本文介绍了一种在取卵后快速去除部分卵丘-卵母细胞复合体的优化方法，可加速体外受精（IVF）的观察过程，缩短颗粒细胞去除所需时间，减少卵母细胞对外界环境的暴露，且不影响胚胎发育，从而提高IVF实验室操作的效率。
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方法文章
卵丘-卵母细胞复合体的即时部分去除：一种用于快速观察体外受精的优化方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
尽管体外受精（IVF）的临床与实验室技术已迅速发展，仍有相当比例（10%–15%）的患者持续面临受精障碍，导致受精率低下并产生无法存活的胚胎。短期受精是指在取卵后早期去除颗粒细胞，以观察第二极体的排出，从而评估受精情况，并及时采取补救措施以应对低受精率或完全受精失败。然而，体外受精中短期受精的观察仍面临诸多挑战，例如未处理的卵丘-卵母细胞复合物聚集体过大、卵子之间相互黏连，导致颗粒细胞去除需依赖复杂的外部操作，且观察时间延长。为解决这一问题，本研究提出一种在取卵后立即部分去除颗粒细胞的方法。该方法可简化后续短期受精及传统受精监测的各个步骤，缩短卵母细胞极体排出的观察时间，减少外界环境对卵母细胞的影响，并降低错过关键受精观察窗口的风险。因此，本研究提供了新的临床证据，旨在提高体外受精胚胎实验室的操作效率。
引言
在体外受精-胚胎移植（IVF-ET）领域，典型的受精率通常在60%至80%之间1。然而，约有4%至16%的病例会出现完全受精失败或受精率偏低的情况，且难以预测2,3。为了提高临床妊娠率，并减少完全不受精和低受精的发生，IVF过程中采用短时受精的方法正逐渐增多4。该方法包括及时去除颗粒细胞，以观察第二极体的排出情况，评估受精状态，并可能实施补救性卵胞浆内单精子注射（ICSI）。在短时受精过程中，卵母细胞-卵丘细胞复合体（OCCC）与卵母细胞之间的结合比传统的过夜受精更为紧密，从而增加了OCCC去除的难度5。卵母细胞数量过多、OCCC复合体较大或卵母细胞间存在黏连等因素，可能导致短时受精期间颗粒细胞去除时间延长，进而使卵子在培养箱外停留的时间增加4。为了优化受精观察时间，在取卵后已设计出一种改良方法，即对OCCC复合体较大的卵母细胞进行部分颗粒细胞切除。该技术有助于保留围绕卵母细胞的颗粒细胞，维持早期卵母细胞结构的完整性6，并使这些细胞继续为卵母细胞成熟及后续的受精-胚胎发育提供重要因子7。
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方案
所有操作均按照梅州市人民医院生殖医学科的标准操作规程进行，并经该科室伦理委员会审查批准。每位参与的夫妇均签署了书面知情同意书。研究纳入了首次接受体外受精（IVF）周期治疗并进行卵裂期或囊胚期胚胎移植的患者，以及年龄在20至45岁之间的女性。排除标准包括使用供体卵子或精子，以及存在特定疾病情况，如先天性或继发性子宫异常（例如纵隔子宫、单角子宫、双子宫）、腺肌症、子宫黏膜下肌瘤，或在胚胎移植当日子宫内膜厚度低于7 mm。2023年12月至2024年2月期间共招募115例患者，根据是否在移植时立即部分清除卵丘-冠状复合物（OCCC），将患者分为两组。
1. 取卵前的准备
- 将卵母细胞拾取皿（材料表）置于37 °C培养箱中过夜。
- 将12 mL卵泡操作培养基（材料表）加入14 mL圆底试管中，于37 °C培养箱中过夜孵育。在卵母细胞采集前30分钟，将试管转移至预热的试管架中。
- 准备卵泡操作培养基：取9 mL卵泡操作培养基加入一个14 mL圆底试管（材料表）中，于37 °C过夜孵育。在卵母细胞采集当天，将4.5 mL该培养基转移至已预孵育的卵母细胞拾取皿（材料表）中，并覆盖2 mL 100%石蜡油。
- 准备OCCC冲洗液：取4.5 mL受精培....
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结果
在进行短时共孵育的组别中，接受补救措施的患者被排除。在47例接受短时受精的患者中，患者的年龄和获卵数方面未观察到显著差异（表1）。对卵丘-冠状复合体（OCCC）进行部分即时去除后，卵母细胞周围残留的OCCC结构变得松散（图3），从而有利于第二极体的观察。与对照组相比，OCCC部分去除组的平均操作时间显著缩短（4.42 ± 1.68 min vs. 9.29 ± 5.04 min，P < 0.001），尽管两组在卵裂率、优质胚胎率和优质囊胚率方面均未发现显著差异。
在另一组接受传统治疗的68例患者中 体外 体外受精（IVF），在授精后18-20小时进行受精情况检查，两组患者在年龄及获卵数方面具有可比性表 2）。在取卵过程中接受卵巢巧克力囊肿立即部分切除术的患者中，观察到卵母细胞周围颗粒细胞结构的疏松程度增加。图4). 尽管在部分切除OCCC组中观察到略短的平.......
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讨论
立即部分去除颗粒细胞可加速短期受精过程中的早期解体，缩短在短期受精和常规体外受精（IVF）中对第二极体的观察时间，且不会影响后续胚胎发育。目前，全球各地的实验室采用多种策略以减轻受精障碍和提高成功率。首选方法是在短期受精后4-6小时去除颗粒细胞以观察第二极体14。由于卵母细胞与周围卵丘细胞之间存在紧密黏附，使用移液管进行机械去除时会遇到困难。立即挑取并切割卵母细胞可通过减少卵丘-卵母细胞复合体（OCCC）的黏附程度和体积，从而缩短观察时间。该操作方案中的关键步骤是在取卵后立即部分去除OCCC，有助于松解卵母细胞周围的残留卵丘细胞，便于检测第二极体，这对于评估受精是否成功至关重要。及时去除可显著缩短操作时间，且不影响卵裂率、优质胚胎率或优质囊胚率。
切割技术的建议修改与故障排除如下：（i）无需固定针头，因为这会延长体外操作时间。在实际操作中，这是一种便捷的切割方法。（ii）应聚焦于卵丘-卵母细胞复合体（OCCC），建议在两侧各保留3-4个颗粒细胞，其范围与卵母细胞的直径相匹配。对于双侧OCCC，需切割两侧；对于单侧OCCC，则切割含有O.......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
作者感谢中国广东省梅州市人民医院生殖医学科工作人员积极参与本研究。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| G-IVFT PLUS | Vitrolife | 10136 | |
| OVOIL | Vitrolife | 10029 | |
| G-MOPS PLUS | Vitrolife | 10130 | |
| Falcon 3003 培养皿 | Corning | 353003 | |
| Falcon 3001 培养皿 | Corning | 353001 | |
| Falcon 2001 离心管 | Corning | 352001 | |
| Falcon 4013 杯 | Corning | 354013 | |
| Falcon 3037 培养皿 | Corning | 351058 | |
| 巴斯德吸管 | Darwin | D1150-5P |
参考文献
- Chen, C., Kattera, S. Rescue ICSI of oocytes that failed to extrude the second polar body 6 h post-insemination in conventional IVF. Hum Reprod. 18 (10), 2118-2121 (2003).
- Barlow, P., et al. Fertilization failure in IVF: why and what next. Hum Re....
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