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利用敏化发射型荧光共振能量转移（SE-FRET）监测富含亮氨酸重复序列8通道（LRRC8/VRAC）活性

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DOI：

10.3791/66953

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2024年8月9日

 ,  , 
1Institute for Molecular Medicine, MSH Medical School Hamburg, 2Institute of Chemistry and Biochemistry, Freie Universität Berlin

本文内容

摘要

电生理学是研究离子通道活性的金标准。然而，也存在多种替代方法，包括光学技术。本文介绍了一种利用亚基间基于荧光共振能量转移（FRET）的方法来监测富含亮氨酸重复序列8通道（LRRC8）形成的阴离子通道活性的技术。

摘要

LRRC8 蛋白家族成员可形成异源多聚的离子和渗透压调节物质通道，在多种生理过程中发挥重要作用。作为容积调节性阴离子通道（VRAC）/容积敏感性外向整流通道（VSOR），它们在细胞因渗透压而肿胀时被激活，介导氯离子和有机渗透压调节物质的外排，从而引起水分外流，导致细胞皱缩。除了在渗透压容积调节中的作用外，VRAC 还参与细胞分化、迁移和凋亡等细胞过程。通过影响膜电位以及转运多种信号分子，富含亮氨酸重复序列的 8（LRRC8）通道在神经元-胶质细胞通讯、胰岛素分泌和免疫应答中发挥功能。其激活机制至今尚不明确。与其他离子通道类似，LRRC8 通道通常采用电生理学方法进行研究。本文介绍一种通过检测融合于 LRRC8 亚基 C 末端亮氨酸重复序列结构域的荧光蛋白之间的复合物内敏化发射福斯特共振能量转移（SE-FRET）来检测 LRRC8 通道激活的方法。该方法可在不改变细胞质环境的情况下，原位研究通道的激活过程，适用于细胞分化和凋亡等生理过程中的动态观察。

引言

由富含亮氨酸重复序列8（LRRC8）家族蛋白异源多聚体组成的离子通道广泛存在于脊椎动物细胞中，参与多种生理功能1,2。这些LRRC8通道最初被鉴定为容积调节性阴离子通道（VRAC）或容积敏感性外向整流通道（VSOR），在细胞调节性容积减小过程中发挥关键作用3,4。它们促进氯离子和有机渗透物的排出，继而引发水分外流，以响应渗透性肿胀。除了在渗透应激反应中的作用外，这些通道在细胞容积调节中的功能还与细胞增殖和迁移、凋亡、精子形成以及上皮完整性密切相关5,6,7。LRRC8/VRAC激活引起的膜电位变化已被证实可促进成肌管分化8，以及胰腺β细胞的胰岛素分泌9,10,11。此外，LRRC8通道还可转运多种有机渗透物，例如嘌呤能信号分子ATP和cGAMP，以及兴奋性氨基酸谷氨酸，从而将这些通道置于免疫系统中的细胞间通讯以及胶质细胞-神经元相互作用的关键位置12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22。甚至外源性物质，如荧光素染料、抗生素blasticidin S或抗癌药物顺铂，也可通过LRRC8通道转运23,24,25。

关于导致LRRC8/VRAC激活的信号转导已有大量报道26,27,28。然而，其机制仍不明确，文献中提出了多种可能的机制，这些机制可能取决于特定的生理过程。这些机制包括细胞质内离子强度的变化、与细胞骨架的相互作用、膜组成、G蛋白、氧化还原状态以及磷酸化级联反应2,27,29,30,31。

LRRC8/VRAC 通道包含 LRRC8A 作为必需亚基3,4，该亚基必须与同源蛋白 LRRC8B-E 中的至少一种形成异源多聚体，才能构成具有生理功能的通道4,14,32。亚基组成决定了通道的生物物理特性，例如整流性和去极化依赖性失活4,29,32,33,34、底物特异性15,17,20,21,24,35，以及部分激活通路36,37。冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构显示，LRRC8A 同源多聚体以及异源多聚体均组装为六聚体38,39,40，而能够形成功能性通道的 LRRC8A/LRRC8C 嵌合体则为七聚体41。所有 LRRC8 蛋白的 N 端部分包含四个跨膜螺旋，C 端部分则含有富含亮氨酸重复序列的结构域（LRRD）。已有的 LRRC8 复合物结构表明，LRRD 延伸至胞质溶胶3,4,23，在通道门控过程中可能发生构象重排34,42,43。这一观点得到了以下发现的支持：在 C 端融合荧光蛋白会导致通道的基础活性14，而纳米抗体与这些结构域的结合可调节通道活性44。此外，通过复合物内 Förster 共振能量转移（FRET）实验也证实了 C 端发生构象改变45。

研究离子通道活性最常用的方法是电生理学测量46在VRACs的分子鉴定之前，这些方法已被广泛应用于其研究中47然而，还有多种间接监测VRAC活性的方法，包括检测其转运的底物——卤素离子或有机渗透物——或其对细胞体积的影响。48事实上，将LRRC8蛋白鉴定为容积调节性阴离子通道（VRAC）依赖于一种基于卤化物敏感型荧光蛋白淬灭的检测方法49 通过激活的VRAC通道进入细胞的碘化物3,4. 另一种监测LRRC8/VRAC通道活性的方法是利用细胞质结构域的运动，该运动可被观察到，类似于其他离子通道中的情况50,51,52,53，通过FRET的变化45为此，将作为FRET配对的荧光蛋白，如青色荧光蛋白（CFP）/mCerulean3作为供体，黄色荧光蛋白（YFP）/mVenus作为受体，融合至LRRC8蛋白的C末端（图1通过受体光漂白实验显示了LRRC8亚基之间的分子内FRET45避免使用具有破坏性的光漂白方法，通过敏化发射FRET（sensitized-emission FRET, SE-FRET）监测随时间变化的FRET信号，该方法基本原理是检测在供体激发下，由于供体发射光谱与受体激发光谱重叠而产生的受体敏化发射。施加细胞外低渗刺激（LRRC8/VRAC通道激活的刺激因素）后，SE-FRET强度出现可逆性降低45重要的是，在低渗处理期间同时进行的全细胞膜片钳记录和FRET监测显示，FRET的降低确实反映了LRRC8/VRAC的激活45该方法避免了通过移液管溶液破坏质膜或改变细胞内环境，为监测LRRC8/VRAC活性提供了一种替代方案。在需要维持天然胞质溶胶、实现亚细胞分辨率或进行长时间通道活性观察的生理条件下，该方法尤为适用。

本文介绍了一种利用基于荧光共振能量转移（FRET）的检测方法研究LRRC8/体积调节性阴离子通道（VRAC）的实验方案。该方案详细描述了细胞的处理与转染、样本与对照图像的采集、数据分析以及敏化发射FRET（SE-FRET）值的计算方法。

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图1：LRRC8 FRET 配对系统的示意图。 mCerulean3 以青色表示，mVenus 以黄色表示。在 VRAC 开放后，荧光团之间的距离（和/或空间取向）发生变化，导致供体（Don）与受体（Acc）之间的能量转移减少，从而降低观测到的 FRET 效率。 使用 BioRender.com 制作。 请点击此处查看此图的放大版本。

方案

1. 缓冲液与试剂的准备

  1. 准备培养基以及等渗、低渗和高渗缓冲液，并使用渗透压计测量缓冲液的渗透压，以确保渗透压（Osm）处于预期范围内，仅允许存在可接受的偏差。
    1. 细胞培养基：制备添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）
    2. 等渗成像缓冲液（~340 mOsm）：通过混合150 mM NaCl、6 mM KCl、1 mM MgCl2、1.5 mM CaCl2、10 mM D(+)-葡萄糖和10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）配制等渗成像缓冲液。
    3. 低渗成像缓冲液（~250 mOsm）：通过混合105 mM NaCl、6 mM KCl、1 mM MgCl2、1.5 mM CaCl2、10 mM D(+)-葡萄糖和10 mM HEPES配制低渗成像缓冲液。
    4. 高渗成像缓冲液（~500 mOsm）：通过混合160 mM D(-)-甘露醇、150 mM NaCl、6 mM KCl、1 mM MgCl2、1.5 mM CaCl2、10 mM D(+)-葡萄糖和10 mM HEPES配制高渗成像缓冲液。
      注意：可根据研究目的在缓冲液中添加特定药物。

2. 玻璃底培养皿中贴壁细胞的培养

  1. 准备至少一个仅转染目的蛋白（POI）与供体或受体荧光团融合的培养皿，以及至少一个转染供体与受体荧光对的培养皿（表1 和 图2）。使用玻璃底培养皿以便进行荧光显微镜观察。根据细胞类型，可通过特殊清洗或以多聚赖氨酸包被对表面进行预处理。
    注意：此处使用FRET供体mCerulean3（mCer）54 和FRET受体mVenus（mVen）55 作为FRET对，但也可使用其他荧光团组合。单独表达与供体或受体融合的POI的样品用于确定校正因子β和γ（表1），这些因子用于校正受体通道中的供体串扰以及供体激发波长对受体的交叉激发（图2Ac、Bf）。
  2. 转染前一天，在适用于荧光显微镜观察的35 mm玻璃底培养皿中接种1 × 105 个HeLa细胞，加入2 mL细胞培养基。在37 °C、5% CO2 条件下的细胞培养箱中过夜培养。
    注意：试剂体积可根据其他尺寸的细胞培养皿或培养瓶的表面积进行调整。细胞数量可根据不同细胞系和实验方法所需的密度进行调整。
    1. 使用真空泵吸除在T75细胞培养瓶中培养的贴壁细胞单层的细胞培养上清液。
    2. 向细胞培养瓶中加入10 mL杜氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS），清洗细胞，随后用真空泵吸除溶液。
    3. 用1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA完全覆盖细胞，在37 °C、5% CO2 条件下的细胞培养箱中孵育2分钟。
    4. 加入9 mL细胞培养基，通过移液重悬细胞。
    5. 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在室温（RT）下以700 × g 离心3分钟。
    6. 使用真空泵吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于10 mL细胞培养基中。
    7. 在离心管中混合等体积的细胞悬液与0.4%台盼蓝，取10 µL加入细胞计数板。将计数板放入自动细胞计数器中，使用相应的细胞计数程序开始计数。
    8. 为计算每皿所需细胞悬液的体积，将每皿所需细胞数（1 × 105）除以细胞计数器测得的每毫升细胞数。
    9. 在合适的离心管中制备细胞悬液，其中包含每皿所需细胞数及每皿所需体积（2 mL），并额外增加一皿的量。
    10. 通过反复倒置离心管至少20次混匀细胞悬液，然后用移液器向每皿加入2 mL细胞悬液。
    11. 为确保细胞分布更均匀，在将培养皿放入细胞培养箱前，于室温（RT）静置30分钟。

3. 细胞转染

注意：此处使用 FuGENE 作为转染试剂，其他转染试剂和方法同样适用。每种目的蛋白（POI）和细胞模型所需的质粒 DNA（pDNA）与转染试剂的最佳比例以及最佳表达时间需通过实验确定。本实验中，每个 35 mm 培养皿使用 2 µg 总 pDNA。FRET 供体和受体构建体按 1:1 比例使用，pDNA 与转染试剂的比例为 1:4（表 1）。

  1. 转染前，将细胞培养上清液更换为 2 mL 新鲜预热的培养基。
  2. 用 Opti-最低必需培养基（MEM）稀释质粒 DNA，最终体积为 100 µL（= pDNA 溶液）。
  3. 用 Opti-MEM 稀释转染试剂，最终体积为 100 µL（= 试剂溶液）。
    注意：为获得更均匀的转染效果，建议为 pDNA 溶液和试剂溶液配制主混合液。
  4. 充分混匀 pDNA 溶液与试剂溶液。
  5. 将 pDNA 溶液加入试剂溶液中（= 转染溶液）。
  6. 充分混匀转染溶液。
  7. 室温下孵育转染溶液 15 分钟。
  8. 以螺旋方式逐滴将转染溶液加入培养皿中。
  9. 通过在实验台表面水平和垂直方向各晃动培养皿 5 次，使溶液混匀。
  10. 将细胞置于 37 °C、5% CO2 的细胞培养箱中过夜培养。

  

条件质粒构建样本用途
1LRRC8A-mCerulean仅供体构建确定校正因子 β
2LRRC8E-mVenus仅受体构建确定校正因子 γ
3LRRC8A-mCerulean 和 LRRC8E-mVenusFRET 配对SE-FRET 定量分析

表1：以典型的SE-FRET实验测量由与供体（mCerulean3）融合的LRRC8A亚基和与受体（mVenus）荧光团融合的LRRC8E亚基组成的通道的LRRC8/VRAC活性所需的实验条件示例。

4. 用于校正因子测定的图像采集

注意：在 FRET 过程中，供体发射光会渗漏到受体检测到的发射光中。此外，供体激发波长也会交叉激发受体荧光团。这些过程在计算 SE-FRET 时必须进行校正。为此，在转染后 24 小时仅表达 FRET 供体或受体的细胞中确定校正因子。本实验使用配备 Leica LED8 灯、滤光片组 CYR71010、HC PL APO 63x/1.40 OIL 油镜、460/80 和 553/70 长通滤光片以及 Leica DFC9000GTC 相机的 Leica THUNDER 成像仪完成。实验在无环境控制条件下进行，但在成像缓冲液中添加 HEPES 以稳定 pH 值。对于长期观测或测量，建议使用环境控制系统。分析时，从采集的原始图像中计算 SE-FRET，该计算可在采集过程中同步进行，也可在采集后完成。本实验使用配备 SE-FRET 插件的 Leica LAS X 软件，以简化校正因子的计算过程，并在图像采集期间实时可视化 SE-FRET 值的变化。采集完成后，也可使用其他软件包（如 FIJI）根据下述方案对原始数据进行校正因子和 SE-FRET 的计算。

  1. 在对单个转染细胞进行成像以计算校正因子之前，使用一个表达FRET荧光对的样品设置所有通道的显微镜参数（供体激发/供体发射DD、供体激发/受体发射DA和受体激发/受体发射AA；参见表1以及图2C和图3A）。
    注意：对于如上所述转染了mCerulean3和mVenus标记的VRAC亚基的样品，在进行SE-FRET测量时采用以下参数：8×8像素 binning，曝光时间100 ms，LED灯强度为10%。
  2. 取仅表达供体构建体的样品（图2A），吸除细胞培养基，并用2 mL等渗缓冲液洗涤细胞三次。
  3. 加入3 mL等渗缓冲液，将样品置于显微镜载物台上。
  4. 寻找一个至少包含一个表达供体构建体细胞的视野（FOV）。
  5. 对所有通道（DD、DA和AA，参见表2和图2A）进行成像。
  6. 在细胞周围绘制感兴趣区域（ROI），并测量DA通道的平均荧光强度（= IDA；图2Ac）和DD通道的平均荧光强度（= IDD；图2Aa）。
  7. 为进行背景扣除，在DA和DD通道中选择仅含背景信号的区域绘制ROI，并测量其平均强度（IBDA和IBDD）。
  8. 从对应通道细胞ROI测得的平均强度中减去背景ROI的平均强度（figure-protocol-1 和 figure-protocol-2）。
  9. 对仅表达受体构建体的样品重复步骤4.2–4.5（图2B）。
  10. 在细胞周围绘制ROI，并测量DA通道的平均强度（= IDA；图2Bf）和AA通道的平均强度（= IAA；图2Be）。
  11. 为进行背景扣除，在DA和AA通道中选择仅含背景信号的区域绘制ROI，并测量其平均强度（IBDA和IBAA）。
  12. 从对应通道细胞ROI测得的平均强度中减去背景ROI的平均强度（figure-protocol-3 和 figure-protocol-4）。
  13. 利用测得的IDA*、IDD*和IAA*值，计算校正因子figure-protocol-5 和 figure-protocol-6。
    ​其中，校正因子β用于校正供体发射信号在DA通道中的渗漏；校正因子γ用于校正在DA通道中由供体激发波长对受体荧光团产生的交叉激发。
激发发射通道名称LED 线滤光立方长通滤光片
供体供体DD440 nmCYR71010460/80 nm
供体受体DA440 nmCYR71010535/70 nm
受体受体AA510 nmCYR71010535/70 nm

表2：SE-FRET实验所需通道汇总。

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图 2：通过供体mCerulean3（mCer）标记的LRRC8A亚基与受体mVenus（mVen）标记的LRRC8E亚基组成的通道，利用SE-FRET测量法测定VRAC活性所需校正因子β和γ的样本代表性荧光图像。（A、B）仅表达供体（A）LRRC8A-mCer或受体（B）LRRC8E-mVen的HeLa细胞中，供体/供体（DD）、受体/受体（AA）以及供体/受体（DA）通道的检测结果。（C）共转染供体与受体对LRRC8A-mCer和LRRC8E-mVen的HeLa细胞中，DD、AA和DA通道的检测结果。图a-i显示了在供体检测通道（激发供体并检测供体信号；DD；a、d和g）、受体检测通道（激发受体并检测受体信号；AA；b、e和h）以及FRET信号检测通道（激发供体并检测受体信号；DA；c、f和i）中采集的图像。图j为图g和图h的叠加图像。DD通道以绿色显示，AA通道以品红色显示。比例尺 = 10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

5. 用于 SE-FRET 定量分析的时间序列成像

  1. 取表达供体和受体构建体的样品（表 1、图 2C 和 图 3A），吸除细胞培养基，并在转染后 24 h 用 2 mL 等渗缓冲液洗涤细胞三次。
  2. 加入 3 mL 等渗缓冲液，并将样品置于显微镜载物台上。
  3. 为后续吸除等渗缓冲液，固定并调整套管针，使针尖到达培养皿底部。
  4. 为添加缓冲液，固定并调整管路，使依靠重力流动的缓冲液可滴入培养皿。
    注意：此处使用了一个由四个电磁阀控制流速的阀门控制重力灌流系统，但其他方法也可适用。
  5. 寻找一个视野（FOV），其中至少有一个细胞同时表达供体和受体构建体。
  6. 为 DD、DA 和 AA 通道设置时间序列实验，时间间隔为 10 s，持续时间需覆盖刺激序列的所有条件，例如，基线阶段 12 个循环，随后每个条件 15 个循环（图 3）。
    注意：时间间隔和循环次数可根据实验需求调整，但应始终包含基线测量，以便归一化，从而更好地可视化和比较数据。
  7. 完成基线测量后，用第一种条件的缓冲液洗涤样品。
    1. 通过套管针连接注射器施加真空，吸除等渗缓冲液。
    2. 通过重力流加入 3 mL 下一条件的缓冲液。
    3. 吸除缓冲液，并再次加入 3 mL 相同缓冲液。
    4. 重复步骤 5.7.3 一次。
  8. 完成第一种条件的测量后，用下一条件的缓冲液洗涤样品（步骤 5.7.1–5.7.4）。
  9. 重复步骤 5.5–5.8，直至所有条件均完成采集。
  10. 为进行 SE-FRET 定量，围绕细胞/细胞群绘制 ROI，并测量时间序列中所有图像（时间点）的 DD = (IDD)、DA (IDA) 和 AA (IAA) 通道的平均强度（图 3A、B）。
  11. 为对 FRET 信号进行背景校正，在 DA 通道中选择仅含背景信号的区域绘制 ROI，并测量其平均强度（IBDA）。
  12. 从细胞 ROI 在 DA 通道测得的平均强度中减去背景 ROI 的平均强度（figure-protocol-8）。
  13. 利用所测得的数值，计算每个 ROI 及所有时间点的平均 SE-FRET 值 figure-protocol-9。
  14. 为提高不同条件之间的可比性并更好地可视化 SE-FRET 值，使用每个 ROI 的基线平均值对相应 ROI 的所有时间点进行归一化。
  15. 绘制归一化后的 SE-FRET 值随时间变化的曲线（图 3B）。

figure-protocol-10
图3代表性荧光图像及SE-FRET定量分析。 (A代表性荧光图像及时间序列实验第一个时间点的表观SE-FRET，用于通过LRRC8A与LRRC8E亚基组成的通道的SE-FRET测量VRAC活性随张力的变化。比例尺 = 10 µm相同的细胞在下图中显示 图2C. 图版 a-i 显示DD、AA和DA通道的检测结果以及计算得到的表观SE-FRET。白色轮廓代表用于测量DD、AA、DA信号平均强度及表观SE-FRET图像的感兴趣区域（ROI，即d图中的细胞i-iii）。B) SE-FRET 值随时间的定量分析。实验条件顺序为：12 个循环的等渗成像缓冲液（基线），随后为 15 个循环的低渗成像缓冲液和 15 个循环的高渗成像缓冲液。每个 ROI（细胞 i-iii）和每个时间点的原始平均 SE-FRET 值均以对应 ROI 的基线（等渗）平均值进行归一化处理。 请点击此处查看该图的放大版本。

结果

利用这种基于FRET的方法，可以在渗透刺激过程中监测LRRC8/VRAC的活性，且SE-FRET的降低程度与细胞外低渗程度相关45。此处还展示了低渗诱导通道激活的代表性结果（图3 和 图4）。此外，还可观察到不同等渗刺激条件下LRRC8/VRAC的激活，例如通过调控二酰甘油信号通路45，或在心肌细胞激活过程中发生的激活56。

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图 4：SE-FRET 荧光信号轨迹。（A）来自 5 次独立实验的表观 SE-FRET 轨迹。数据表示每个视野（FOV）中 N = 2 至 N = 7 个细胞的平均值 ± 标准差（SD）。（B）所有细胞的平均值 ± 标准差（N = 31 个细胞）。请点击此处查看该图的放大版本。

由于LRRC8/VRAC通道也参与凋亡性体积减小24,57，观察在诱导凋亡后通道活性的变化将是本文所述方法的另一项应用。因此，在施加死亡受体介导的凋亡诱导药物的同时，对表达LRRC8A-mCerulean3和LRRC8E-mVenus的HeLa细胞进行了SE-FRET监测实验。已有研究表明，肿瘤坏死因子（TNF）-α与放线菌酮（CHX）可在数分钟内诱发VRAC电流58。在等渗缓冲液中加入2 ng/mL TNF-α和1 µg/mL CHX后，SE-FRET出现显著下降（图5）。当将缓冲液替换为高渗溶液（即使其中仍含有TNF-α和CHX）时，SE-FRET值恢复至接近基线水平（图5A），这与在凋亡诱导性Fas配体处理过程中，高渗灌流液中VRAC电流减弱的现象相对应58。使用TNF-α和CHX的溶剂DMSO处理细胞，并未引起SE-FRET的降低。TNF-α + CHX对CFP-18aa-YFP（一种作为FRET对照的EYFP与ECFP串联结构）的SE-FRET无影响59，表明该响应对LRRC8/VRAC具有特异性（图5B）。

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图5：死亡受体介导的细胞凋亡通过等渗条件激活VRAC。 （A）表达LRRC8A-mCer/LRRC8E-mVen的HeLa细胞的归一化SE-FRET值随时间变化（n = 8个培养皿，23个细胞）。在等渗成像缓冲液中记录15个循环（基线期）后，灌流液更换为含有2 ng/mL TNF-α和1 µg/mL环己酰亚胺（CHX）的等渗缓冲液，持续30个循环，随后更换为含有TNF-α和CHX的高渗成像缓冲液，持续20个循环。每个ROI及时间点的原始平均SE-FRET值均以该ROI在基线期（等渗条件）的平均值进行归一化。（B）表达LRRC8A/E的HeLa细胞在不同条件下的归一化SE-FRET值定量分析：等渗溶液中以DMSO作为CHX的溶剂对照组（n = 5个培养皿，12个细胞）；等渗缓冲液中加入A组所用凋亡诱导剂（n = 8个培养皿，23个细胞）；以及表达CFP-18aa-YFP的HeLa细胞在凋亡诱导剂处理下（n = 3个培养皿，9个细胞）。数据表示各缓冲液条件下单个细胞最后10个时间点的平均值（符号），以及所有细胞的均值±标准差（SD）；** p < 0.01，采用单因素方差分析（ordinary one-way ANOVA）并进行Tukey多重比较事后检验。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

FRET 显微镜是一种成熟且广泛应用的技术，用于研究蛋白质之间的相互作用。因此，基于 FRET 的方法可被不同专业水平的众多实验室所采用。在多种离子通道中，已利用基于 FRET 的检测方法监测其门控过程中的构象重排（例如，参见参考文献34,50,51,52,53,60,61,62,63,64,65,66,67），某些情况下还结合了膜片钳荧光测定法中的电生理学技术68,69,70,71。FRET 可用于研究这些离子通道的结构-功能关系，或独立于离子转运过程来监测其活性。本文所介绍的方法相较于电生理学具有明显优势，因为它能够原位（in situ）监测 LRRC8/VRAC 通道的活性。

实验方案中的关键步骤包括接种细胞，使其达到转染和成像所需的理想汇合度，这有助于在后续分析中清晰区分单个细胞。不同亚基的有效共转染对于实现正确的亚细胞定位至关重要；例如，非LRRC8A亚基过量将导致内质网（ER）定位增强。4因此，可能需要调整质粒比例。根据具体系统，应验证新构建的FRET对，例如通过受体漂白法。为针对特定研究问题实现最佳的时间和空间分辨率，需权衡binning与曝光时间之间的关系。binning可缩短曝光时间，从而减少FRET传感器的潜在漂白，但会降低空间分辨率。因此，若实验设计需要对LRRC8/VRAC活性进行亚细胞水平的区分，则应避免使用binning。研究问题同样决定了延时成像序列中循环次数及时间间隔的设置。仅当需要分析FRET变化（即LRRC8/VRAC激活/失活）的动力学特征时，时间间隔才具有意义；否则，仅需进行简单 "前后对比" 也可以进行记录。实验时长取决于所研究的生理过程。理想情况下，应在刺激后持续监测LRRC8/VRAC活性，直至SE-FRET信号达到稳定。这些参数可通过预实验确定。所有实验条件下均需测定校正因子，以计算真实的SE-FRET信号。校正因子测定不当可能导致SE-FRET强度被高估或低估。最后，在建立稳定的基线后，图像采集的时间间隔必须足够短，以充分捕捉目标生理过程的动态变化。

该方法存在一些局限性。其中之一是，尽管LRRC8蛋白间FRET强度的变化反映了LRRD结构域的运动，但并不一定对应于离子或渗透物通过孔道的转运。这一点从LRRC8A同源多聚体中观察到的FRET变化即可明确，尽管其电流极小45，但仍能检测到FRET信号变化4,32,72。LRRC8/VRAC通道的孔道阻断剂可能不影响FRET信号，这使得该方法不适用于寻找特异性通道调节剂。此外，过表达的LRRC8蛋白的表达水平可能影响所观察到的生理过程，尤其是C末端标记的LRRC8蛋白具有基础活性14。

一个可能被视为局限性或优势的方面（取决于具体的研究问题）在于，该方法仅选择性地检测异位表达的LRRC8亚基，因此内源性蛋白的背景水平几乎不会干扰检测结果。另一方面，过表达的蛋白可能与具有不同亚基组成和化学计量比的内源性LRRC8通道在行为上存在差异。例如，氧化等不同刺激可能对组成各异的LRRC8通道产生相反的调节作用36通过改变共表达亚基之间的比例，可调节其化学计量比和整体离子电导。14,73，但其天然组成中，一个复合物内可能通常包含两个以上的旁系同源蛋白21，尚不明确，且可能因细胞类型而异74,75,76此外，将荧光蛋白融合至LRRC8蛋白的胞质C末端被证明可增加基础状态下LRRC8/VRAC通道的活性 非洲爪蟾 卵母细胞14，很可能是因为较大的标签会调节LRRD的构象，而这种构象可能调控通道的开启14,44,45因此，荧光蛋白的大小、连接肽及其相对取向不仅可能影响FRET效率，还可能影响通道活性。然而，重要的是，将荧光蛋白融合于LRRC8蛋白构成的VRAC通道仍能对低渗刺激产生响应。14，使其可用作FRET传感器45.

与其它方法相比，这种通过光学显微镜非侵入性监测LRRC8/VRAC通道活性的方法具有以下优势：（i）可在细胞内或电生理学通常无法触及的区室中观察LRRC8/VRAC，包括可发现或靶向定位LRRC8复合物的细胞内细胞器45,77,78。（ii）该方法不会改变胞质成分，而在全细胞膜片钳记录过程中，胞质大部分会被移液管溶液取代，可能影响信号通路，例如已观察到的佛波酯-12-十四烷酰-13-乙酸盐（PMA）诱导的LRRC8/VRAC激活过程45。（iii）可实现亚细胞分辨率下对LRRC8/VRAC激活的观测，例如在细胞迁移过程中区分前缘与后缘的活性，其中在受限空间内VRAC已被证实发挥作用79,80。（iv）可在长时间的生理过程中持续监测LRRC8/VRAC活性，例如心肌细胞分化过程56。

尽管该方法存在一定的局限性和挑战，但它在进一步探索方面具有潜力，包括在动物模型中的潜在应用。结合其他方法研究该离子和渗透调节剂通道家族，这种基于FRET的检测方法可能在揭示LRRC8通道的激活机制及其在天然环境中的多种生理功能方面发挥重要作用。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢C.F. Kaminski惠赠编码CFP-18aa-YFP构建体的质粒，感谢A. Klemmer提供的技术支持，以及Stauber实验室所有现任和前任成员为本方法的建立所做出的贡献。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTAgibco25300-054
Camera DFC9000GTCLeica11547007
CFP-18aa-YFPN/AN/AElder 等，2009，PMCID: PMC2706461；由 C.F. Kaminski（英国剑桥大学）惠赠
环己酰亚胺（CHX）Sigma-Aldrich66-81-9
D(-)-甘露醇Carl Roth4175.1
D(+)-葡萄糖Carl RothHN06.1
DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）PAN-BiotechP04-03590
DPBS（杜尔贝科磷酸盐缓冲液）PAN-BiotechP04-36500
发射滤光轮（460/80，535/70，590/50，642/80，100%）Leica11525480
FBS（胎牛血清）PAN-BiotechP30-3302
滤光立方 CYR71010Leica11525416
FuGENEPromegaE2691
35 mm 玻底培养皿MatTekP35G-0-10-C
HeLa 细胞Leibniz Forschungsinstitut DSMZACC 57哺乳动物宫颈癌细胞系；购自 Leibniz Forschungsinstitut DSMZ
HEPESCarl Roth9105.4
ibidi µ-Disch 35 mmibidi81156
KCl（氯化钾）Carl Roth6781.1
LAS X FRET 向导Leica11640862
LED8 光源Leica11504256
LRRC8A-mCerulean3N/AN/AKönig 等，2019
LRRC8E-mVenusN/AN/AKönig 等，2019
Luna-II 自动细胞计数仪logos biosystemsL40002
Luna-II 细胞计数仪载片logos biosystemsL12001
MgCl2（氯化镁）Carl RothKK36.1
THUNDER Imager 活细胞显微镜Leica11525681
NaCl（氯化钠）Carl Roth9263
物镜 HC PL APO 63x/1.40 OILLeica11506349
Opti-最低必需培养基（MEM）gibco11058
渗透压测定仪 OM807VogelV04807
青霉素-链霉素（Pen Step）gibco15070-063
台盼蓝溶液（0.4%）SigmaT8154
肿瘤坏死因子（TNF）-αSigma-Aldrich94948-59-1
阀门控制重力灌注系统ALA Scientific InstrumentsVC3-4xG

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LRRC8 HeLa
利用敏化发射型荧光共振能量转移（SE-FRET）监测富含亮氨酸重复序列8通道（LRRC8/VRAC）活性
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