成像
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（DPBS, 1x）	Gibco	14190-144	用于清洗样品及振动切片机下的切片
FIJI（ImageJ2）	https://imagej.net/software/fiji	version 2.9.0/1.53t	用于图像处理
GraphPad Prism	GraphPad Software	(version 8.4.3)	用于数据作图与统计分析
热灭活胎牛血清（FBS）	Gibco	10270-106	用于细胞培养基
Histoacryl 胶水（2-丁基-氰基丙烯酸酯）	Braun		用于将样品粘附至培养皿
Hoechst 33258	Abcam	ab228550	用于组织染色
胰岛素	Sigma-Aldrich	I5500	用于细胞培养基
倒置共聚焦显微镜	Zeiss	780 LSM	用于组织切片成像
倒置共聚焦显微镜	Zeiss	980 LSM	用于组织切片成像
JPK/Bruker 数据处理软件	JPK/Bruker	SPM 6.4	用于分析力-距离曲线
L15 培养基（Leibovitz）	Sigma	L1518	用于细胞培养基
L-谷氨酰胺	Gibco	25030-024	用于细胞培养基
青霉素/链霉素	Gibco	15140-122	用于细胞培养基
聚苯乙烯微球（直径 20 µm）	microParticles		用于原子力显微镜（AFM）压痕测量
Pyjibe	由 Paul Müller 编写 https://github.com/AFM-analysis/PyJibe	0.15.0	用于黏弹性分析
体视显微镜 Olympus SX10	Olympus	SX10	用于肢体截肢和组织固定
体视显微镜 Olympus UC90	Olympus	UC90	用于成像
Leica 振动切片机	Leica	VT 1200S	用于组织切片