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中枢神经系统局灶性封闭系统损伤装置

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DOI：

10.3791/66948

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2024年11月29日

 ,  ,  , 
1Neuroscience Graduate Program, Vanderbilt University, 2Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center

本文内容

摘要

本方案描述了一种定制的超压空气系统，旨在诱导小鼠闭合式中枢神经系统（CNS）损伤，包括眼部、脑部和脊髓创伤。本方案的目标是为研究人员提供一个框架，以便轻松地根据其特定的中枢神经系统创伤研究需求对系统进行调整和扩展。

摘要

闭合性中枢神经系统（CNS）损伤的高发率凸显了深入理解此类创伤以改进防护和治疗干预措施的迫切需求。此类研究的关键在于能够模拟闭合性CNS损伤的动物模型。为此，本研究设计了一套定制的超压气流系统，用于在小鼠模型中复制多种闭合性CNS损伤，包括眼部、脑部和脊髓损伤。迄今为止，该系统已用于向眼部、头部或脊柱定向施加超压气流，以模拟眼球前后极损伤、间接性创伤性视神经病变（ITON）、局灶性创伤性脑损伤以及脊髓损伤。本文提供了该系统的详细操作方案，阐述了其设计与运行方法，并展示了验证其有效性的代表性结果。本文所提出的稳健框架为持续开展CNS创伤研究奠定了坚实基础。研究人员可利用该系统的灵活特性，精确调控损伤的部位、严重程度和时间点，从而实现对多种闭合性CNS损伤中分子机制及治疗效果的全面比较。

引言

闭合性中枢神经系统（CNS）损伤是指由于脑或脊髓受损而引起、但未造成颅骨或脊柱断裂的损伤。这类损伤包括创伤性脑损伤（TBI）和脊髓损伤（SCI），可由多种事件引发，例如钝力损伤（如跌倒、运动损伤、机动车事故）以及爆炸冲击波。与穿透性中枢神经系统损伤相比，闭合性中枢神经系统损伤通常被认为严重程度较低，但其发生频率更高。然而，与穿透性损伤类似，闭合性中枢神经系统损伤也可能导致长期且进行性的健康问题，尤其是在反复发生的情况下1,2,3,4,5,6。令人担忧的是，新兴证据表明，即使是单次发生时尚未达到TBI或SCI临床诊断标准的亚临床闭合性中枢神经系统损伤7,8,9,10,11,12,13，也可能在反复损伤后发展为慢性神经退行性疾病6,14,15,16。这凸显了迫切需要更深入地理解单次及反复闭合性中枢神经系统损伤的机制及其后果。  这类知识对于改进防护和治疗策略至关重要。实现这一目标的关键在于能够模拟闭合性中枢神经系统损伤的动物模型。

现有的闭合式中枢神经系统损伤动物模型在增进我们对这些创伤的病理生理机制以及潜在保护性和治疗性干预措施的理解方面发挥了重要作用。啮齿类动物尤其受欢迎，原因在于其成本低、易于获得、可进行遗传操作、便于操作、具有成熟的神经行为学和生理学检测方法，且伦理争议相对较小17。在啮齿类动物中诱导闭合性创伤性脑损伤（TBI）的常用方法包括重物坠落装置18,19、可控皮层冲击（CCI）装置20以及压缩空气驱动的冲击管21。对于脊髓损伤（SCI），钝性创伤模型通常需要通过椎板切除术22,23或其他外科技术24直接暴露脊髓或硬膜外腔。然而，已有研究利用压缩空气驱动的冲击管建立闭合性躯体脊髓损伤爆炸伤模型25。尽管这些模型提供了有价值的见解，但每种模型均有其独特的局限性。重物坠落模型可能存在较高的变异性，对损伤部位和严重程度的控制有限，易导致严重的非控制性损伤，从而引发实验可重复性和伦理方面的担忧26。CCI装置虽然具有较高的精确性，但需要专门培训才能操作，可能涉及开颅手术，且因机械变异性而影响实验的可重复性27。冲击管模型通常侵入性较小，但设备获取困难，安装和操作复杂，并可能因环境因素、冲击波反射以及复杂的压力相互作用而产生不真实且高度可变的损伤条件28。

为了更深入地研究单次和重复性封闭系统中枢神经系统（CNS）损伤的机制、效应及其治疗方法，本文介绍了一种模块化、用户友好、成本效益高且非侵入性的方法。该方法的主要目标是实现对损伤参数（包括损伤位置、严重程度和时间）的精确控制和灵活调整。为支持这一目标，本文提供了构建、校准和排查过压空气系统的详细实验方案，以解决现有封闭系统CNS损伤装置的一些局限性。该系统不仅成本低、搭建时间短，而且具有高度的灵活性，能够在减少伦理顾虑的同时提高临床相关性，并提供稳定且可重复的实验结果。此外，本文还描述了该系统在小鼠模型中诱导多种类型封闭系统CNS损伤的能力及其在未来研究中的潜在应用。值得注意的是，本文旨在提供一个框架，使研究人员能够便捷地获取、调整并扩展该系统以满足其特定研究需求，从而推动中枢神经系统创伤领域的持续研究。本文还展示了该系统在诱导轴突损伤方面的代表性实验结果。

方案

所有操作均依照范德堡大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）29,30,31,32 批准的方案进行，并遵循实验动物护理与使用认证协会（AAALAC）以及视觉与眼科研究协会（ARVO）的指导原则。所有小鼠均群体饲养，维持在 12 小时光照/12 小时黑暗的循环条件下，并可自由获取食物和饮水ad libitum。本方案中使用了 3 月龄30,31,33 的 C57 Bl/6 小鼠。

1. 系统构建

  1. 获取一把市售的彩弹枪（参见 材料表带有集成空气压力调节器的装置。
  2. 修改桶部（图1A如有必要。
    1. 如果原始气筒沿其长度方向带有开孔或穿孔，则压缩空气可能泄漏并消散到空气中，从而降低最大输出压力水平。可通过购买实心无孔气筒进行更换，以提高输出压力范围。图1，I）。
    2. 如果原始枪管过长且笨重，可通过购买定制长度的较短枪管，或使用管子切割器或锯子将其截短。
    3. 如果原始枪管无法产生所需的输出压力水平，可通过购买具有定制内径（孔径尺寸）的枪管来调整枪管的内径。减小原始孔径尺寸可增加输出压力的范围， 反之亦然.
  3. 调节调节器（图1B如有必要。
    1. 取下导向帽，以直接接触调节螺钉（图1，II）若原始调节器配有导向帽。
    2. 如果原始调节螺丝为内六角螺钉，则将其更换为平头内六角螺钉。
  4. 移除标准重力供弹器（即用于盛装并将彩弹装入枪中的储弹装置），并密封垂直供弹管图1，III）以避免压力泄漏。
    1. 确保彩弹枪已卸下弹药，且气源（CO₂）已断开2 在拆卸重力供料器之前，必须先断开空气压缩机（或压缩空气罐）。
    2. 找到加料口（图1C）重力进样装置的连接处。使用合适的工具松开进样管夹。
    3. 向上拉出以移除标准重力进样装置。
    4. 插入进料口盖或塞子以密封开口。这类配件通常可在彩弹店或在线购买，设计为紧密贴合进料口，实现密封。
  5. 组装一个平台（图1D用于彩弹枪和动物x-y定位台。
    1. 通过切割两块中密度纤维板来构建平台底座。
      注意：根据材料的可获得性和偏好，也可使用其他材料（如胶合板）。
    2. 裁剪一块较小的正方形，尺寸为 1.5 x 1.5 英尺。
    3. 裁剪一块较大的矩形材料，尺寸为 2.5 x 1.5 英尺。
    4. 使用两根平行的2×4木料将较小的平台抬高并固定在较大平台上方3.5英寸处。
  6. 将改装后的彩弹枪固定在平台上。
    1. 将彩弹枪侧放在较小的平台上，使枪管末端伸出边缘约半英寸。
    2. 使用与彩弹枪枪管和枪托相匹配的安装支架或夹具将彩弹枪固定。
    3. 连接一个加压空气罐（图1E；参见 材料表将彩弹枪的调节器连接至气源。或者，直接从压缩氮气罐连接一条压力管线，以扩大可靠输出压力范围。
    4. 若使用加压空气罐，需用耐用的织物带将其固定在纤维板上。使用螺丝或螺栓固定织带，并配备调节装置，以便于松紧调节。
  7. 使用螺丝或螺栓将X-Y定位平台固定在矩形纤维板上，位置位于彩弹枪枪管对面的较大板面上图1F).
    注意：使用x-y轴定位平台（参见 材料表），也称为x-y平台，可从各类供应商处购买，包括在线零售商、工业供应商和科学仪器供应商。在选购x-y定位平台时，需考虑行程范围、负载能力、精度，以及手动调节与电动控制之间的选择。该x-y定位平台可实现动物在两个轴向上的精确移动和定位：x轴（水平方向靠近或远离桶体）和y轴（垂直方向上下移动）。
  8. 通过安装三个PVC夹具来调整x-y定位平台的位置。
    1. 在桶体前端两侧使用螺丝或螺栓固定两个厚度为1 cm的PVC夹具。确保夹具宽度足以容纳步骤1.9和1.10中的动物固定装置（例如，1.5英寸）。
    2. 使用螺丝或螺栓将一个较厚的（4 cm）PVC夹具垂直且对向固定在两个1 cm厚的夹具上。确保该夹具足够宽，能够容纳步骤2.4中的压力传感器（例如，1.5英寸）。
    3. 在第三个夹具顶部钻两个孔，并插入两根塑料螺钉，用于在步骤2系统校准期间进一步稳定压力传感器。
  9. 定制动物固定装置的内部结构（图2A).
    1. 购买并截取一段PVC管（外径35 mm，内径26 mm，长6.75英寸），用于制作小鼠的内层 containment chamber。
    2. 在管子末端1英寸处创建一个矩形孔（3 × 5 cm），以暴露小鼠的头部和上背部肩部，同时保持身体其余部分处于遮蔽状态。
      注意：如果中枢神经系统损伤部位位于小鼠背部较低位置（例如胸椎或腰椎），应将矩形孔开得更大。
  10. 定制动物固定装置的外部图2B).
    1. 购买并截取一段PVC管（外径44 mm，内径35 mm，长6英寸），作为小鼠的外部容纳腔室。
    2. 构建曝光孔径（图2C在外层 containment chamber 内精确控制中枢神经系统损伤部位。
    3. 在步骤2系统校准期间，于对侧创建一个相对的开口，用于插入压力传感器的探头（例如，一个9 mm的孔）。
  11. 改造动物固定装置的外部结构以适配气体麻醉输送系统。若使用注射麻醉剂，则可跳过此步骤。
    1. 用胶带将动物固定装置外侧的一端密封。确保密封紧密，防止气体泄漏。
    2. 在密封处打一个小孔以插入麻醉管。
    3. 将麻醉管路置于管内环境以输入异氟烷，避免与动物直接接触。

2. 系统校准

  1. 将压力传感器（图2D；参见材料表中的选项）连接至数据采集（DAQ）系统和计算机，以将物理压力读数转换为数字数据。
    1. 将压力传感器连接到DAQ模块（参见材料表），确保极性正确且连接牢固。
    2. 将DAQ模块插入DAQ机箱（参见材料表），使其能够获得供电并与计算机通信。
    3. 使用USB线缆将DAQ机箱连接至计算机。
    4. 确保计算机已安装与DAQ硬件通信和采集数据所需的软件及驱动程序（参见材料表中的选项）。
  2. 配置DAQ系统设置。
    1. 打开已安装的DAQ软件。
    2. 确保计算机能够识别DAQ系统。
    3. 查阅所用DAQ模块/机箱和压力传感器的具体规格说明书及校准数据表，并据此配置DAQ系统设置：
      注：本文 中所用DAQ硬件的DAQ设置已在GitHub上公开。感兴趣的读者可访问以下地址获取代码库： https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON。
      1. 模拟输入：选择DAQ模块上连接压力传感器的物理输入通道。
      2. 激励源（Vex源）：指定DAQ模块的激励源类型（例如，内部或外部）。
      3. 激励电压（Vex值）：将Vex值设置为压力传感器制造商指定的数值（例如，5或10 V）。
      4. 电桥类型：选择与DAQ模块匹配的电桥类型（例如，全桥、半桥或四分之一桥）。
      5. 电桥电阻：将电桥电阻设置为压力传感器制造商指定的数值（例如，350 Ω）。
      6. 校准系数/自定义缩放：根据压力传感器制造商提供的校准数据表配置缩放参数。制造商通过施加已知的物理单位（psi）并测量相应的电信号单位（mV/V）来校准压力传感器。通过将已知的物理单位与测得的电信号单位作图，建立校准曲线。
      7. 采样率（Hz）：将采样率设置得足够高，以捕捉压力变化的动态过程，同时避免混叠现象（例如，根据实验中压力变化的速度，设置为1或10 kHz）。
        注：过压空气波形越窄（即压力变化越快），其激发的频率范围越宽，因此需要更高的采样率。这一点在涉及中枢神经系统（CNS）损伤模型的实验中尤为重要。
  3. 在DAQ软件中创建用于数据采集的数字工具。
    注：该数字工具将用于精确测量、记录、显示和分析系统的输出压力。本文 中使用的数字工具已在GitHub上公开。感兴趣的读者可访问以下地址获取代码库：https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.x
    1. 实现信号处理算法，对传感器输出的原始数据进行滤波、放大或其他处理。
    2. 添加分析工具，用于计算峰值压力、平均压力以及压力事件持续时间等指标。
    3. 集成可视化元素（例如，图表）以实时显示压力数据，并加入控制按钮以启动、停止和重置数据采集。
    4. 保存该数字工具。
  4. 测量系统的输出压力
    1. 将压力传感器插入X-Y平台上的厚夹具中，并将其筒体穿过动物固定装置上的孔（步骤1.10.3中制作）。
    2. 调整压力传感器的筒体，使传感器尖端精确定位于中枢神经系统（CNS）损伤部位。
    3. 使用两个塑料螺钉（步骤1.8.3中安装）固定压力传感器。
  5. 启动数据采集软件中的数字工具，同时释放彩弹枪的触发装置，以捕获、分析并可视化系统的输出压力。
  6. 调节调节螺钉，直至系统的输出压力达到所需水平。
    注：在将彩弹枪筒体修改为无开孔、长度1.5英寸、直径6.5 mm后，该系统能够在距离筒前端5 mm处稳定提供15–50 psi范围内的过压空气水平34。低于15 psi或高于50 psi的过压空气水平表现出较大的强度变异性。有关系统输出压力（psi）随输入压力（psi）、距筒距离（cm）和时间（ms）变化的全面展示，请参见Hines-Beard等人的图234。若需使用该系统可靠地获得高于50 psi的过压空气水平，应使用压缩氮气而非压缩空气。

3. 动物准备与超压空气暴露

  1. 将小鼠置于含有1.5-3%30,31,32,33异氟烷的氧气诱导室中进行麻醉，直至完全镇静。
    1. 通过捏压脚趾观察是否无反应来确认麻醉效果。
    2. 将小鼠固定在内层动物固定器中，使其头部和上部后肩通过矩形开口暴露，而背部和下肢保持遮蔽状态。
    3. 使用固定在内层动物固定器完整下段的垫片支撑小鼠头部。
    4. 用外科胶带穿过小鼠上部后肩将其固定。
    5. 将内层动物固定器插入外层动物固定器中。
    6. 打开次级麻醉气路，使异氟烷进入动物固定器内部。
    7. 在动物固定器末端放置额外垫片，防止麻醉气体从管路泄漏，并防止小鼠在受到超压气流冲击时移动。
  2. 超压气流递送
    1. 将外层动物固定器上的4 mm圆形开口精确对准小鼠左眼。
    2. 使用X-Y位移平台的控制旋钮调整动物固定器位置，使其开口与彩弹枪管对齐，且外表面距离枪管末端5 mm。
      注：通过调节动物与枪管末端的距离可改变超压气流水平（psi）和波形。将动物远离枪管可降低超压气流强度，并产生更弥散的超压气波。
    3. 启动超压气流程序以诱导ITON：
      1. 以0.5秒间隔连续递送两次15 psi超压气流，每日重复，持续3天29,30,31,32。
        ​注：通过递送三次间隔0.5秒的15 psi连续超压气流也可诱导类似的ITON23。在代表性结果中展示了递送六次间隔0.5秒的15 psi连续超压气流后所产生的ITON程度。
      2. 假手术组小鼠仅暴露于超压气流装置产生的噪音，但不接受实际超压气流冲击：将动物固定器旋转，使开口不再对准枪管，并使用纸板屏蔽阻挡气流。
  3. 小鼠恢复
    1. 让小鼠从麻醉中恢复。
      1. 给予润滑性眼药水（见材料表），防止麻醉期间眼睛干涩。
      2. 使用可控加热支撑装置提供保温（见材料表）。
    2. 持续观察小鼠，直至其能够维持直立姿势并正常行走。允许其与同笼小鼠共处。
    3. 对所有接受超压气流暴露的小鼠，在损伤后前3天提供凝胶状恢复饲料（见材料表），以防止体重下降。

4. 组织采集与处理

  1. 通过腹腔注射阿佛丁工作液处死小鼠。
    1. 通过混合10 g的2,2,2-三溴乙醇（见 材料表) 加入 10 mL 戊醇-1（见 材料表). 4 °C 避光保存。
    2. 通过将1.25 mL Avertin储备液、45 mL双蒸水和5 mL 10x PBS混合，配制Avertin工作液（参见 材料表) 加入50 mL离心管中。过滤除菌后避光保存于4 °C。
  2. 经心脏灌注小鼠4%多聚甲醛（见 材料表) 加入1×PBS中（参见 材料清单).
  3. 使用精细镊子摘除暴露于过压空气的眼球（参见 材料表）和剪刀（参见 材料表），确保保留视神经（ON）。
  4. 收集视神经及去核的眼组织以用于后续分析。
  5. 组织锇酸后固定。
    1. 在4%多聚甲醛和2%戊二醛中对组织进行后固定，过夜（见 材料表在1×PBS中。如果处理的是未经灌注的组织（如步骤4.2所述），则固定5天，而非过夜。
    2. 将ON组织转移至12孔或24孔板中（参见 材料表) 使用画笔以1×PBS冲洗（参见 材料表）或一根尖锐的木棍。
    3. 在通风橱中，将1×PBS替换为2%四氧化锇（见 材料表) 置于 0.2 M 卡可基酸盐缓冲液中（配方在 GitHub 上公开可查。感兴趣的读者可访问该代码仓库获取） 使用移液管将样本转移至 https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON) 并在冰上孵育 2 小时。
    4. 用1×PBS洗涤三次
      1. 妥善处理锇废液。
      2. 第三次 PBS 洗涤后，将培养板置于通风橱中静置两晚。
  6. 将组织在梯度乙醇中脱水过夜。
    1. 将神经转移至含有50%乙醇的新培养板中，孵育30分钟。
    2. 用70%乙醇替换，孵育30分钟。
    3. 用95%乙醇替换，孵育30分钟。
    4. 用100%乙醇替换，孵育30分钟。
  7. 将组织样本包埋于环氧树脂中。
    注意：Epon 配方在 GitHub 上公开提供。感兴趣的读者可访问以下网址获取该代码库：https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON；参见​材料清单 配方中所列材料。
    1. 第1天：将组织转移至含有丙烯酸甲酯的2 mL小瓶中（参见 材料表)/100% 乙醇（1:1）中，室温下振荡30分钟。弃去后加入纯环氧丙烷，振荡15分钟，重复一次。随后换为环氧丙烷/Epon（1:1），于4℃冰箱中振荡过夜。
    2. 第2天：将组织转移至含有100%环氧树脂的12孔或24孔板中，室温振荡4小时。更换新鲜的100%环氧树脂，于室温下真空环境中过夜孵育。
    3. 第3天：重复第2天的耳蜗孵育操作。
    4. 第4天：将组织转移至含有100%环氧树脂的平模中，重新调整组织方向，置于60 °C烘箱中孵育48 h。
  8. 组织切片
    1. 在解剖显微镜下将模具修整为双金字塔形，使神经位于中心。
    2. 使用超薄切片机和钻石刀采集700 nm厚的横截面（参见 材料表).
    3. 使用蒸馏水将切片收集到带电荷的白色玻璃显微镜载玻片上。
    4. 将载玻片置于60 °C烘箱中干燥至水分蒸发，室温冷却。
  9. 对组织进行染色。
    1. 将载玻片浸入1%对苯二胺（PPD）中（参见 材料表在甲醇与2-丙醇的1:1混合液中孵育28分钟。
    2. 将载玻片依次浸入两份1:1甲醇（参见 材料表）和2-丙醇（参见 材料表每次1分钟。
    3. 将载玻片在100%乙醇中冲洗1分钟，然后自然晾干。
    4. 将载玻片置于湿盒中，并用1%甲苯胺蓝覆盖组织切片（参见 材料表使用移液管转移。
    5. 在60 °C的烘箱中孵育20分钟。
    6. 用双蒸水冲洗载玻片，然后自然晾干。
  10. 在组织上固定并成像。
    1. 使用封片剂（见方法表）封片，去除多余封片剂。
    2. 让载玻片过夜干燥。
    3. 使用100倍油镜在明场显微镜下获取的图像横截面。
  11. 包埋、切片及免疫组织化学染色视网膜组织。
    1. 将整个眼球组织在4%多聚甲醛中固定2-4小时。
    2. 用30%蔗糖对整个眼球组织进行冷冻保护（参见 材料表 在4 °C下于1x PBS中孵育过夜。
    3. 将眼组织包埋于冷冻介质中（参见 材料表).
    4. 在冷冻切片机上采集10-μm厚的视网膜横切面，并将切片贴附于带正电荷的白色玻璃显微镜载玻片上（参见 材料表).
    5. 用1×PBS洗涤载玻片，并在封闭缓冲液（5% Triton X-100和2%牛血清白蛋白（BSA））中孵育（参见 材料表) 置于含5%正常驴血清（NDS）的1×PBS中孵育（参见 材料表室温下孵育 30 分钟。
    6. 4 °C 下孵育载玻片过夜（或室温孵育 4 小时），加入一抗（参见 材料表) 在 0.5% Triton X-100 中（参见 材料表) 置于 1×PBS 中（PBT).
    7. 用PBT洗涤载玻片，并在二抗中孵育（参见 材料表) 在含 5% NDS 的封闭缓冲液中。
    8. 用PBT洗涤载玻片，加入含DAPI的封片剂（参见 材料表），盖上盖玻片，用指甲油封固。
    9. 在落射荧光显微镜下观察图像切片。
    10. 若需定量分析荧光强度，应确保图像来自相同的视网膜区域，并采用相同的放大倍数、增益和曝光设置。
  12. 计数ON轴突。
    1. 使用图像分析软件手动计数轴突数量（参见 材料表) 通过使用固定网格叠加法采样神经总横截面积的20%，以估算轴突密度（轴突数/mm²）2).
    2. 测量视神经横截面的面积。
      1. 使用 设定比例尺 用于设置成像物镜的像素/微米参数。
      2. 使用 多边形选择 用于沿视神经髓鞘追踪并排除血管结构的工具。
      3. 使用以下方法测量ON的面积： 测量 功能。
      4. 将测量得到的面积乘以0.2，确定总面积的20%。
    3. 将固定网格覆盖在ON横截面上。
      1. 下载计数阵列插件。
        注意：该插件在 GitHub 上公开提供。感兴趣的读者可访问以下网址获取代码库： https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON
      2. 打开计数阵列插件，在横截面上叠加一个固定的网格，该网格由9个均匀分布的正方形组成，排列成十字形。
      3. 将总视神经横截面积（在步骤 4.6.2.4 中计算得出）的 20% 除以 9，得到每个 9 个区域的校正面积。
      4. 将固定的网格居中放置，使十字标记的中心位于ON横截面的正中央。
    4. 分别计数存活轴突和变性轴突。
      1. 下载并打开细胞计数插件。
        注意：该插件在 GitHub 上公开提供。感兴趣的读者可访问以下网址获取代码库： https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON 
      2. 针对9个区域中的每一个区域，通过观察髓鞘的状态，分别计数存活和变性的轴突轮廓数量。在对动物实验分组设盲的条件下进行轴突定量分析，以避免偏倚。
      3. 对于活体轴突，应寻找那些髓鞘完整、染色均匀，并平滑且均匀地环绕轴突的样本。
      4. 对于变性的轴突，应观察其髓鞘是否出现增厚、洋葱样变或塌陷。
      5. 如果轴突被重叠的网格部分切断，仅当观察到管腔时，才将其计入轴突数量。
      6. 确保长椭圆形的轴突不会被重复计数，且不要将碎片或灰尘误认为是退变的轴突轮廓。
    5. 进行统计分析，以检验各组间平均轴突数量的显著性差异。每组应至少包含四条视神经（ONs），以涵盖既往分析中观察到的正常变异。
      1. 进行独立样本t检验（也称为学生t检验） t采用独立样本t检验（independent samples t-test）评估两个独立组别均值之间的显著性差异。
      2. 如果独立样本 t 检验的条件无法满足（例如，数据不符合正态分布或样本量过小），则应执行其非参数替代方法——曼-惠特尼 U 检验。

结果

采用此处所述的超压空气产生系统，通过将成年（3月龄）雄性C57Bl/6小鼠（n = 4）的左眼暴露于6次连续的15 psi超压气流冲击（每次间隔0.5 s）来诱导间接性创伤性视神经病变（ITON）。假手术动物（n = 8；数据来自Vest等33）接受麻醉后置于动物固定装置中，暴露于声音但不接受超压气流。

假手术动物的近端视神经（图3A）显示结构健康，轴突密集排列且大小均匀，周围胶质细胞形态和分布正常。相比之下，暴露于ITON（即连续6次15 psi正压气流冲击，每次间隔0.5秒）的小鼠近端视神经（图3B）出现退行性改变，表现为轴突丢失（如残余轴突间间距增大）、轴突变性（包括肿胀、轴突形态不规则以及髓鞘破裂）以及胶质增生（包括胶质细胞肥大和增生）。Mann-Whitney U 检验证实，ITON组与假手术组在总轴突数量（p = 0.0040）（图3C）和退变轮廓数量（p = 0.0028）（图3D）上均存在显著差异。这些结果表明，ITON显著减少了总轴突数量，并显著增加了退变轮廓的数量。由于ITON组样本量不足以进行独立样本t检验，因此采用Mann-Whitney U 检验进行分析。

使用抗Iba1抗体（见材料表）对视网膜横切面进行免疫组织化学染色，该抗体是小胶质细胞（中枢神经系统的固有免疫细胞）的标志物，实验在假手术组（图4A）和ITON组（图4B）小鼠中均进行。染色结果显示，所有小鼠的小胶质细胞均处于静息状态，表现为细胞体较小，具有细长且高度分支的突起。值得注意的是，在ITON小鼠中观察到小胶质细胞数量增加（图4B），提示小胶质细胞在损伤后发生了增殖。此外，在ITON小鼠中，小胶质细胞异常地延伸至外核层（ONL），即光感受器细胞胞体所在的位置（图4B）。相比之下，在假手术组动物（图4A）中，小胶质细胞仅定位于节细胞层（GCL）、内丛状层（IPL）、内核层（INL）和外丛状层（OPL），这些正是健康未受损视网膜中小胶质细胞通常分布的层次。

随后使用抗PKC-α（见材料表）和抗突触素（见材料表）进行免疫组织化学染色，这两种标记物分别用于视杆双极细胞和光感受器带状突触，结果显示假手术组（图5A）和ITON小鼠（图5B）均存在完整的突触连接。具体而言，视杆双极细胞的树突被观察到延伸并与视杆光感受器的突触终末重叠。该结果与早期一项研究35形成对比，该研究显示，在连续两天每天接受两次15 psi超压气流冲击（间隔0.5秒）后，ITON四周时视杆双极细胞的树突向胞体方向回缩。这种差异可能归因于两项研究之间组织取材时间点的不同：本研究样本采集于ITON后2周，而先前研究则采集于ITON后4周。尽管在本研究分析中未检测到突触病变，但我们注意到小胶质细胞突起延伸至外核层（图4B），即光感受器胞体所在区域。这一观察提示，双极细胞与光感受器之间突触连接的破坏可能是损伤的继发效应，而轴突丢失、轴突变性和胶质增生则构成损伤的主要效应。

带有气罐、调压器和发射组件的彩弹枪装置示意图；已标注各部件。
图1：用于局灶性封闭系统中枢神经系统损伤的装置。 上方图像中的虚线矩形区域被放大，并在下方两张图中分别显示为 B、C 和 A（以白色箭头标示）。（A）彩弹枪末端定制的1.5英寸无孔枪管（I）。（B）压力调节器，已移除导向帽以露出调节螺钉（II）。（C）进弹口，已移除重力进弹装置并安装进弹口盖（III）。（D）基座平台，由一块1.5英尺×1.5英尺的纤维板组成，置于另一块较大的2.5英尺×1.5英尺纤维板之上。（E）压缩空气罐连接至彩弹枪的压力调节器，并使用耐用绑带固定在纤维板平台上。（F）x-y轴动物定位台。请点击此处查看该图的放大版本。

用于材料应力分析的力学测试装置；包括样品夹具和力施加系统。
图 2：用于局部输送过压空气的定制动物固定装置。（A）动物固定装置内部，由一根较窄的PVC管构成，管上有一个矩形孔（3 × 5 cm），用于暴露动物的头部和上背部肩部区域。（B）动物固定装置外部，由一根较宽的PVC管构成，较窄的PVC管可滑入其中，从而遮蔽动物全身，仅使暴露孔径内的组织暴露在外。（C）用于向目标中枢神经系统损伤部位局部输送过压空气的暴露孔径。（D）压力传感器，用于校准系统的输出压力。请点击此处查看该图的放大版本。

轴突变性研究：假手术组与ITON组的显微镜图像，柱状图比较轴突总数和变性轴突形态。
图3：由于局部施加高压空气导致的间接性创伤性视神经病变（ITON）。（A,B）近端视神经横切面的代表性明场显微图像，分别来自（A）假手术组和（B）ITON组。（C）总轴突数量的定量分析。（D）变性轴突形态的定量分析。n = 4（ITON组），n = 9（假手术组）。假手术组的轴突计数数据来自Vest等人的研究33。**p < 0.005。误差线表示标准差。比例尺 = 20 μm。缩写：ITON = 间接性创伤性视神经病变（indirect traumatic optic neuropathy）。请点击此处查看该图的放大版本。

经Iba1（红色）和DAPI（蓝色）染色的视网膜共聚焦显微镜图像，显示GCL、INL和ONL各层。
图4：因系统诱导的ITON导致小胶质细胞异常增殖并迁移至ONL。（A,B）视网膜横切面的代表性荧光显微图像，显示使用抗Iba1标记的小胶质细胞（红色），其中（A）为假手术动物，（B）为ITON动物。比例尺 = 100 μm。缩写：ITON = 间接性创伤性视神经病变；GCL = 节细胞层，INL = 内核层，ONL = 外核层。请点击此处查看该图的放大版本。

免疫荧光显微镜；突触素，PKC-α，DAPI；视网膜组织；细胞结构。
图 5：尽管可能存在延迟性突触病变，系统诱导的ITON仍导致视杆双极细胞与光感受器之间的突触连接早期保留。 （A，B） 视网膜横切面的代表性荧光显微图像，显示使用抗突触素抗体标记光感受器带状突触（红色），以及使用抗PKC-α抗体标记视杆双极细胞（绿色），分别来自（A）假手术组和（B）ITON动物模型。比例尺 = 100 μm。缩写：ITON = 间接性创伤性视神经病变；PKC = 蛋白激酶C。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

这种定制的超压空气系统是研究小鼠模型中封闭式中枢神经系统损伤的有用工具。示例实验的代表性结果表明，利用该系统进行局部超压空气递送可有效诱导视网膜神经节细胞轴突损伤（ITON），导致显著的轴突丢失和变性。这凸显了该系统在产生精确且可重复的中枢神经系统损伤方面的能力。

该系统的一个主要优势在于其可定制性，能够诱导多种中枢神经系统（CNS）损伤。通过调节系统的总输出压力、利用X-Y定位平台调整动物与枪管末端的距离、改变暴露孔径的大小和形状、调整高压气流暴露次数以及各次暴露之间的间隔时间，即可调节损伤的严重程度。此外，通过改变动物固定装置中暴露孔径的位置，还可调控中枢神经系统损伤的部位。这种灵活性使得该系统能够在小鼠模型中产生一系列闭合式中枢神经系统损伤。最初，该系统用于模拟闭合性眼球损伤，重点关注眼前段和眼后段的损伤及相关功能缺损34,36，包括免疫系统反应的影响37、不同品系特异性结果38以及神经保护剂的疗效39。随后，该应用进一步扩展至评估反复定向眼部暴露所导致的继发性损伤，以模拟间接性创伤性视神经病变（ITON）30，并探究重复暴露次数及暴露间隔对损伤的影响33。此后，该系统的应用范围进一步拓展，通过定向头部暴露模拟闭合性轻度创伤性脑损伤（mTBI）40,41，以及通过背部定向暴露模拟闭合性脊髓损伤（SCI）42，充分体现了该设备在研究多种中枢神经系统损伤领域中的适应性和多功能性。

使用该系统时，必须采取措施尽量减少损伤结果的变异性，以确保实验结果的可重复性和可靠性。关键措施包括：在每三组暴露实验前后校准系统的输出压力水平，以确保压力传递的一致性。尽管在使用压缩空气时，当系统工作压力介于15 psi至50 psi之间，其变异性较低34，但持续校准有助于发现意外错误，例如电池电量不足或气源压力过低。此外，应将每只动物置于距炮管末端相同距离的位置，以确保过压强度一致，因为压力波的强度随距离增加而衰减。统一的定位还可确保每只动物受到空气波相同部分的冲击。同时，在固定装置中以一致方式固定动物，可确保目标组织被稳定靶向，尤其在重复暴露模型中，可降低动物移动的风险。最后，动物的年龄、性别和遗传背景的一致性至关重要，因为这些因素会影响其对损伤的反应。例如，先前使用该系统的研究所比较了定向眼部过压空气对不同小鼠品系的影响，揭示了C57Bl/6J36、DBA/2J37和Balb/c38小鼠在损伤反应方面的显著差异。其中，DBA/2J和Balb/c小鼠表现出更严重的前极部病理变化、更显著的视网膜损伤、更高的氧化应激水平以及更强的神经炎症反应，而Balb/c小鼠的损伤特征尤为明显且持续时间更长38。

系统故障排除
如果在给定压力表设定值下压力值异常偏低，请扣动扳机5-10次，使空气流经系统，让调压器调整至新设定值。气罐不得有任何泄漏。气罐上的O形圈不得损坏或磨损，气罐应有足够空气，且喷枪电池不应耗尽。X-Y平台不应偏离枪管末端的常规位置，过压空气暴露孔应与枪管对齐，不得遮挡枪管。调压器应牢固地固定在喷枪握把上。如果即使使用压力表的最高设定值压力仍过低，则压力表设定值不得超过200 psi，此时应将喷枪的速度调节至最大设定值。如果压力设定不稳定（例如时高时低），请确保气罐有足够的空气，调压器已牢固固定在喷枪握把上，气罐无泄漏且已拧紧，且气罐上的O形圈无损坏或磨损。

为了全面理解该系统的全部能力，必须认识到其局限性。在实验室环境中模拟真实世界场景仍然具有挑战性。尽管该系统可产生超压气流，但它无法复制爆炸事件的复杂动力学特征，例如变化的压力和温度梯度、碎片的存在、反射波以及多相性等。此外，该系统并未模拟Friedlander波形（"primary blast wave"），后者的特点是压力迅速上升至接近瞬时的峰值，随后快速呈指数衰减，并在恢复至基线前短暂低于环境压力43。相反，该系统产生的波形更为简单且对称，表现为压力上升和下降较为平缓，且无明显的负压相（见Hines-Beard等34中的图2C）。从某种程度上说，这种波形结合了冲击伤和钝挫伤的部分特征。这种钟形的"压力脉冲"产生一致的超压冲击，类似于一股"空气墙"撞击受试对象。然而，该压力波所传递的超压气流本身也是冲击伤的关键特征之一。有人可能认为，尽管该波形包含了两种损伤类型的某些特征，但并未完全再现其中任何一种的复杂性。然而，这种稳定且可重复的"压力脉冲"非常适合在实验室条件下进行受控实验，以研究局灶性闭合系统中枢神经系统损伤。我们此前已证实该损伤具有局灶性特征。例如，单眼暴露不会导致鼻腔主要上皮或脑组织损伤44；当压力波作用于小鼠头部侧面时，仅影响脑部很小区域45；最后，在ITON所用压力水平下，该系统产生的超压气流除非在短时间内重复施加，否则不会对小鼠造成影响33。因此，单次压力暴露本身无损伤性，因而不模拟喷射末端力的作用。此外，即使反复对眼睛施加超压气流，也不会影响眼前段结构33。只有当暴露间隔小于1分钟并反复暴露时，才会出现显著的视神经退变和视力丧失33。

与其他用于制造封闭系统中枢神经系统（CNS）损伤的实验设备相比，该系统具有独特的优势。它能够在极短时间内连续产生多次超压气流脉冲（间隔0.5秒）33，从而模拟高风险职业环境中常见的快速重复爆炸暴露条件。例如，军事人员在训练和实战中会使用多种可快速连续发射的自动武器，包括自动步枪（如M16、AK-47）、机枪（如M2 0.50英寸口径）、加特林机枪和迷你枪。此外，军方还使用一些发射频率较慢但仍具重复性的武器，如火炮、迫击炮、手榴弹以及简易爆炸装置（IEDs）。从事受控拆除作业的爆破工人以及在采矿过程中通过爆破破碎岩石、提取矿物的矿工，也会经历快速连续的爆炸冲击。最后，使用气动工具、打桩机或其他能产生强烈冲击力重型设备的建筑工人，也可能遭受类似爆炸暴露的快速重复冲击。值得注意的是，诸如激波管等设备无法实现超压气流的快速连续释放，因为每次爆炸后都需要进行复杂的重新配置或再加压操作。激波管依靠隔膜破裂来产生激波，每次破裂后都必须更换隔膜，这一过程耗时较长：需要打开激波管，移除已破损的隔膜，安装新的隔膜，并等待系统复位和重新加压。因此，对于研究快速重复爆炸暴露后中枢神经系统损伤的实验而言，无需在每次爆炸后进行复杂重置或再加压的系统更为理想。

该调节式、用户友好且成本效益高的系统具有广阔的应用前景。利用其可调节和独特的特性，该系统为未来的临床前治疗研究开辟了多个有前景的方向。其能够递送快速、连续的超压气流脉冲，可用于研究重复性爆炸暴露的累积效应，这对于理解慢性创伤性脑病及其他长期神经退行性疾病具有重要意义。此外，该系统还可用于探索各种药理学干预措施在减轻闭合性中枢神经系统损伤方面的有效性，包括确定神经保护药物的最佳给药时机与剂量，以明确最佳治疗时间窗。同时，该系统在模拟钝挫伤和爆炸伤机制方面的精确性，使得构建能够反映真实场景中个体所经历的复杂创伤的综合性损伤模型成为可能。这有助于测试针对损伤共性病理过程的多模式疗法，例如炎症、氧化应激和神经元死亡等。总体而言，该装置为深入理解闭合性中枢神经系统损伤以及开发有效的治疗干预手段提供了一个多功能且强大的研究平台。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院眼科研究所（NIH NEI）P30 EY008126基金、再生医学波托茨尼克发现奖、退役少将斯蒂芬·L·琼斯医学博士基金以及防盲研究公司（Research Prevent Blindness, Inc）无限制基金（VEI）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-戊醇Fisher ScientificAC160600250用于配制Avertin溶液 
2,2,2-三溴乙醇Sigma AldrichT48402用于配制Avertin溶液 
带盖24孔板VWR76520-63424孔板
2-丙醇 Fisher ScientificA451-1 
50 kS/s/通道桥接模拟输入模块 National InstrumentsNI-9237DAQ模块
牛血清白蛋白V组分（BSA） Research Products International A30075BSA
抗Iba1一抗（山羊多克隆） Abcam ab5076小胶质细胞标记物，使用浓度为1:500 
抗突触素一抗（小鼠单克隆） Abcam ab8049光感受器带状突触标记物，使用浓度为1:20
Araldite GY 502 Electron Microscopy Sciences10900
卡考基酸缓冲液Electron Microscopy Sciences11652
活性炭过滤罐E-Z SystemsEZ-258收集麻醉废气
Clear H20 DietGel 76AClear H2O 72-07-5022爆炸后使用，辅助动物恢复
CompactDAQ机箱National InstrumentsUSB-9162DAQ机箱
压缩空气A-L GasGSMCA300 用于重新充填加压空气罐
含DAPI的Fluoromount-G Southern Biotech含DAPI的封片剂
金刚石刀Micro Star Technologies, Group of Bruker Nano, Inc. 用于切取视神经，3 mm/45度/Style H 
驴抗山羊IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 594Invitrogen (供应商：Fisher Scientific)A-11058小胶质细胞二抗，使用浓度为1:200
驴抗小鼠IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 594Invitrogen (供应商：Fisher Scientific)A-21203光感受器带状突触二抗，使用浓度为1:200
驴抗兔IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488Invitrogen (供应商：Fisher Scientific)A-21206视杆双极细胞二抗，使用浓度为1:200 
驴血清 Sigma Aldrich D9662NDS
Dumont #3镊子Fine Science Tools11231-30用于完整眼球摘除的精细镊子 
乙醇（200 proof） KOPTEC (供应商：VWR) 89125-188乙醇 
Fluoromount-G Invitrogen (供应商：Fisher Scientific)00-4958-02封片剂
GenTeal Tears眼用凝胶Covetrus72359眼部润滑剂，防止麻醉期间或之后眼睛干燥 
戊二醛Electron Microscopy Sciences16200
1000 mL量筒Fisher Scientific08-572G
250 mL量筒Fisher Scientific08-572E
500 mL量筒Fisher Scientific08-572F
加热垫 Braintree ScientificAP-R 26E可控加热支撑装置
高压充气站Ninja PaintballHPFSV2用于重新充填加压空气罐
ImageJNational Institutes of Health 图像分析软件
Invert MiniEmpire Paintball彩弹枪
异氟烷Covetrus29405吸入性麻醉剂
异氟烷蒸发器VetEquip901806动物麻醉设备
Masterflex泵Cole-Parmer用于动物灌注
甲醇 Sigma Aldrich322415-2L 
显微镜载玻片Globe Scientific1358W白色玻璃显微镜载玻片
NI测量与自动化浏览器（NI MAX） National Instruments用于配置DAQ系统设置的软件
NI-DAQmx驱动程序 National Instruments与DAQ系统通信的驱动程序 
Nikon Eclipse Ni-E显微镜Nikon Instruments
2%四氧化锇Electron Microscopy Sciences19152
32%多聚甲醛Electron Microscopy Sciences15714-S将PFA稀释至4%
对苯二胺 Sigma AldrichP6001
PBS（10x），pH 7.4Thermo Fisher Scientific70011044将PBS稀释至1x
环氧丙烷 Electron Microscopy Sciences20401
PROV3 48 L，48 in³ 铝制3000 psi额定气罐Ninja Paintball加压空气罐
Pyrex可重复使用培养基储存瓶1000 mLFisher Scientific06-414-1D
Pyrex可重复使用培养基储存瓶500 mLFisher Scientific06-414-1C
Pyrex可重复使用培养基储存瓶250 mLFisher Scientific06-414-1B
重组抗PKC-α一抗（兔单克隆） Abcam ab32376视杆双极细胞标记物，使用浓度为1:500 
Resin 812Electron Microscopy Sciences14900
Series TJE压力传感器，100 psi Honeywell 060-0708-10TJG选择压力传感器时应考虑量程，以优化测量分辨率 
蔗糖Sigma AldrichS5016
Super TJE压力传感器，7500 psi Honeywell 选择压力传感器时应考虑量程，以优化测量分辨率 
注射器/针头组合Covetrus 60728用于腹腔注射的注射器/针头
Tissue-Plus OCT包埋剂Fisher Scientific23-730-571 冷冻介质 
甲苯胺蓝Fisher ScientificBP107-10
吐温X-100Sigma AldrichT8787
UniSlide XY载物台Velmex AXY40 SeriesXY定位平台 
University画笔 - 233系列，圆形，000号Winsor and Newton 画笔
Vannas弹簧剪刀 - 2.5 mm切割刃Fine Science Tools15000-08用于完整眼球摘除的剪刀
虚拟仪器National Instruments 用于数据采集软件的数字工具 

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