介绍了一种利用高电压和负载活性成分的靶向乳液来制备pH响应性均一微球的技术。
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摘要
摘要
黑种草籽油（BSO）提取自Nigella sativa植物的种子，因其潜在的抗癌特性而受到关注，尤其是在结肠癌方面的应用。其活性成分为百里醌，可能有助于抑制结肠癌细胞的生长并诱导癌细胞凋亡。此外，黑种草籽油的抗炎和抗氧化作用可能有助于改善肠道环境，从而降低患癌风险。因此，本研究合成了pH敏感型海藻酸盐微球，以实现黑种草籽油在结肠部位的控释递送，避免在pH 1.2（胃部环境）时释放药物，从而在pH 6.8条件下实现明确的释放模式。采用电喷雾技术可提升工艺性能，更易于制备粒径小且均一的微球，并提高其在胃肠道介质中的溶胀率和扩散速率。
所制备的微珠通过以下方式进行了表征： 离体 黏附强度测试、微球粒径、球形因子（SF）、包封率（EE）、扫描电子显微镜（SEM） 体外 溶胀行为（SB），以及 体外 在酸性和缓冲介质中的药物释放。所有制备的微球在此测试中均表现出适中的粒径（0.58 ± 0.01 mm）和良好的球形度（0.03 ± 0.00 mm）。该制剂显示出良好的漂浮性能和释放特性 体外累积微珠百分比极低的情况下，油的包封率高达90.13% ± 0.93%，在pH 6.8条件下的释放研究显示释放量超过90%，且在胃中具有良好的漂浮特性。此外，微珠在肠道中分布均匀。本方案所采用的电喷雾方法可重复，结果稳定一致。因此，该方案可用于商业化大规模生产。
引言
黑种草，尤其是黑籽油（BSO），因其明确的药用特性已被用于治疗多种疾病达数百年之久。百里醌（thymoquinone）可能是BSO中最重要的植物化学成分之一1。近年来，研究人员已在体内（in vivo）和体外（in vitro）对百里醌的潜在治疗作用进行了研究，并提供了支持使用BSO的实验证据。这些研究已证实BSO具有降压、抗菌、抗组胺、抗真菌、镇痛、降血糖、降脂及抗炎等特性，可用于缓解湿疹、高血压、哮喘、咳嗽、头痛、流感、发热、抗癌、头晕以及活动障碍等症状2,3。
将相对较薄的包覆层应用于液体和分散液的小液滴或固体材料的微粒上，被称为微胶囊化。对于油脂而言，微胶囊化油脂通常具有较高价值，因为某些形式的油脂（如BSO）被视为营养食品，并具有药用优势4。然而，将油脂直接添加到食品基质中可能导致其挥发，在氧气和紫外光暴露下迅速失去活性5。此外，由于无法控制油脂的释放速率，会导致作用迅速但短暂。通过微胶囊化或微球化技术在精油周围形成聚合物包覆层，是克服上述缺点的一种方法6。
微胶囊，也称为微球，可保护油脂免受有害环境条件的影响7。该技术已广泛应用于提高药物疗效、保护药物成分、实现缓释片剂、改善掩味效果、减少产品保质期内的风味损失、延长口感持续时间，以及在同一剂量中分离不相容的成分8。微胶囊化还有助于维持代谢吸收、控制油脂释放速率，并保持适当的浓度，以在特定部位产生预期效果9。
电液动力封装是一种简单且适应性强的方法。活性物质被包埋在微胶囊的内核中，微胶囊由外部壳层构成。在这方面，该方法具有较强的基质结构，可确保活性成分更有效地分散，而不是形成界限明确的核。在球化之前，必须将活性物质与聚合物溶液混合以形成微球9。然而，由于油具有挥发性，对其进行微胶囊化可能极为困难，需要精确的温度控制。
有多种方法可用于油类的包封。例如，某些油需要在低温下进行包封，以防止其生物活性成分的降解或挥发。为了制备微米和纳米级结构，研究人员已对电液动力雾化（EHDA）技术进行了广泛研究10。在此背景下，工艺条件（包括流速、施加电压、喷嘴尺寸）以及聚合物溶液的收集距离特性，是必须考虑的两个主要因素，以获得目标粒径或形貌11,12。
在本研究中，藻酸盐——一种 适合口服摄入的天然多糖类型被用于包封BSO。褐藻含有海藻酸盐，这是一种天然存在的阴离子聚合物，由两种单体结构组成：α-L-古洛糖醛酸（G）和1-4β-D-甘露糖醛酸（M）。13其聚合物无毒14具有高度的生物相容性，成本低廉，且能有效降解15因此，它经常被应用于生物技术和工程领域。
海藻酸盐是通过离子交联法进行包封的首选材料，因为其可通过与二价阳离子（如 Sr2+、Ca2+ 或 Zn2+）形成离子键，使不同海藻酸盐链上的G嵌段之间产生交联结构。该凝胶化过程可用“蛋盒模型”充分描述，即一个二价阳离子被两个并列海藻酸分子上的羧基所包围。已有研究指出，海藻酸钠微球的水凝胶特性可调控大分子和小分子的释放行为。由于具有黏膜黏附性，海藻酸钠微球可在肠道黏膜上长时间滞留。此外，海藻酸盐可形成保护屏障，防止油类受到酸性环境等外界因素的影响16，并将其转运至胃肠道的递送通道17。因此，海藻酸盐已被用于研究中，以促进药物向黏膜组织的靶向递送18,19。
本研究采用电液动力学方法研究将商用油乳化以制备微胶囊的可行性20。此处，电液动力学方法被用于生成和分析负载海藻酸盐-BSO的微球20。本研究评估了多个其他因素，包括微球的溶胀因子（SF）、离体（ex-vivo）黏膜黏附性能、包封率（EE%）、外观形态、粒径分布和Zeta电位；采用衰减全反射-傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）检测化学相容性20。
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方案
1. 海藻酸盐-BSO乳液的制备
- 在50 mL烧杯中，将10% w/v BSO分散于含有1%、3%和5% w/v卵磷脂的1% w/v海藻酸钠溶液中。
- 使用超声波均质器制备纳米乳液。将功率设为20%，点击启动按钮运行均质器55秒，完成该过程。
2. 海藻酸钠-BSO 乳液的表征
- 分析ζ电位和粒径分布
- 取0.1 mL新配制的乳液置于25 mL玻璃烧杯中，加入9.9 mL蒸馏水稀释。
- 取2.5 mL上述稀释后的溶液加入3 mL石英比色皿中，并将比色皿放入测量室。
- 打开仪器盖子，将比色皿放入设备中，确保比色皿方向正确，与光束路径一致。点击测量图标。
- 取出比色皿，回收样品或按规范妥善处理。
- 将数据保存为PDF文件，存储于个人文件夹中以供后续使用。
- 测定乳液稳定性（ES）
- 取5 mL新配制的乳液置于10 mL离心管中。将乳液（n = 3）在894 × g 条件下离心5分钟。
- 根据公式（1），通过相分离界面位置计算ES。
(1)
其中Vemul为离心后剩余乳液体积，Vinitial为初始乳液体积。
- 微珠制备
- 含BSO海藻酸钠微珠
- 采用称为EHDA的电喷雾技术制备含BSO海藻酸钠微珠。使用质量体积比（w/v）为10% BSO、1%海藻酸钠和3%卵磷脂溶液组成的BSO乳液。
- 使用注射泵控制流速，将乳液装入10 mL塑料注射器中，通过22 G针头挤出。将针尖连接至高压电源的正极。
- 以接地的烧杯作为收集器，内含50 mL质量质量比（w/w）为1%的氯化钙溶液（凝胶浴）。在距离氯化钙溶液表面10 cm处，分别在3、5和7 kV电压下，交替调节滴加流速为1 mL/min和3 mL/min。
- 为确保完全凝胶化，将微珠置于凝胶浴中搅拌30分钟。使用不锈钢滤网从凝胶浴中取出微珠，并用超纯蒸馏水洗涤收集的微珠。
- 将微珠在实验台上室温干燥16小时。使用公式（2）计算微珠的产率。
(2)
- 不含BSO的海藻酸钠微珠
- 配制1% w/v的海藻酸钠溶液。向该溶液中分别加入浓度为1%、3%和5% w/v的卵磷脂，并充分混合至卵磷脂完全溶解。
- 使用步骤2.3.2.1所得溶液，按照步骤2.3.1.2–2.3.1.5所述方法制备不含BSO的海藻酸钠微珠。使用公式（2）计算产率。
- 含BSO海藻酸钠微珠
3. 微球表征
- 粒径与形状的测定
- 为确定微珠的粒径与形状，使用图像分析仪。用数码相机拍摄湿态和干燥状态下的微珠照片。
- 然后，利用仪器预装的标尺测量微珠直径。根据所测得的直径值，代入公式（3）计算形状因子（SF）：
SF =
（3）
其中，Dmax 表示通过微珠中心的最大直径（单位：mm），Dper 表示与 Dmax 垂直且通过微珠中心的直径（单位：mm）。
注：SF 值为零表示微珠为理想球形，SF 值越大，表示偏离球形程度越高。此外，当微珠的 SF 值小于或等于 0.05 时，可视为球形。
4. 包封率（EE%）的测定
- 将珠粒在磷酸盐缓冲液（PBS）中分散，使其重新形成乳液。使用紫外-可见分光光度计在600 nm处测定所得乳液的吸光度。
- 利用吸光度值表示乳液的浊度。使用已知量的BSO乳液建立标准曲线。
- 使用公式（4）计算包封率（EE%）：
（4）
5. 扫描电子显微镜（SEM）
注意：使用扫描电子显微镜（SEM）观察 BSO 藻酸盐微球的微观结构和表面形貌。
- 为观察干燥微珠内部结构，切开少量微珠。将切开的微珠置于铝制样品台上，并使用导电胶带固定。
- 在氩气环境中，使用真空镀膜仪中的碳溅射模块对微珠进行溅射镀膜，碳镀层厚度分别为100 Å和50 Å。
- 在高真空条件下，使用10 kV至15 kV的加速电压对镀膜后的微珠进行成像。
6. 使用 ATR-FTIR 确定药物与辅料之间的相互作用
- 使用环境空气作为背景，将仪器的波数设置在 4,000 cm−1 至 400 cm−1 之间，分辨率为 1 cm−1。参见 补充文件 1。
- 分别记录 BSO、海藻酸钠、卵磷脂、氯化钙、不含 BSO 的微珠、海藻酸钠-BSO 微珠，以及活性成分与辅料（海藻酸钠、卵磷脂、氯化钙和 BSO）物理混合物的光谱。
- 将样品（5–10 mg）置于采样区域。设置扫描次数为 20 次，分辨率为 4，量规力为 80，压紧臂使用平头探针。确认自动递增仍设置为空白选项，以确保光谱自动保存至目标文件夹中。
- 点击[样品]按钮开始样品测量。选择[样品]后，由于无需等待，务必提前准备好样品并降下压力夹。对所有样品逐一进行分析。使用光谱分析软件对所有记录的光谱分别进行分析。
7. 差示扫描量热法（DSC）
注意：使用DSC研究了载BSO微珠的热性能和相容性（补充文件1）。
- 将约3.20 mg的珠子密封于普通的铝坩埚中。在氮气流速为20 L/min的条件下，以10 °C/min的升温速率，在50–350 °C的温度范围内对样品进行加热分析。
8. 微球的溶胀特性
- 准备 100 mg 干燥的海藻酸盐-BSO 微球。
- 在适当尺寸（6 L、10 L 或 25 L）的洁净干燥混合容器中配制模拟肠液（SIF）和模拟胃液（SGF）。加入约所需体积 33% 的纯化水（即 2 L、3 L 或 8 L），然后将浓缩液瓶中的内容物转移至容器中。用纯化水冲洗瓶子，并将洗液与纯化水一并加入混合容器，达到所需总体积；充分混匀。测定 pH 值，若在规定范围内则继续操作；必要时调节 pH 值。
- 将微球浸入含有模拟肠液（SIF）和模拟胃液（SGF）的 50 mL 介质中。在 37 ± 0.5 °C 条件下维持 2 小时。
- 在预设时间点（0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110 和 120 分钟或更长时间）取出膨胀的微球，并通过金属筛网过滤。用纸巾擦去溶胀微球表面多余的液体。
- 使用电子分析天平称量擦干后微球的质量。根据公式（5）计算溶胀指数百分比（%SI）：
（5）
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结果
BSO负载海藻酸盐微珠的制备
图1 展示了制备BSO负载海藻酸盐微珠的实验装置。所使用的卵磷脂用量对BSO乳剂的稳定性具有显著影响。使用三种不同浓度卵磷脂制备的乳剂均表现出相对稳定性。本实验采用离心法（894 × g，5分钟）评估乳剂的稳定性20。结果证实，表面活性剂对BSO乳剂稳定性的影响大于离心作用。乳剂的Zeta电位和粒径分布如表1和图2所示。
微球的表征
粒径、形状和包封率
所制备微珠的粒径、形状和包封率（EE）总结于表2中。干燥微珠的粒径范围为1.86 ± 0.02 mm（F2和F3）至0.58 ± 0.01 mm（F...
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讨论
利用EHDA工艺，制备了负载BSO的海藻酸盐微珠，作为一种pH敏感型载体。由于微珠网络中含有丰富的羧酸基团，其表现出pH依赖性的溶胀行为和药物释放特性。在pH 1.2条件下，负载BSO的微珠溶胀性能降低，其原因在于聚合物链之间存在强烈的分子间氢键作用。这种溶胀性能的降低可能有利于BSO负载微珠在pH敏感性药物递送中的应用。pH值影响了含BSO微珠中BSO的释放。这些结果表明，负载BSO的微珠可能为肠道靶向给药提供一种安全有效的口服药物递送方式。
随着卵磷脂浓度的增加，乳液的粒径也随之增大。这一现象可能是由于卵磷脂浓度升高导致黏度上升，从而影响了超声均质器的粒径减小能力。此外，卵磷脂浓度的增加会使油滴周围的表面活性剂层更加致密，导致粒径增大。乳液的显微形态表明，这些乳液具有良好的稳定性。卵磷脂的浓度可能影响粒径分布和zeta电位20。乳液表现出非均一的粒径分布，这可能是由于手动超声处理所致。zeta电位在维持胶体体系稳定性方面起着关键作用21。乳液中的液滴带有显著的负电荷，这可归因于海藻酸...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究得到了沙特阿拉伯利雅得公主诺拉·宾特·阿卜杜勒拉赫曼大学研究人员支持项目（PNURSP2024R30）的资助，该项目由公主诺拉·宾特·阿卜杜勒拉赫曼大学提供支持。本研究还由沙特阿拉伯利雅得国王沙特大学研究人员支持项目（RSPD2024R811）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 mL 离心管 | Globe Scientific | 22-171-624 | |
| 22 G 针头 | Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯） | CAD4172 | |
| 3 mL石英比色皿 | Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯） | Z276669 | |
| 50 mL烧杯 | |||
| 铝制样品台 | |||
| 电子分析天平 | |||
| ATR-FTIR | Bruker马来西亚有限公司，雪兰莪州莎阿南市特马斯亚工业区，邮编40150，马来西亚 | ||
| 黑种草籽油 | IKOP制药有限公司（IKOP，国际伊斯兰大学马来西亚分校药学院，马来西亚彭亨州关丹25200） | B182111 | 活性成分 |
| 氯化钙二水合物，CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯） | 21074 | 凝胶剂 |
| 碳导电胶带 | |||
| 离心 | |||
| 差示扫描量热法 | |||
| 数字 相机 | |||
| 底部固定的烧杯 | |||
| 高古洛糖醛酸含量海藻酸钠（分子量 97,000），中等粘度（40 – 100 mPa s | Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯） | W201502 | 聚合物 |
| 高压电源 | |||
| 异丙醇 | Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯） | W292912 | ATR-FTIR 清洁目的 |
| 卵磷脂 | Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯） | P7568 | 表面活性剂 |
| 显微镜 | |||
| 纸巾 | |||
| 扫描电子显微镜 | |||
| 模拟胃液 | Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯） | 1651 | 释放介质和溶胀介质 |
| 模拟肠液 | Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯） | 84082-64-4 | 释放介质和溶胀介质 |
| 光谱学软件 | |||
| 不锈钢滤器 | |||
| 注射泵 | 马来西亚森金有限公司，马来西亚雪兰莪州达鲁尔艾珊佩塔令再也德沙丽雅园，46150 | ||
| 超纯蒸馏水 | 由机构实验室提供 | ||
| 超声波均质器 | 马来西亚森金有限公司，马来西亚雪兰莪州达鲁尔艾珊巴生谷德赛丽雅镇，46150 蒲种再也 | ||
| 紫外-可见分光光度计 | |||
| 真空蒸发仪 | 马来西亚森金有限公司，马来西亚雪兰莪州达鲁尔艾珊八打灵再也德沙丽雅镇，邮编46150 | ||
| 电压加速器 | 马来西亚森金有限公司，马来西亚雪兰莪州达鲁尔艾珊八打灵再也德沙丽雅镇，邮编46150 | ||
| Zetasizer Nano-ZS | （马尔文Zetasizer Nano系列Nano-S和Nano-Z，马尔文仪器有限公司，英国伍斯特郡） |
参考文献
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