本文介绍了一种在取卵后快速去除部分卵丘-卵母细胞复合体的优化方法，可加速体外受精（IVF）的观察过程，缩短颗粒细胞去除所需时间，减少卵母细胞对外界环境的暴露，且不影响胚胎发育，从而提高IVF实验室操作的效率。
方法文章
卵丘-卵母细胞复合体的即时部分去除：一种用于快速观察体外受精的优化方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
尽管体外受精（IVF）的临床与实验室技术已迅速发展，仍有相当比例（10%–15%）的患者持续面临受精障碍，导致受精率低下并产生无法存活的胚胎。短期受精是指在取卵后早期去除颗粒细胞，以观察第二极体的排出，从而评估受精情况，并及时采取补救措施以应对低受精率或完全受精失败。然而，体外受精中短期受精的观察仍面临诸多挑战，例如未处理的卵丘-卵母细胞复合物聚集体过大、卵子之间相互黏连，导致颗粒细胞去除需依赖复杂的外部操作，且观察时间延长。为解决这一问题，本研究提出一种在取卵后立即部分去除颗粒细胞的方法。该方法可简化后续短期受精及传统受精监测的各个步骤，缩短卵母细胞极体排出的观察时间，减少外界环境对卵母细胞的影响，并降低错过关键受精观察窗口的风险。因此，本研究提供了新的临床证据，旨在提高体外受精胚胎实验室的操作效率。
引言
在体外受精-胚胎移植（IVF-ET）领域，典型的受精率通常在60%至80%之间1。然而，约有4%至16%的病例会出现完全受精失败或受精率偏低的情况，且难以预测2,3。为了提高临床妊娠率，并减少完全不受精和低受精的发生，IVF过程中采用短时受精的方法正逐渐增多4。该方法包括及时去除颗粒细胞，以观察第二极体的排出情况，评估受精状态，并可能实施补救性卵胞浆内单精子注射（ICSI）。在短时受精过程中，卵母细胞-卵丘细胞复合体（OCCC）与卵母细胞之间的结合比传统的过夜受精更为紧密，从而增加了OCCC去除的难度5。卵母细胞数量过多、OCCC复合体较大或卵母细胞间存在黏连等因素，可能导致短时受精期间颗粒细胞去除时间延长，进而使卵子在培养箱外停留的时间增加4。为了优化受精观察时间，在取卵后已设计出一种改良方法，即对OCCC复合体较大的卵母细胞进行部分颗粒细胞切除。该技术有助于保留围绕卵母细胞的颗粒细胞，维持早期卵母细胞结构的完整性6，并使这些细胞继续为卵母细胞成熟及后续的受精-胚胎发育提供重要因子7。
因此，本研究以在生殖医学中心接受体外受精-胚胎移植（IVF-ET）治疗的患者作为研究对象，旨在探讨采用即时部分颗粒细胞机械去除法对短期受精及过夜受精监测过程的操作时长的影响，同时评估正常受精率及晚期胚胎发育结果。本研究旨在为优化体外受精胚胎实验室操作流程提供有价值的参考依据。
方案
所有操作均按照梅州市人民医院生殖医学科的标准操作规程进行，并经该科室伦理委员会审查批准。每位参与的夫妇均签署了书面知情同意书。研究纳入了首次接受体外受精（IVF）周期治疗并进行卵裂期或囊胚期胚胎移植的患者，以及年龄在20至45岁之间的女性。排除标准包括使用供体卵子或精子，以及存在特定疾病情况，如先天性或继发性子宫异常（例如纵隔子宫、单角子宫、双子宫）、腺肌症、子宫黏膜下肌瘤，或在胚胎移植当日子宫内膜厚度低于7 mm。2023年12月至2024年2月期间共招募115例患者，根据是否在移植时立即部分清除卵丘-冠状复合物（OCCC），将患者分为两组。
1. 取卵前的准备
- 将卵母细胞拾取皿（材料表）置于37 °C培养箱中过夜。
- 将12 mL卵泡操作培养基（材料表）加入14 mL圆底试管中，于37 °C培养箱中过夜孵育。在卵母细胞采集前30分钟，将试管转移至预热的试管架中。
- 准备卵泡操作培养基：取9 mL卵泡操作培养基加入一个14 mL圆底试管（材料表）中，于37 °C过夜孵育。在卵母细胞采集当天，将4.5 mL该培养基转移至已预孵育的卵母细胞拾取皿（材料表）中，并覆盖2 mL 100%石蜡油。
- 准备OCCC冲洗液：取4.5 mL受精培养基（材料表）加入卵母细胞拾取皿中，于37 °C过夜孵育。
- 准备受精培养基：取1 mL受精培养基加入一个6 cm培养皿中（材料表），表面覆盖100%石蜡油，于37 °C过夜孵育。
- 准备玻璃巴斯德吸管（材料表）：将吸管尖端在酒精灯上灼烧约5秒，使其轻微钝化并圆滑（图1）。在巴斯德吸管尖端连接吸头，确保其可接触培养皿底部而不产生刮擦。用卵泡操作培养基冲洗玻璃巴斯德吸管和10 cm培养皿。
2. 卵母细胞采集及卵丘-卵母细胞复合体（OCCC）的立即部分去除
注意：在卵母细胞分离和OCCC去除过程中使用体视显微镜。为获得最佳效果，所有操作应在带有温度控制（37 °C）的加热台上进行，并在卵母细胞采集前30分钟将所有设备预热。
- 根据欧洲人类生殖与胚胎学会（ESHRE）的建议，在取卵过程中收集排卵前卵泡液8。
- 简要步骤：在经阴道超声引导下，使用17 G穿刺针进行卵母细胞采集，适宜的负压范围为120–140 mmHg。
- 将收集到的卵泡液倒入14 mL圆底试管中，再转移至10 cm培养皿（材料表），保持液体深度小于0.5 cm。将培养皿置于恒温平台（37 °C）上。
- 在体视显微镜下观察卵丘-卵母细胞复合体（OCCC），确认卵母细胞的存在并评估其成熟度。
注：卵母细胞的成熟度依据卵丘细胞的形态以及某些卵母细胞结构的可见性进行评估9。 - 使用钝头巴斯德吸管吸取OCCC。将10 cm培养皿倾斜约15度，并将所有较大的OCCC铺展开。避免吸取卵母细胞及其周围2500 µm半径范围内的颗粒细胞。沿纵向使用巴斯德吸管切除多余的颗粒细胞（图2）。具体步骤如下：
- 先用肉眼观察卵泡液中是否存在灰白色半透明的黏液样团块。若未发现，立即在体视显微镜下从外向内顺时针旋转寻找该团块，即OCCC。
- 确认OCCC中是否存在卵母细胞，并初步评估其成熟度。
- 随后，预先准备好经火焰抛光成圆形的硅化吸管，用此巴斯德吸管吸取OCCC；同时，用持握10 cm培养皿的手的无名指轻轻抬起培养皿的9至10点钟方向，使培养皿向左倾斜约15°（将无名指置于培养皿下方即可获得所需角度）。
- 在培养皿11点钟方向吐出已吸取的OCCC，并轻轻向右水平拉长。然后观察拉伸后OCCC周围颗粒细胞的大小。接着，在水平拉长后的OCCC合适位置，使用巴斯德吸管从上至下快速而轻柔地垂直切割多余的颗粒细胞。
- 将切割后的OCCC转移至含有OCCC冲洗液的收集培养皿中。将剩余的卵泡液倒入无菌样品容器（材料表）。重复上述步骤，直至所有复合体均被收集完毕。
3. 精液处理与体外受精
- 在取卵当天早晨通过射精法采集精液样本。依据世界卫生组织（WHO，2010）标准10，在光学显微镜下评估精子浓度、活力和形态。随后将精子沉淀转移至新的离心管中，用受精培养基洗涤两次11。置于6% CO2、37 °C条件下孵育，备用。
- 取卵后约2-3小时，在受精培养皿（材料表）中，将卵丘-卵母细胞复合体（OCCC）与每毫升1×105至3×105个活动精子在单个液滴中进行受精。向受精培养皿中加入6-8个OCCC及1 mL受精培养基。
注意：洗涤去除黏性物质后的OCCC，使用巴斯德吸管转移至受精培养皿中。每次释放一个OCCC，在释放下一个之前，应轻柔地将吸管提离液面，确保每个OCCC单独放置于培养皿中，防止聚集。
4. 去除卵丘细胞
- 对于短期受精，遵循以下步骤操作：
- 将卵丘-卵母细胞复合体（OCCC）与精子共同孵育4-6小时。孵育后，通过机械方法去除包围卵母细胞的卵丘细胞。
- 使用内径略小于卵母细胞的移液管吸取卵母细胞，以确保完全去除卵丘细胞。
- 通过观察是否存在两个极体来确认受精情况。出现第二极体的卵母细胞被视为已受精。
- 将未出现第二极体的情况识别为受精失败，需进行补救性卵胞浆内单精子注射（ICSI）。
- 对于常规受精，在共同孵育18-20小时后，使用移液管去除卵丘细胞以评估受精情况。
5. 胚胎培养
- 取卵后将受精卵培养并监测3-5天。在授精后20小时评估受精情况，以确定原核数目。随后将每个受精卵单独培养于培养液滴中，并在受精后将胚胎转移至卵裂期培养液中。
注意：理想的第3天胚胎应包含六个或更多大小均等的卵裂球，且碎片率应小于或等于10%12。 - 是否进行囊胚培养取决于患者的意愿及具体情况，例如第3天获得的胚胎数量和质量。将第3天的胚胎转移至囊胚培养液中，并在第5天进行评估。采用Gardner评分系统对囊胚进行评价，高质量囊胚的评分为≥ 4 BB13。
6. 结果测量与统计分析
- 连续数据以均值 ± 标准差表示，有序数据以比例表示。使用适当的数据分析软件（此处为 IBM SPSS Statistics）进行统计分析，采用学生 t 检验或卡方检验。将显著性水平定义为 P < 0.05，具有统计学意义。
结果
在进行短时共孵育的组别中，接受补救措施的患者被排除。在47例接受短时受精的患者中，患者的年龄和获卵数方面未观察到显著差异（表1）。对卵丘-冠状复合体（OCCC）进行部分即时去除后，卵母细胞周围残留的OCCC结构变得松散（图3），从而有利于第二极体的观察。与对照组相比，OCCC部分去除组的平均操作时间显著缩短（4.42 ± 1.68 min vs. 9.29 ± 5.04 min，P < 0.001），尽管两组在卵裂率、优质胚胎率和优质囊胚率方面均未发现显著差异。
在另一组接受传统治疗的68例患者中 体外 体外受精（IVF），在授精后18-20小时进行受精情况检查，两组患者在年龄及获卵数方面具有可比性表 2）。在取卵过程中接受卵巢巧克力囊肿立即部分切除术的患者中，观察到卵母细胞周围颗粒细胞结构的疏松程度增加。图4). 尽管在部分切除OCCC组中观察到略短的平均手术时间（4.93 ± 0.80 分钟 vs. 6.54 ± 7.77 分钟， P = 0.207），无统计学显著差异。尽管在某些情况下，紧密的黏连可能导致观察操作时间延长至超过40分钟，但OCCC在大多数样本经 overnight 储存后通常黏连较松，这可解释两组间手术时间缺乏统计学差异的原因。与先前组别类似，卵裂率、优质胚胎率及优质囊胚率均未发现显著差异。
总体而言，代表性结果表明，在短期受精操作中，立即部分去除卵丘细胞复合物（OCCC）可显著缩短操作时间，且不影响关键的体外受精（IVF）结局指标，如卵裂率、优质胚胎率和优质囊胚率。该技术通过松解卵母细胞周围残留的OCCC，有助于更易观察第二极体，这可能是操作时间缩短的原因之一。在传统IVF操作中，尽管立即部分去除OCCC也呈现出缩短操作时间的趋势，但差异无统计学意义，可能与过夜保存后卵丘细胞黏附程度存在固有的个体差异有关。这些结果提示，立即部分去除OCCC可在短期受精操作中提高操作效率，但在传统IVF时间流程中的影响可能较不明显。
图1：使用酒精灯制备巴斯德移液管。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：需要处理的卵巢透明细胞癌（OCCC）典型图像。 来自（A 和 B）两位患者的典型卵母细胞，其直径超过 2.5 mm，沿标示的红色虚线进行了部分切除。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：共孵育精子后4-6小时受精过程的典型显微图像，显示其形态学特征。典型的卵母细胞（A）带有或（B）未进行卵丘-冠状复合体部分去除。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：精子共孵育后 18–20 小时原核形态特征评估的典型显微图像。典型卵母细胞（A）保留部分卵丘-冠状复合体（OCCC）或（B）未保留部分卵丘-冠状复合体。 请点击此处查看该图的放大版本。
| OCCC组部分切除组 | 对照组 | p值 | |
| 患者人数（n） | 26 | 21 | |
| 年龄（岁） | 32.04 ± 4.11 | 33.33 ± 3.41 | 0.193 |
| 获卵数（个） | 12.85 ± 9.02 | 11.38 ± 5.32 | 0.493 |
| 4小时操作时间（分钟） | 4.42 ± 1.68 | 9.29 ± 5.04 | <0.001 |
| 卵裂率，n (%) | 98.89 ± 0.04, 24 | 100.00 ± 0.00, 19 | 0.221 |
| 优质胚胎率，n (%) | 71.38 ± 35.46, 24 | 72.14 ± 35.72, 19 | 0.945 |
| 优质囊胚率，n (%) | 58.13 ± 28.29, 19 | 65.18 ± 28.09, 12 | 0.504 |
表1：两组在短时共孵育过程中是否立即部分去除卵丘细胞后的受精结果比较。
| OCCC组部分切除组 | 对照组 | p值 | |
| 患者人数 (n) | 29 | 39 | |
| 年龄 (岁) | 32.21 ± 4.11 | 32.72 ± 4.25 | 0.619 |
| 获卵数 (个) | 12.93 ± 7.00 | 12.44 ± 7.26 | 0.777 |
| 20小时操作时间 (分钟) | 4.93 ± 0.80 | 6.54 ± 7.77 | 0.207 |
| 卵裂率, n (%) | 98.81 ± 0.04, 28 | 95.93 ± 0.17, 37 | 0.39 |
| 优质胚胎率, n (%) | 72.07 ± 36.75, 28 | 72.62 ± 30.01, 36 | 0.948 |
| 优质囊胚率, n (%) | 62.93 ± 28.30, 21 | 63.36 ± 24.61, 28 | 0.955 |
表2：两组在传统方案中是否立即部分去除卵丘细胞的受精结果比较 体外 体外受精（IVF）
讨论
立即部分去除颗粒细胞可加速短期受精过程中的早期解体，缩短在短期受精和常规体外受精（IVF）中对第二极体的观察时间，且不会影响后续胚胎发育。目前，全球各地的实验室采用多种策略以减轻受精障碍和提高成功率。首选方法是在短期受精后4-6小时去除颗粒细胞以观察第二极体14。由于卵母细胞与周围卵丘细胞之间存在紧密黏附，使用移液管进行机械去除时会遇到困难。立即挑取并切割卵母细胞可通过减少卵丘-卵母细胞复合体（OCCC）的黏附程度和体积，从而缩短观察时间。该操作方案中的关键步骤是在取卵后立即部分去除OCCC，有助于松解卵母细胞周围的残留卵丘细胞，便于检测第二极体，这对于评估受精是否成功至关重要。及时去除可显著缩短操作时间，且不影响卵裂率、优质胚胎率或优质囊胚率。
切割技术的建议修改与故障排除如下：（i）无需固定针头，因为这会延长体外操作时间。在实际操作中，这是一种便捷的切割方法。（ii）应聚焦于卵丘-卵母细胞复合体（OCCC），建议在两侧各保留3-4个颗粒细胞，其范围与卵母细胞的直径相匹配。对于双侧OCCC，需切割两侧；对于单侧OCCC，则切割含有OCCC的一侧。可尽量保持对称性，但并不要求完全对称。（iii）为防止卵泡卷曲并破坏其铺展状态，切割时培养皿表面的卵泡液应足够薄，以避免OCCC漂浮。（iv）在取卵过程中，卵泡液常含有血液成分。切割后，应立即将卵泡转移至洗涤皿中，以减轻血液污染的影响，并在取卵后继续进行洗涤。
部分去除后保留卵丘细胞可确保卵母细胞获得早期胚胎发育所必需的物质，如生长因子和氨基酸，从而促进胚胎发育15。既往研究表明，长期共培养会产生大量活性氧（ROS），导致胚胎透明带硬化，损害胚胎发育潜能。立即部分去除颗粒细胞，同时保留必要的卵丘颗粒细胞，可减少颗粒细胞产生的活性氧以及培养基中的能量消耗16。目前，关于体外受精（IVF）短时受精过程中去除颗粒细胞的时间和比例尚无统一共识。本研究获得的数据表明，将选定的卵母细胞立即移除至卵丘复合体（OCCC）直径约2500 µm时，不会影响后续胚胎发育，也不会干扰短时及常规IVF受精的观察过程。
该技术的一个显著局限性在于卵母细胞与卵丘细胞之间黏附程度可能存在变异，这会影响实验结果的一致性。此外，尽管即时部分去除法可缩短观察时间，但需要精确操作以避免损伤卵母细胞或影响后续胚胎发育。尚需进一步实验以确定切割后卵丘-卵母细胞复合体（OCCC）的最佳残留量。例如，可探究在拾取皿上预先标记刻度并保留约2000 µm的OCCC，是否能够提高对OCCC大小及切割范围评估的均一性。
综上所述，这种优化的技术对受精或胚胎发育没有显著的不良影响，因此是一种值得推荐的方法。
披露
作者声明无竞争利益。
致谢
作者感谢中国广东省梅州市人民医院生殖医学科工作人员积极参与本研究。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| G-IVFT PLUS | Vitrolife | 10136 | |
| OVOIL | Vitrolife | 10029 | |
| G-MOPS PLUS | Vitrolife | 10130 | |
| Falcon 3003 培养皿 | Corning | 353003 | |
| Falcon 3001 培养皿 | Corning | 353001 | |
| Falcon 2001 离心管 | Corning | 352001 | |
| Falcon 4013 杯 | Corning | 354013 | |
| Falcon 3037 培养皿 | Corning | 351058 | |
| 巴斯德吸管 | Darwin | D1150-5P |
参考文献
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