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优化小鼠泪液采集以用于mRNA和蛋白质分析

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DOI：

10.3791/66955

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2024年7月19日

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Farmacobiología, Centro de Investigación sobre el Envejecimiento, CINVESTAV Sede Sur

本文内容

摘要

从小鼠模型的泪液中鉴定RNA和蛋白质生物标志物在多种疾病的早期诊断中具有广阔前景。本文提供了一套全面的实验方案，用于优化从小鼠泪液中分离mRNA和蛋白质的效率与效果。

摘要

泪膜是一种高度动态的生物流体，能够反映不仅在眼表而且在其他组织和器官中与病理相关的分子变化。对该生物流体的分子分析提供了一种无创的方法，可用于疾病诊断或监测、评估医疗干预效果以及发现潜在的生物标志物。由于样本量有限，采集泪液样本需要特定的技术和适当的工具，以确保高质量和最大效率。在人类研究中已有多种泪液采样方法被描述。本文详细介绍了一种经过优化的实验方案，特别适用于从实验动物模型（尤其是小鼠）中提取与泪液相关的蛋白质信息。该方法包括对两个月龄小鼠进行药理学刺激以促进泪液分泌，随后使用Schirmer试纸条采集样本，并通过标准流程、SDS-PAGE、qPCR和数字PCR（dPCR）对方案的有效性和效率进行评估。该方案可轻松适用于多种实验范式中对泪液蛋白质特征的研究。通过建立一种经济、标准化且优化的动物模型泪液采样流程，旨在弥合人类与动物研究之间的差距，推动转化医学研究，加快眼表及系统性疾病研究领域的进展。

引言

泪液被视为血浆的超滤液，由于其与血浆、血清及脑脊液在生物分子组成上存在显著重叠，也被描述为介于血浆、血清与脑脊液之间的中间体液1。已有研究报道，人类泪液中含有蛋白质、泪液脂质、代谢物和电解质2。近年来，其他生物分子如mRNA、miRNA以及细胞外囊泡也已被鉴定发现3,4,5,6,7。

在人体中，基础泪液位于泪膜内，泪膜由三层组成：最外层的脂质层，可保持泪液表面光滑，使我们能够透过其视物，并防止泪液蒸发；中间的水性层，负责保持眼球湿润、抵御细菌、保护角膜，并构成泪膜的90%；最后是黏蛋白层，这是一类高分子量蛋白质，与角膜直接接触，使泪液能够附着于眼球表面8。泪液在眼表的分布始于泪腺的分泌，分泌的液体经泪道导流，流经眼球表面后进入排泄通道。每一次眨眼都能使泪液均匀分布于整个眼球表面，从而保持眼球湿润9。

泪膜是一种高度动态的生物流体，能够反映不仅发生在眼表而且发生在其他组织和器官中的分子变化。对该生物流体中差异表达的分析，为人类疾病中生物标志物的发现提供了一种有前景的方法10,11。由于存在非侵入性采集方法，泪膜作为多种病理状态下早期诊断生物标志物来源的应用已得到极大促进。在人类和兽医临床中，最常见的采集泪液的方法是基于膜的支持材料（Schirmer试纸条），其原理为毛细作用，使泪液中的水分沿置于受试者下结膜囊内的纸质试纸条或毛细管长度方向移动12,13,14。尽管该方法存在所获得样本体积较小的固有局限性，但利用多种高灵敏度技术对泪液成分进行生化分析，已促进了潜在生物标志物分子的鉴定11,15。针对人类患者，从Schirmer试纸条和毛细管中优化并评估泪液蛋白质洗脱的实验方案已有详尽记录16,17。然而，专门针对实验动物模型设计、用于提取与泪液相关分子信息的优化方案的完整描述虽有报道但仍然稀少。现有方法中，通过直接刺激泪腺诱导泪液分泌的方法18虽可采集较大体积的样本，但属于侵入性操作，可能引起动物不适。非侵入性方法，例如从眼表收集泪液，已被描述为分离DNA和miRNA的一种手段19,21。

本方案旨在建立一种经济高效且经过优化的小鼠泪液采集与处理方法。该方法在获取足量适用于分子分析（如SDS-PAGE、qPCR和dPCR）的泪液体积的同时，优先考虑非侵入性操作。所提取的蛋白质和mRNA含量信息可用于识别现有疾病实验模型中的潜在生物标志物。

方案

本研究所述所有操作均经Cinvestav动物伦理委员会（CICUAL，编号0354/23）批准。实验动物的饲养和操作严格遵循本期刊的动物使用指南以及视力与眼科学研究协会（ARVO）关于动物在眼科与视觉研究中使用的声明。通过评估眼部分泌物、眼睑肿胀、眼部异常及行为变化，对操作前后动物的眼部健康状况进行评价。

1. 动物与试剂准备

  1. 每组实验使用三只两个月大的C57BL/6雄性小鼠，起始体重约为25 g（图1）。每只小鼠单独处理，并将其置于加热垫上以维持体温。
  2. 为诱导泪液分泌，使用无菌水配制浓度为20 mg/mL的匹鲁卡品储备液。
  3. 将Schirmer试纸条剪裁至5 mm长度，并在刻痕处将每条试纸弯折成90°角。
  4. 根据制造商说明，将蛋白酶抑制剂（每50 mL加入1片）加入250 µL无菌水中，充分混匀。

2. 泪液分泌刺激与采集

  1. 分别称量每只小鼠的体重，以计算相应的给药剂量。
  2. 为刺激泪液分泌，使用6 mm胰岛素注射器腹腔注射30 mg/kg的匹鲁卡品（图1B）。给药后等待2分钟，使药物作用充分显现。
    注意：由于未刺激状态下泪液量极少，无法从小鼠获取未刺激状态下的数据。
  3. 用镊子将每段Schirmer试纸的一端置于下眼睑中央，保持位置固定，直至泪液扩散至试纸的刻度线处（图1C），随后更换新的试纸。每只眼睛依次放置2 条Schirmer试纸，每次间隔2 分钟，以完成泪液采集。每只小鼠约需在10分钟内使用4段试纸完成采集过程。
  4. 将采集后的Schirmer试纸片段立即放入预冷的无菌离心管中，并置于冰上，以防止泪液成分降解。采集完成后，应尽快开始泪液样本的处理。

3. 蛋白质分离

  1. 将 条带碎片放入含有20 µL无菌水和蛋白酶抑制剂的600 µL微量离心管中，在4 °C条件下以600 × g离心1小时，如先前所示17（图1D）。
  2. 使用7.5 cm不锈钢注射针在含有样品的600 µL离心管管尖处刺一个小孔（图1E）。然后将此穿孔后的离心管转移至一个新的灭菌1.5 mL离心管中，在4 °C条件下以12,000 × g离心10分钟，如先前报道17，以回收稀释后泪液的体积。泪膜液体（上清液）将位于管底。
  3. 通过合并所有样品回收的上清液来构建蛋白质混合液。本实验中，共获得约200 µL的总体积。
    注意： 泪液分泌可持续超过1小时。在此期间，仍可继续收集泪液。
  4. 采用Bradford标准方法22测定泪液混合样本中的总蛋白含量。

4. SDS-PAGE 分析

  1. 将蛋白质样品在 99 °C 下加热 4 分钟以变性蛋白质。短暂涡旋振荡样品以混匀组分。
  2. 从每个样品中取定量的 30 µg 蛋白质上样至 10% SDS-PAGE 凝胶（表 1），采用标准方法在 90 V 条件下电泳运行 2 小时23。
  3. 电泳结束后，用染色液（表 1）覆盖凝胶，并孵育 30 分钟以对蛋白质进行染色。
  4. 用脱色液反复漂洗凝胶，直至背景清晰、蛋白条带可见。
  5. 使用凝胶成像系统获取图像。

5. 用于qPCR和数字PCR的mRNA分离

  1. 将条带放入含有 20 µL 无菌水的 600 µL 微量离心管中。在装有样本的管尖处打一个小孔，将其放入新的灭菌 1.5 mL 管中，在 4 °C 条件下以 2,000 × g 离心 20 分钟（如先前在人泪液研究中报道的方法3）（图 1E-H）。
  2. 将所有样本混合成一个样本池。本实验每只小鼠回收的上清液体积约为 22 µL，即总体积为 66 µL。将管子置于干冰上，以避免生物分子降解。
  3. 加入 200 µL 酚和硫氰酸胍的单相溶液（商业获得），通过移液混匀。室温静置 5 分钟。此步骤中，样本可在 -20 °C 保存数周，或在 -70 °C 保存数月。
  4. 加入 40 µL 氯仿，涡旋混合 15 秒。室温静置 2 分钟。在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 15 分钟。
  5. 小心地将水相（避免吸取中间相）转移至新的 1.5 mL 管中。
  6. 在 100 µL 异丙醇中加入 0.5 µL 甘油原（0.05 µg/µL），通过移液混匀。甘油原会与 RNA 共沉淀，但不会干扰后续步骤。
  7. 在 -20 °C 静置 10 分钟。在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 10 分钟。迅速倒掉上清液。
  8. 加入 200 µL 冷的 75% 乙醇，通过涡旋重悬 RNA 沉淀。在 4 °C 条件下以 8,000 × g 离心 5 分钟。
  9. 倒掉乙醇。不要翻转管子，室温下晾干 20–30 分钟。加入 20 µL 无 RNase 水并重悬。
  10. 使用微量分光光度计在 260 nm 和 280 nm 处测定吸光度，以评估 RNA 纯度。样本必须置于冰上。
    注意：由于样本性质限制，无法通过琼脂糖凝胶观察到 28S 和 18S 核糖体条带。其他 RNA（如 miRNA 或 mRNA）的存在可通过生物分析仪进行分析，方法如先前报道18。
  11. 按照商业试剂盒说明书，以泪液 RNA 合成 cDNA。
    1. 起始 RNA 量建议在 10 ng–5000 ng 范围内；根据所用试剂盒，将 RNA 与 1 µL Oligo (dT) 和最多 12 µL 无 RNase 水混合。在 500 × g 条件下离心 30 秒，然后在 65 °C 孵育 5 分钟。
    2. 向混合管中加入 4 µL 5× 反应缓冲液、1 µL RNase 抑制剂、2 µL dNTP 混合物和 1 µL 逆转录酶。
    3. 在 500 × g 条件下离心 30 秒，使混合物沉至管底。然后在 42 °C 孵育 60 分钟。最后在 70 °C 孵育 10 分钟以终止反应。
  12. 由于泪液中 mRNA 浓度较低，建议在 qPCR24 中使用未稀释的 cDNA。本实验使用了 150 ng cDNA。使用 DNMT3a 引物进行 qPCR ：
    正向引物：GCCGAATTGTGTCTTGGTGGATGACA，反向引物：CCTGGTGGAATGCACTGCAGAAGGA；以及 GAPDH 引物：
    正向引物：ACTGGCATGGCCTTCCGTGTTCCTA，反向引物：TCAGTGTAGCCCAAGATGCCCTTC，具体操作遵循试剂和仪器说明书。
    1. qPCR 循环程序如下：初始变性：95 °C 10 分钟，随后进行 45 个循环（95 °C 15 秒，60 °C 30 秒，72 °C 30 秒），最后在 72 °C 延伸 5 分钟。
    2. 进行熔解曲线分析，以评估反应中是否存在引物二聚体或非特异性扩增产物。温度梯度从 50 °C 升至 99 °C，第一步保持 90 秒，每步之间保持 5 秒。
    3. 对于 dPCR25，需进行系列稀释以优化检测目标 mRNA 所需的 cDNA 量。本实验中，将 cDNA 用无核酸酶水稀释为以下浓度：150 ng、75 ng、37.5 ng 和 18.75 ng。使用前述 DNMT3a 引物。dPCR 循环程序如下：初始变性：95 °C 2 分钟，随后进行 40 个循环（95 °C 15 秒，60 °C 30 秒）。

结果

本文所述方案提供了一种简便且经济的方法，利用大多数分子生物学实验室常见的技术，从泪液中获取分子信息。此外，该方案还可通过采用ELISA等高灵敏度技术检测酶活性，实现通量的扩大。

经过这些步骤后，总蛋白产量约为 3-4 µg/µL。对总蛋白提取物进行考马斯亮蓝染色的 SDS-PAGE 分析，揭示了整个视网膜和泪液中的蛋白质表达模式（图 2A）。

分离的RNA其260/280紫外吸收比值介于1.9至2.0之间，平均产量为134.8 ng/µL。采用引物对看家基因（甘油醛-3-磷酸脱氢酶，GAPDH）3 和一个潜在的生物标志物基因（DNA甲基转移酶3a，DNMT3a）26 进行qPCR检测。使用未稀释的cDNA样品1:1（150 ng）进行反应。

进行了熔解曲线分析，并在qPCR软件中计算了Ct值。所有实验均重复进行两次。分析结果显示Ct值介于20至24之间，表明样品中目标mRNA的起始量处于合适范围（图2B）。然而，图2C中的熔解曲线分析提示目标mRNA的含量较低。尽管如此，2%琼脂糖凝胶电泳证实了存在预期大小的扩增产物（图2D）。

使用相同的引物对 DNMT3a 进行数字PCR（dPCR）检测。cDNA样本的稀释比例分别为1:1（150 ng）、1:2（75 ng）、1:4（37.5 ng）和1:8（18.75 ng）。所有实验均重复进行两次。dPCR能够检测到未稀释样本中低至1.33拷贝/µL，以及8倍稀释样本中低至0.45拷贝/µL的目标分子（图3A、3B）。因此，与qPCR相比，dPCR对泪液中存在的目标mRNA具有更高的灵敏度。

小鼠DNA提取过程示意图和照片，展示设备和操作步骤。
图1：从小鼠中提取泪液的示意图。（A）泪液采集。使用三只两个月大的C57BL/6J小鼠。（B）通过腹腔注射匹鲁卡品药理学诱导泪液分泌。照片展示了Schirmer试纸条的放置方式。（C）泪液处理。使用Schirmer试纸条采集泪液10分钟，随后转移至微量离心管中。（D）采集了泪液的Schirmer试纸条与无菌水及蛋白酶抑制剂，或仅与无菌水一起离心。（E, F）将这些管子底部打孔，随后转移至新的灭菌1.5 mL离心管中，以促进液体流出。（G, H）泪液被收集在1.5 mL离心管中。（I）采集泪液操作的代表性照片。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质分析、基因表达研究；包括凝胶电泳、RT-PCR、熔解曲线、扩增子。
图 2：泪膜分子应用的下游分析。（A）小鼠泪液和视网膜蛋白提取物的SDS-PAGE分析。MW：分子量标记物；泳道1：视网膜蛋白谱（30 µg）；泳道2：泪液蛋白谱（30 µg）。（B）小鼠泪液中GAPDH和DNMT3a的qPCR检测。平均CT值和ΔCT值见表2。（C）DNMT3a和GAPDH PCR产物的熔解曲线分析。Y轴表示扩增反应中荧光变化速率（dF/dT），X轴表示温度（°C）。（D）在含有0.5 µg/mL溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳中对PCR扩增子进行分析。泳道M：1 kb Plus DNA Ladder；泳道1、2：分别为GAPDH和DNMT3a的PCR扩增子。请点击此处查看该图的放大版本。

显示qPCR实验中DNA稀释结果和拷贝数/μL的荧光强度图表与柱状图。
图3：小鼠泪液中DNMT3a表达的数字PCR（dPCR）检测。（A）dPCR结果以一维散点图显示，其中蓝色点代表DNMT3a转录本拷贝数，黑色点代表不含DNMT3a转录本拷贝的分区。（B）对cDNA进行系列稀释，以确定定量DNMT3a转录本拷贝数的最佳浓度。误差线表示标准偏差。请点击此处查看该图的放大版本。

材料名称描述
10% SDS 胶配制一块分离胶：3.8 mL 蒸馏水；2.6 mL Tris（pH 8.8，1.5 M）；3.4 mL 丙烯酰胺；100 µL 10% SDS；100 µL 10% APS；4 µL TEMED。
配制一块浓缩胶：2.72 mL 蒸馏水；0.52 mL Tris（pH 6.8，1.5 M）；0.68 mL 丙烯酰胺；40 µL 10% SDS；40 µL 10% APS；4 µL TEMED。
电泳缓冲液250 mM Tris 碱，2 M 甘氨酸，1% SDS
染色液将以下试剂溶于 43 mL 水中（室温避光保存）：考马斯亮蓝 0.25 g；乙酸 7 mL；甲醇 50 mL
脱色液将以下试剂溶于 63 mL 水中（室温保存）：乙酸 7 mL；乙醇 30 mL

表1. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的设置。

基因名称CT1CT2平均值 ± 标准差ΔCT
GAPDH20.1420.7320.44±0.17
DNMT3a24.5924.9724.78±0.074.35

表2. 小鼠泪液中DNMT3a和GAPDH的Ct值。

讨论

泪液易于获取，泪液中生物标志物的检测可作为多种人类疾病早期诊断的有效补充技术27。尽管在实验动物模型中对泪液成分进行生化分析可补充该方法，并有望显著推动对疾病分子基础的理解，但目前可用的数据和实验方案十分有限，这促使我们开发了一种相关方法。本报告所述方法在技术上操作简便，可实现对不同疾病相关候选分子差异表达的初步鉴定。

泪液采集可通过多种方法实现，例如毛细管、Schirmer 试纸16,17、拭子28和海绵29。由于 Schirmer 试纸法具有易获取、可定量、采样过程中适应性强、成本低以及便于提取泪液成分用于实验室处理等优点，因此更受青睐。此外，该方法成本低廉、侵入性极小，且由于滤纸条的组成特性，不会对角膜造成损伤或伤害的风险16,17。本方案的关键步骤包括使用匹鲁卡品进行药理学刺激以促进泪液分泌，以及选择合适的洗脱缓冲液。

匹鲁卡品是一种胆碱能激动剂，可与M3毒蕈碱受体结合，引起外分泌腺的药理学刺激，增强泪液分泌、唾液分泌和排尿。尽管在人体中的研究表明，刺激泪液分泌并不会改变所采集液体的渗透压30，但其对蛋白质谱的影响是明确的31。匹鲁卡品作为胆碱能药物用于刺激外分泌腺及增强泪液分泌的方法已在兔和小鼠中成功报道19,32,33，但刺激对泪液蛋白质含量的影响尚未被评估。为避免这一局限性，并实现不同实验条件下泪液谱的准确比较，必须考虑特定的采集条件。同样，在泪液采集前引入冲洗步骤可能有助于避免眼表先前存在的污染。在本方案中，采用的匹鲁卡品剂量为30 mg/kg13。由于小鼠在注射该药物后保持静止且状态平静，因此无需麻醉即可采集泪液，使样本采集过程更加简便。

选择合适的洗脱缓冲液与所选泪液样本生化成分分析方法以及从试纸条中回收生物材料的效率密切相关。例如，在一项针对患者Schirmer试纸条中蛋白质保留情况的比较研究中发现，含有100 mM碳酸氢铵和0.25% Nonidet P40（NP40）的缓冲液在蛋白质组学或多重ELISA分析应用中表现出更优的效果17。在我们的实验中，使用无菌水足以在SDS-PAGE中可视化总蛋白提取物，并通过PCR检测目标基因的mRNA。

为了评估小鼠泪液中 DNMT3a 和 GAPDH mRNA 的存在情况，我们比较了qPCR与dPCR的检测性能。qPCR熔解曲线中观察到的引物二聚体，归因于 DNMT3a 转录本丰度较低。结果表明，dPCR在检测这些样本（包括未稀释和稀释样本）中的目标mRNA时，具有显著更高的灵敏度和检测效率。这种精确的检测能力使dPCR成为小鼠泪液分析的首选方法，为研究人员和临床医生提供了可用于未来研究及潜在临床应用的可靠工具。

建立动物模型泪液样本采集的标准化方案是研究领域的一项重要进展。该方案不仅有助于系统化且精确地采集泪液样本，还为其在多个研究领域的应用开辟了广阔的可能性。通过从动物模型中获取泪液样本，研究人员能够探究多种疾病和病理状态，并探索新的生物标志物及潜在治疗方法。此外，标准化方案的建立有助于提升不同研究和实验室之间结果的可重复性，从而增强科研成果的有效性与可靠性。最终，动物模型泪液采集技术的这一进步有望推动重要科学发现，加深对多种疾病病理生理机制的理解，为疾病的诊断、治疗和预防开辟新的途径。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由 VELUX STIFTUNG [项目 1852] 资助给 M.L.，以及由 CONAHCYT 提供给 M.B.（836810）、E.J.M.C.（802436）和 A.M.F（CVU 1317418）的研究生奖学金。衷心感谢实验室全体成员、衰老研究中心及药理与生物医学部（Cinvestav）的各位，感谢他们为富有启发性的讨论所做出的贡献。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-巯基乙醇Gibco1985023
2x Laemmli缓冲液Bio-Rad16-0737
乙酸Quimica Meyer64-19-7
丙烯酰胺Sigma-AldrichA4058
Bradford 试剂Sigma-AldrichB6916
氯仿Sigma-Aldrich1003045143
考马斯亮蓝 R 250US Biological6104-59-2
乙醇Quimica Rique64-17-5
GeneRuler 1kb plus DNA Ladder赛默飞世尔科技SM1331
甘油US BiologicalG8145
甘氨酸SANTA CRUZSC-29096
糖原罗氏10901393001
HCl奎米卡·里克7647-01-0
异丙醇奎米卡·里克67-63-0
甲醇Quimica Meyer67-56-1
1.5 ml 微量离心管AxygenMCT-150-C
微型离心管 600 µlAxygenMCT-060-C
NaClSigma-AldrichS3014
PCR管 &和条带NovasbioPCR 0104
匹鲁卡品Sigma-AldrichP6503-10g
蛋白酶抑制剂罗氏11873580001
QIAcuity EvaGreen PCR 试剂盒（5 mL）Qiagen250112
QIAcuity Nanoplate 26k 24孔板（10个）Qiagen250001
Real qPlus 2x Master Mix GreenAmpliqonA323402
RevertAid 第一链 cDNA 合成试剂盒赛默飞世尔科技K1622
Schirmer试纸条桑塔加尔实验室SANT1553
SDSSigma-AldrichL3771
TEMEDSigma-Aldrich102560430
TRI试剂Sigma-AldrichT9424-200ML苯酚与异硫氰酸胍的单相溶液
TrisUS BiologicalT8650
Tris 碱Chem Cruzsc-3715A

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