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方法文章

用于研究缺血性脑卒中亚急性期和慢性期转导细胞中 Neurod1 异位表达的 AAV 系统与小鼠模型

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DOI：

10.3791/66965

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2024年11月29日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Division of Anatomy, University of Toronto, 2Institute of Medical Science, University of Toronto, 3Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 4Donnelly Centre for Cellular and Biomedical Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了在皮层缺血性脑卒中后通过病毒介导的方式异位表达 Neurod1 的方法。Neurod1 的递送分为两种情况：（1）在脑卒中后亚急性期（7 天）利用 Cre-Flex AAV 系统在野生型小鼠中进行；（2）在脑卒中后慢性期（21 天）利用单个 AAV 载体在条件型报告小鼠中进行。

摘要

异位表达神经发生因子 体内 已成为在疾病模型中替代丢失神经元的一种有前景的策略。利用神经基本螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子 通过 非复制型病毒样颗粒系统，包括逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒（AAV），已有大量报道。对于 体内 实验, 腺相关病毒（AAVs）因其低致病性及潜在的可转化性而被日益广泛应用。本方案描述了两种AAV系统，用于研究缺血性脑卒中后转导细胞中转录因子的异位表达。在这两种系统中，Neurod1的表达由短片段GFAP（gfaABC(1)D）启动子驱动，该启动子在脑卒中后反应性星形胶质细胞中上调，当与神经发生因子共表达时，也可在内源性神经元中激活。在所述的缺血性脑卒中模型中，通过向小鼠运动皮层注射内皮素-1（ET-1）诱导局灶性缺血，形成一个周围环绕着表达GFAP的反应性星形胶质细胞和存活神经元的病灶。在脑卒中后的亚急性期（7天）和慢性期（21天）进行脑内注射AAV，以在病灶区域异位诱导Neurod1的表达。AAV注射后数周内，与接受对照AAV病毒的小鼠相比，异位表达Neurod1的小鼠在转导细胞中检测到显著更多的神经元。所采用的基于AAV的策略成功复制了在轻度至中度皮层脑卒中模型中，表达报告基因的神经元数量增加的现象。本方案建立了一个标准化平台，可用于探索通过AAV系统递送的转录因子异位表达的影响，有助于深入理解脑卒中背景下神经发生因子的表达机制。 关键词：实验, 腺相关病毒, 缺血性脑卒中, Neurod1, GFAP启动子, 内皮素-1, 转录因子, 异位表达, 神经发生, 反应性星形胶质细胞, 脑内注射, 报告基因

引言

脑卒中是全球范围内导致残疾的主要原因之一1。当脑部血液供应中断时，就会发生脑卒中。这种情况可能由出血性脑卒中（约占病例的15%）引起，即脑内血管破裂；也可能由缺血性脑卒中引起，即脑部血流受阻1。其中缺血性脑卒中最为常见，约占所有脑卒中病例的85%1。脑卒中会减少葡萄糖和氧气向脑组织的输送，导致神经元迅速死亡以及神经功能受损。

缺血性脑卒中通过兴奋性毒性、氧化和亚硝基化应激、钙稳态失调、皮层扩散性去极化、水肿、血脑屏障（BBB）破坏以及炎症等机制，在数分钟内导致病灶核心区域的细胞死亡2,3。梗死周围区域的细胞在卒中后数小时内开始发生凋亡性细胞死亡，并可持续数天4。梗死周围微环境暴露于促炎和抗炎信号之中，从而激活小胶质细胞和星形胶质细胞（"反应性"星形胶质细胞），这些细胞在损伤后发挥多种作用5,6,7,8。反应性星形胶质细胞经历多种表型改变，包括胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达上调，并在卒中后数天内于病灶周围形成边界，这有助于限制病灶扩展，同时也影响受损组织内的神经可塑性8,9,10。

直接细胞重编程可将一种成熟细胞类型转化为另一种成熟细胞类型，而无需经过多能性状态11将脑内常驻细胞转化为新的神经元以替代因损伤而丢失的神经元，为脑功能修复提供了一条颇具吸引力的途径。鉴于中风治疗迫切需要能够替代丢失神经元、拓展治疗时间窗并最终促进功能恢复的治疗手段，因此成为基于细胞治疗的理想靶点。为此，已有大量研究论文证实了星形胶质细胞向神经元转分化的可行性 体外 和 体内 使用多种碱性-螺旋-环-螺旋（bHLH）神经发生转录因子，包括 Ascl1, Neurog2, Neurod1 以及最近出现的突变版本 Ascl1 (Ascl1-SA6) 其表现出更高的重编程效率11,12,13,14需要考虑的是，许多实验设计因素可能影响研究结果、解释以及不同研究之间的比较。Ghazale 等人证明，在使用相同的 bHLH 转录因子时，AtN 重编程效率在不同小鼠品系、AAV 血清型和启动子之间存在差异。14其他因素，如损伤模型、脑区、病毒剂量、基因递送时间、重编程因子及递送方式，均会影响实验结果。近期研究报道显示，预先存在的转导神经元曾被误认为是重编程获得的神经元15,16尽管这些报告并非必然否定AtN转化的发生，但这些研究强调了严格对照实验的重要性，且多篇论文已为该领域下一步的研究方向提出了建议15,17,18,19文献中显而易见的是，bHLH 转录因子的异位表达可在多种神经退行性疾病/损伤的动物模型中改善功能结局13,20,21,22,23,24.

本方案中，通过在转导细胞中异位表达目的转录因子Neurod113,22。采用成熟的内皮素-1（ET-1）诱导成年小鼠感觉运动皮层缺血性脑卒中的模型。ET-1注射可引起局部血管收缩，模拟缺血性脑卒中的病理生理过程，包括功能障碍22,23,25。利用常用的短片段GFAP启动子（gfaABC(1)D）驱动在损伤部位及周边区域异位表达Neurod1，采用两种病毒策略：（1）在野生型小鼠中联合注射AAV5-CAG-Flex::GFP与AAV5-GFAP-Neurod1-Cre；（2）在tdTom-Cre报告小鼠中单独注射AAV5-GFAP-Neurod1-Cre。为进一步探究Neurod1在卒中损伤脑组织中异位表达的潜力，病毒分别在卒中后亚急性期（7天）或慢性期（21天）给予。在两种实验范式中，异位表达Neurod1数周后均观察到显著增多的标记神经元。

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方案

本方案已获得多伦多大学动物护理委员会的批准，并遵循 实验动物护理与使用指南 (2nd 版本，加拿大动物护理委员会，2017）。本研究使用野生型（C57BL/6J）和转基因 tdTom-Cre 报告小鼠（B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 使用了小鼠品系。小鼠年龄为7-9周，包括雄性和雌性。所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 内皮素-1 脑卒中手术

注意：所有外科手术器械和材料均在手术前通过高压灭菌器进行灭菌。立体定位仪使用 PREempt 进行消毒。注射器在手术前用 PREempt 和 70% 酒精消毒，并用无菌 PBS 预冲洗。内皮素-1（ET-1）在整个手术过程中保持冰上保存。

  1. 手术开始前，将清洁的笼盒置于设定为 37 °C 的加热垫上，以准备恢复区域。若使用加热灯，则仅将笼盒的一半置于热源下方。
    1. 使用异氟烷对小鼠进行麻醉时，应遵循动物护理委员会批准的方案。将小鼠放入麻醉诱导室，开启氧气，流速调至1-1.5 L/min，随后将异氟烷挥发罐调节至3%-5%，开始麻醉。
  2. 当动物侧卧且无法站立时，将其从舱室中取出，并放置于清洁的表面上。在手术前及手术过程中，通过确认其足趾捏夹反射消失，以确保动物已充分麻醉。
    1. 将麻醉机伸出的鼻罩固定在动物身上，并将异氟烷浓度调整至1%-2%以维持麻醉。尽量减少异氟烷暴露时间（诱导期使用3%-5%浓度，持续5分钟，其余时间使用1%-2%浓度），因为该操作可能长达40分钟才能完成。
  3. 使用动物毛发修剪器将动物从耳后颈部至鼻部的毛发去除，以暴露颅骨表面的皮肤，便于手术操作。
  4. 称重动物，并根据体重皮下注射适当剂量的术前镇痛药（美洛昔康（2.0 mg/kg））。
  5. 在小鼠双眼上涂抹眼用润滑软膏，以防止麻醉期间角膜干燥。
  6. 用70%乙醇对剪毛后的皮肤区域（步骤1.3）进行消毒，随后用氯己定酒精重复消毒两次，以建立手术区域。
  7. 将小鼠转移至小鼠立体定位仪上，先将其鼻部插入立体定位鼻夹，再用耳杆固定颅骨。整个手术过程中，将小鼠置于设定为37 °C的加热垫上以维持体温。维持异氟烷浓度为1%–2%，使小鼠呼吸频率保持在每秒1次。
  8. 必要时重复使用眼用润滑剂，以防止手术过程中角膜干燥。在小鼠耳下身体部位覆盖无菌手术巾，以扩大无菌区域范围。
  9. 使用#10手术刀片，从动物双眼中点后方至头后部（顶骨）沿矢状面平行做一纵向切口。轻轻将皮肤向两侧牵拉，暴露颅骨。
  10. 使用棉签破坏颅骨上的筋膜，并使颅骨干燥以暴露前囟。
  11. 安装带有钻头夹持器的操纵臂，夹持器中装有高速立体定位钻机，钻头直径为.018" 钻头
  12. 钻3个骨孔（.018）" 在右侧感觉运动皮层，以颅骨前囟为参照，分别于前囟外侧2.25 mm、前囟前+0.0 mm、+1.0 mm以及前囟后-1.0 mm处，使用高速立体定位钻钻出直径为……的孔。
  13. 将钻头更换为带有0.375″长针头的26 G注射器。
  14. 将1.5 µL浓度为400 µM的ET-1（溶于无菌PBS中）加入注射器内。为确保液体流动顺畅，先释放少量ET-1，直至针尖可见液滴。注射前用无菌棉签擦去多余液体。
  15. 将针头尖端穿过中央钻孔（位于右侧感觉运动皮层，前囟前方 +0.0 mm，外侧 2.25 mm）的颅骨，但不得刺破硬脑膜。对位后，将针头向下插入脑组织 1 mm。
  16. 每次注入0.1 µL，分次共注射1 µL ET-1。推动Hamilton注射器的推杆释放0.1 µL，等待1分钟后再注入下一个0.1 µL，重复此操作直至累计注入1 µL。
    1. 在最后一次注入0.1 µL（0.1 µL × 10次注射 = 总计1 µL）后，保持针头原位10分钟以防止回流，然后缓慢向上撤出以移除注射器。
  17. 为确保注射过程中针头不被堵塞，先释放少量ET-1，直至针尖可见液滴。注射前用无菌棉签擦去多余液体。每次对下一只动物注射前，需用PREempt对注射器进行灭菌，随后用70%酒精冲洗，最后用无菌PBS冲洗。
  18. 使用4-0号Polysorb聚酯无菌缝线将颅骨上方的皮肤缝合以关闭伤口。
  19. 使用棉签将抗生素软膏涂抹于缝合部位，以预防术后感染。
  20. 将小鼠从立体定位仪上取下，转移至恢复区中一个洁净且预先加热的动物饲养笼内。关闭异氟烷挥发罐和氧气。
  21. 在整个麻醉恢复期间，将笼子放置在加热垫上。或者，若使用加热灯，应将小鼠置于笼子靠近加热灯的一侧，使其在从麻醉中苏醒时可移向笼子较凉的一侧，以避免过热。在接下来的5-10分钟内密切监测小鼠从麻醉中恢复的情况。
  22. 在接下来的3天内监测小鼠状况（体重监测），并根据当地动物护理委员会的规定提供术后护理（提供湿润的软化饲料以确保水分摄入）和镇痛剂（2 mg/kg美洛昔康，皮下注射，每日2次，持续2-3天）。

2. 脑卒中后7天（亚急性模型）或21天（慢性模型）给予腺相关病毒（AAV）

警告：操作腺相关病毒（AAV）时，请参考所在机构的生物安全指南。根据多伦多大学的指南，该手术应在生物安全二级（Containment Level 2）生物安全柜中进行。

注意：所有外科手术器械和材料在手术前均通过高压灭菌器进行灭菌。立体定位仪使用PREempt进行消毒。注射器使用PREempt和70%酒精消毒，并用无菌PBS预冲洗。AAV在手术过程中始终置于冰上保存。

  1. 手术开始前，将清洁的笼盒置于设定为 37 °C 的加热垫上，以准备恢复区域。若使用加热灯，则仅将笼盒的一半置于热源下方。
    1. 将小鼠放入麻醉诱导室，开启氧气，流速调至1-1.5 L/min，随后将异氟烷挥发罐浓度调整至3%-5%，开始麻醉（遵循机构批准的实验方案）。
  2. 当动物侧卧且无法在清洁表面上站立时，将其从麻醉舱中取出。在手术前及手术过程中，通过确认其足趾夹捏反射消失，以确保动物已充分麻醉。
    1. 将麻醉机伸出的鼻罩固定在动物身上，并将异氟烷浓度调整至1%-2%以维持麻醉。尽量减少异氟烷暴露时间（诱导期使用3%-5%浓度，持续5分钟，其余时间使用1%-2%浓度），因为该操作可能需要长达40分钟才能完成。
  3. 称重动物，并根据体重皮下注射适当剂量的术前镇痛药（美洛昔康（2.0 mg/kg））。
  4. 在小鼠双眼上涂抹眼用润滑软膏，以防止麻醉期间角膜干燥。
  5. 用70%乙醇对剪毛后的皮肤区域进行消毒，再用氯己定酒精溶液消毒两次，以形成手术区域。
  6. 将小鼠转移至小鼠立体定位仪，先将其鼻部插入立体定位鼻锥，再用耳杆固定颅骨。整个手术过程中，将小鼠置于设定为37 °C的加热垫上以维持体温。维持异氟烷浓度为1%–2%，使小鼠呼吸频率保持在每秒1次。
  7. 必要时重复使用眼用润滑剂，以防止手术过程中角膜干燥。在小鼠耳下身体部位覆盖无菌手术巾，以扩大无菌区域范围。
  8. 若仍有缝线，使用手术剪剪断缝线，并用镊子去除痂皮。牵拉皮肤以暴露颅骨。
    注意：对于慢性模型，可能需要使用#10手术刀片切除皮肤。
  9. 使用无菌棉签擦干颅骨并定位钻孔位置。
  10. 安装立体定位仪的操纵臂，配备带有26 G注射器（针头长度为0.375″）的针头固定器。
  11. 加入 3.4 µL AAV（1 x 109 急性研究中的基因组拷贝数（GC/µL）；1 × 1010 将AAV注入注射器中（慢性研究使用GC/µL）。为确保流速良好，先释放少量AAV，直至针尖可见液滴。注射前用无菌棉签擦去多余液体。
  12. 将针头尖端穿过用于ET-1注射的第一个颅骨钻孔（位于右侧感觉运动皮层，前囟前方0.0 mm，前囟外侧2.25 mm），但不得刺破硬脑膜。对位后，将针头向下插入脑组织1 mm（前囟坐标：0.0 AP，+2.25 ML，−1.0 DV）。
  13. 注射1 µL AAV（1 x 109 GC/µL 用于急性研究；1 x 1010 每次推出0.1 µL（慢性研究使用GC/µL），推动Hamilton注射器的推杆释放0.1 µL，每次注射后等待1分钟，再进行下一次0.1 µL注射；重复此过程直至累计注射量达1 µL。完成最后一次0.1 µL注射（共10次注射，每次0.1 µL，总计1 µL）后，将针头留置原位10分钟以防止回流，然后缓慢向上拔出以取出注射器。
  14. 为确保注射过程中针头不被堵塞，先释放少量腺相关病毒（AAV），直至观察到针尖处出现液滴。注射前用无菌棉签擦去多余液体。
  15. 重复步骤 2.11–2.14，将 AAV 注入剩余两个颅骨钻孔部位（右侧感觉运动皮层，前囟后 +1 AP、+2.25 ML、−1.0 DV；以及前囟前 −1 AP、+2.25 ML、−1.0 DV mm 处）。每次注射完一只动物后，使用 PREempt 对注射器进行灭菌，随后用 70% 酒精冲洗，最后用无菌 PBS 冲洗。
  16. 使用4-0 Polysorb聚酯无菌缝线将颅骨上方的皮肤缝合以关闭伤口。
  17. 使用棉签将抗生素软膏涂抹于缝合部位，以预防术后感染。
  18. 将小鼠从立体定位仪上取下，转移至恢复区中一个洁净且预先加热的动物饲养笼内。关闭异氟烷挥发罐和氧气。
  19. 将小鼠保留在笼内，在将其置于加热垫上进行麻醉复苏前，使用PREempt和70%酒精对外部笼具进行消毒。
    1. 或者，若使用加热灯，应将小鼠置于笼子中靠近加热灯的一侧，使其在从麻醉状态苏醒时可移向笼内较凉的一侧，以避免过热。在接下来的5-10分钟内密切监测小鼠的苏醒情况。
  20. 在接下来的3天内监测小鼠状况（体重监测），根据当地动物护理委员会的规定，提供术后护理（提供湿润的软质饲料以确保水分摄入）和镇痛剂（美洛昔康，2 mg/kg，皮下注射，每日2次，持续2-3天）。

3. 组织制备与解剖

  1. 处死小鼠时，通过腹腔注射三溴乙醇（Avertin）（浓度 12.5 mg/mL，剂量 250 mg/体重(kg)），并等待 2–3 分钟以确保完全麻醉。将小鼠从笼中取出，通过检测脚趾夹捏反射是否消失来确认动物已充分麻醉。
  2. 在通风橱内，对小鼠进行经心灌注26，先用生理盐水灌注，随后使用 4% 多聚甲醛。将处死动物的头部喷洒 70% 乙醇，直至完全浸湿。
  3. 使用大剪刀在颅底处剪下头部。使用直的 4-1/2" 眼科剪沿整个颅骨中线剪开皮肤。将皮肤向两侧剥离以暴露颅骨。
  4. 从颈部脊髓腔开口处插入眼科剪，沿矢状缝和额间缝剪开颅骨。
  5. 然后将剪刀插入两个眼眶，剪开额鼻缝。
  6. 操作时需特别注意避免损伤脑组织。将颅骨左右两侧骨板撬开，直至脑组织完全暴露。
  7. 将脑组织转移至含有 4% 多聚甲醛的闪烁瓶中。在 4 °C 条件下固定 4 小时。
  8. 随后通过将 4% 多聚甲醛替换为 30% 蔗糖对脑组织进行冷冻保护。在 4 °C 条件下将脑组织置于 30% 蔗糖溶液中，直至脑组织沉降至瓶底（约 12 小时）。

4. 冷冻脑组织切片

  1. 将冷冻切片机腔室的温度设置在 -20 °C 至 -26 °C 之间。
  2. 在小脑处进行冠状面切割，并使用最佳切割温度化合物（OCT）将脑组织扁平的尾侧部分固定在冷冻切片机的样本夹上。
  3. 将带有脑组织的样本夹放入转盘 holder 中，并使嗅球与刀片对齐。
  4. 将脑组织切成厚度为 20 µm 的冠状切片。为避免切片表面出现条纹或划痕，可在切片平台上贴一小段胶带，以在防卷板与平台之间形成微小间隙。在将切片转移至带正电荷的玻璃载玻片之前，可使用画笔调整切片的方向。
  5. 将含有脑切片的载玻片储存在 -20 °C 环境中。

5. 免疫组织化学与定量分析

  1. 根据标准方案，使用针对 NeuN（一种泛神经元标记物）的一抗对组织切片进行免疫组织化学处理22,26。
  2. 将冷冻保存的脑切片在室温下解冻 5 分钟。用 1× 磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤切片三次，每次 5 分钟。
  3. 将切片在含 0.3% Triton X-100 的 PBS 中室温孵育 20 分钟，以进行透化处理。
  4. 配制封闭液（含 5% 正常山羊血清和 0.3% Triton X-100 的 PBS），并将切片在封闭液中室温孵育 1 小时。
  5. 用封闭液按 1:500 比例稀释一抗（兔抗 NeuN 抗体），将切片与一抗溶液在 4 °C 下孵育过夜。
  6. 用含 0.3% Triton X-100 的 PBS 洗涤切片三次，每次 5 分钟。
  7. 用 PBS 按 1:1000 比例稀释二抗（山羊抗兔 568 或 488），将切片与二抗溶液在室温下避光孵育 1 小时。
  8. 用含 0.3% Triton X-100 的 PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。将切片与 DAPI（PBS 中 1:10,000）在室温下孵育 5 分钟。
  9. 再用 PBS 洗涤切片三次，每次 5 分钟。将染色后的切片用荧光封片剂封固于载玻片上，并加盖盖玻片。让封片后的载玻片过夜干燥。
  10. 使用共聚焦显微镜配备 20× 物镜对染色切片成像，获取每只动物 3 个不同冠状切面中梗死灶周围 Reporter+ 细胞的图像（切片范围位于胼胝体前交叉区域至前连合后交叉区域之间）。
    注：AAV 在半球内的扩散范围会有所差异。然而，根据我们的经验以及对 Reporter+ 细胞的组织后分析，AAV 的扩散范围通常约为从前囟前 +3 mm 至后 -3 mm。应定量分析梗死灶周围区域（通过 NeuN 缺失或稀疏染色确定）中胼胝体跨越中线处与前连合连接处之间的 Reporter+ 细胞。
  11. 为定量转导的神经元，进行共定位分析。手动计数脑切片中双阳性细胞（Reporter+NeuN+）的数量以及总转导细胞（Reporter+）的数量。本研究结果中，每只小鼠取 3 个冠状切面，围绕病灶区域（内侧、外侧和下方）计数 >3 个视野。

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结果

为了研究在野生型（C57BL/6J）和转基因 tdTom-Cre 报告小鼠品系（具体为 B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J）22 中，由短片段 GFAP（gfaABC(1)D）启动子驱动的异位 Neurod1 表达对细胞的影响，在 ET-1 脑卒中损伤小鼠模型中使用了两种基于 AAV5 的系统（图 1A-C）。在脑卒中的亚急性模型中，将 Neurod1 包装于 Cre-Flex AAV 系统中，并于脑卒中后第 7 天注射至野生型小鼠体内（图 1B）。第二种 Flex 载体包含由 CAG 启动子驱动的反向 GFP 序列，该序列两侧为异型、反向排列的 loxP 类型重组位点（图 1B）。两种病毒载体在同一时间点（脑卒中后）同时注射。一旦在转导细...

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讨论

本方案详细介绍了两种腺相关病毒（AAV）系统及小鼠模型，用于在轻度至中度内皮素-1（ET-1）诱导的皮层卒中模型背景下研究Neurod1的异位表达。关于ET-1卒中模型的多个关键步骤对于损伤的可重复性和一致性至关重要，需予以充分考虑。钻颅骨孔时必须小心操作，避免刺破硬脑膜，以防造成意外的手术损伤。应使用一致的解剖标志（本研究中为前囟点）以确保目标区域（本研究为感觉运动皮层）的一致性。这一点对于采用行为学评估的研究尤为重要，因为病灶的位置和大小将直接影响功能结果13,22,25,27。最为关键的是，ET-1的注射速率以及操作者在注射器上施加的压力必须保持一致，以获得可重复的结果。需要注意的是，注射器针头可能堵塞，因此在每只动物之间需进行清洁，以确保ET-1的准确递送。在进行组织细胞学分析时，若未观察到卒中病灶，则很可能在手术过程中针头 发生堵塞。如果问题持续...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本工作得到了心脏与中风基金会、安大略再生医学研究所、加拿大卓越研究基金（卓越医学研究计划，Medicine by Design，MbD）以及康诺特创新奖（多伦多大学）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#77 钻头（.018）”)David Kopf Instruments8177
AAV5-GFAP(0.7)-mNeurod1-2A-iCre载体 Biolabs
可吸收缝合线（带针）Polysorb™ 聚酯线 CV-15 3/8 圆体锥形针 4-0号 编织线CovidienGL-881
抗NeuN抗体（兔） Millipore SigmaABN78 
C57BL/6 小鼠查尔斯河实验室027
氯己定溶液PartnarPCH-020
Contec™ PREempt™ 即用型消毒液Fisher Scientific29-636-6212
冷冻切片机赛默飞世尔科技 HM525 NX 
内皮素1Millipore Sigma05-23-3800-0.5MG
羽毛安全剃刀切片刀片羽毛12-631P
Fisherbrand 盖玻片：矩形Fisher Scientific12-545M 
荧光封片剂安捷伦科技S3023 
汉密尔顿注射器Hamilton公司7634-01
高速立体定位钻机David Kopf Instruments1474
美达佳溶液（美洛昔康）勃林格殷格翰
O.C.T. 包埋剂Fisher Scientific23-730-571
pAAV2/5-GFAP-iCre载体构建P190924-1001suq
Polyderm 软膏 USPTARO2181908
SOMNI 科学™ 动物体温加热垫Fisher Scientific04-777-177
立体定位仪David Kopf InstrumentsModel 902
Superfrost Plus 显微镜载玻片，白色Fisherbrand12-550-15
tdTomato 报告基因小鼠 杰克逊实验室007914
V-1 台式实验动物麻醉系统VetEquip901806

参考文献

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