方法文章

AAV 系统和小鼠模型，用于研究缺血性卒中后亚急性和慢性转导细胞中 Neurod1 的异位表达

DOI：

10.3791/66965

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2024年11月29日

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1Department of Surgery, Division of Anatomy, University of Toronto, 2Institute of Medical Science, University of Toronto, 3Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 4Donnelly Centre for Cellular and Biomedical Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该方案描述了皮质缺血性中风后病毒介导的 Neurod1 异位表达。Neurod1 在中风后亚急性期（7 天）在野生型小鼠中使用 Cre-Flex AAV 系统递送，以及 （2） 在中风后慢性期（21 天）在条件报告小鼠中使用单个 AAV 载体。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神经源性因子 在体内 的异位表达已成为一种很有前途的替代疾病模型中丢失的神经元的方法。神经碱性螺旋-环-螺旋 （bHLH） 转录因子 通过 非繁殖病毒样颗粒系统（包括逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒 （AAV））的使用已被广泛报道。对于 体内 实验，AAV 因其低致病性和潜在的可转化性而被广泛使用。该方案描述了两种 AAV 系统，用于研究缺血性卒中后转导细胞中转录因子的异位表达。在这两个系统中，Neurod1 表达都受短 GFAP （gfaABC（1）D） 启动子控制，当与神经源性因子表达结合时，该启动子在卒中后反应性星形胶质细胞以及内源性神经元中上调。在所描述的缺血性卒中模型中，通过将内皮素-1 （ET-1） 注射到小鼠的运动皮层中来诱导局灶性缺血，从而产生一个被表达反应性 GFAP 的星形胶质细胞和存活神经元包围的病变。进行 AAV 的脑内注射以在中风后亚急性 （7 天） 和慢性 （21 天） 期异位诱导 Neurod1 的表达。在 AAV 注射后几周内，与接受 AAV 对照病毒的小鼠相比，在异位表达 Neurod1 的小鼠中鉴定出转导细胞中的神经元数量显着增加。基于 AAV 的策略使用了在轻度至中度皮质卒中模型中表达报告基因的神经元数量增加的重复观察结果。该协议建立了一个标准平台，用于探索基于 AAV 的系统递送的转录因子异位表达的影响，有助于理解中风背景下神经源性因子的表达。

引言

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中风是全世界残疾的主要原因1。当流向大脑的血流中断时，就会发生中风。这可能是通过出血性中风（~15% 的病例）发生的，此时大脑中的血管破裂，也可能通过缺血性中风（流向大脑的血液受阻）发生1。缺血性中风最为普遍，占中风病例的 ~85%1。中风会减少向大脑输送葡萄糖和氧气，导致神经元细胞迅速死亡和神经功能受损。

缺血性中风通过兴奋性毒性、氧化和亚硝化应激、钙失调、皮质扩散去极化、水肿、血脑屏障 （BBB） 破坏和炎症等机制，导致病灶核心细胞在几分钟内丢失 2,3。梗死周围区域的细胞在数小时内发生凋亡细胞死亡，中风后会持续数天4。梗死周围环境暴露于促炎和抗炎信号，导致小胶质细胞和星形胶质细胞（"反应性"星形胶质细胞）激活，它们在受伤后发挥多种作用 5,6,7,8。反应性星形胶质细胞会发生许多表型变化，包括神经胶质纤维酸性蛋白 （GFAP） 的上调，以及在中风后几天内在病灶周围形成边界，这有助于限制病灶的范围并影响受伤组织内的神经可塑性 8,9,10。

直接细胞重编程允许将一种成熟细胞类型转化为另一种成熟细胞类型，而无需经历多能状态11。将常驻的脑细胞转化为新的神经元来替代因受伤而失去的神经元，是大脑恢复的一条有吸引力的途径。中风是基于细胞的治疗的理想靶点，因为有必要使用治疗方法来替代丢失的神经元，拓宽治疗时间，并最终促进功能恢复。为此，有许多论文证明了星形胶质细胞到神经元 （AtN） 重编程，使用多种碱性螺旋-环-螺旋 （bHLH） 神经源性转录因子，包括 Ascl1、Neurog2、Neurod1 和最近的 Ascl1 突变版本 （Ascl1-SA6），显示出改进的重编程功效 11,12,13,14.需要考虑的重要因素是许多可能影响结果、解释和研究之间比较的实验设计因素。Ghazale 等人证明，当使用相同的 bHLH 转录因子14 时，AtN 重编程效率在不同小鼠品系、AAV 血清型和启动子之间有所不同。其他考虑因素，例如损伤模型、大脑区域、病毒剂量、基因递送的时间、重编程因子和递送方式，将影响结果。最近的报告表明，预先存在的转导神经元被误解为重编程神经元15,16。虽然这些报告不一定否定 AtN 转化的发生，但这些研究强调了控制良好的实验的重要性，并且几篇论文为该领域的下一步提出了建议 15,17,18,19。从文献中可以明显看出，bHLH 转录因子的异位表达可以改善各种神经退行性疾病/损伤动物模型的功能结果 13,20,21,22,23,24。

在此，该方案 Neurod1 是一种感兴趣的转录因子，在转导的细胞中异位表达13,22。使用成熟的成年小鼠感觉运动皮层缺血性中风的内皮素-1 （ET-1） 模型。注射 ET-1 导致局部血管收缩，类似于缺血性中风的病理生理学，包括功能障碍 22,23,25。常用的短 GFAP 启动子 （gfaABC（1）D） 用于使用两种病毒策略驱动 Neurod1 在损伤部位和病灶周围区域的异位表达:（1） 野生型小鼠中的 AAV5-CAG-Flex::GFP+AAV5-GFAP-Neurod1-Cre 递送和 （2） tdTom-Cre 报告小鼠中的 AAV5-GFAP-Neurod1-Cre 递送。为了进一步了解 Neurod1 在中风损伤脑中异位表达的可能性，在中风后亚急性期 （7 天） 或慢性期 （21 天） 给药。在这两种范式中，在异位 Neurod1 表达后几周内发现的标记神经元明显更多。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议得到了多伦多大学动物护理委员会的批准，并遵守实验 动物护理和使用指南 （第 2 版，加拿大动物护理委员会，2017 年）。在本研究中，野生型 （C57BL/6J） 和转基因 tdTom-Cre 报告基因 （B6.使用 Cg-Gt（ROSA）26Sortm14（CAG-tdTomato）Hze/J）22 小鼠品系。小鼠 7-9 周龄，包括雄性和雌性。所用试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 内皮素-1 中风手术

注意:所有手术器械和材料在手术前都通过高压灭菌器进行消毒。立体定位框架用 PREempt 消毒。注射器用 PREempt、70% 酒精消毒，并在手术前用无菌 PBS 灌注。内皮素 1 （ET-1） 在整个手术过程中储存在冰上。

  1. 在开始手术之前，通过在设置为 37 °C 的加热垫上放置一个干净的笼子来设置恢复区域。 或者，如果使用加热灯，则仅将笼子的一半置于高温下。
    1. 要使用异氟醚麻醉小鼠，请遵循动物护理委员会批准的方案。将鼠标放入麻醉诱导室，将氧气打开至 1-1.5 L/min，然后将异氟醚蒸发器调节至 3%-5% 以开始麻醉。
  2. 一旦动物侧躺并且无法再站立，就将其从腔室中取出，并将其放在干净的表面上。通过在手术前和整个手术过程中确认没有脚趾捏反射，确保动物得到充分麻醉。
    1. 将从麻醉机伸出的鼻锥固定在动物身上，并将异氟醚调整至 1%-2% 以进行维护。尽量减少与异氟醚的接触（诱导在 3%-5% 下 5 分钟，剩余时间在 1%-2%），因为该过程可能需要长达 40 分钟才能完成。
  3. 使用动物毛发修剪器去除动物颈部/耳后到鼻子的毛皮，露出颅骨上的皮肤进行手术。
  4. 称量动物并根据体重皮下注射适当剂量的术前镇痛药（美洛昔康（2.0 mg / kg））。
  5. 在小鼠的每只眼睛上涂抹眼润滑剂软膏，以防止麻醉期间角膜干燥。
  6. 用 70% 乙醇对毛皮修剪的皮肤区域（步骤 1.3）进行消毒，然后用洗必泰醇两次以形成手术区域。
  7. 首先将鼠标的鼻子放在立体定位鼻锥中，然后用耳杆稳定头骨，将鼠标转移到鼠标立体定位框架上。将鼠标放在设置为 37 °C 的加热垫上，以在整个手术过程中提供热支持。将异氟醚保持在 1%-2%，使小鼠的呼吸频率为 1 次呼吸/秒。
  8. 如果需要，在手术过程中重复涂抹眼睛润滑剂以防止角膜干燥。在小鼠身体上，耳朵下方涂上无菌手术布，以扩大无菌区域的大小。
  9. 用 #10 手术刀刀片从眼睛中点后面到后脑勺（顶骨）做一个平行于动物矢状面的垂直切口。轻轻地将皮肤向两侧缩回，露出头骨。
  10. 使用棉签破坏颅骨上的筋膜，让颅骨干燥以露出前囟。
  11. 设置带有钻头支架的机械手臂，该钻头携带高速立体定位钻头。
  12. 在前囟外侧 2.25 毫米和前囟外侧 +0.0 毫米、+1.0 毫米前部和 -1.0 毫米尾部到前囟的右感觉运动皮层的坐标处用高速立体定位钻 3 个毛孔（直径 .018 英寸）。
  13. 用 26 G 注射器和 0.375 英寸长的针头替换钻头。
  14. 将 1.5 μL 溶解在无菌 PBS 中的 400 μM ET-1 装入注射器中。为确保良好的流动，释放少量 ET-1，直到在针尖观察到一滴。在进行注射之前，使用无菌棉签擦去多余的部分。
  15. 将针尖降低穿过中间毛刺孔中的颅骨（在右感觉运动皮层中 + 0.0 前和 2.25 毫米外侧），而不刺穿硬脑膜。对齐后，将针头降低到大脑中 1 毫米。
  16. 一次分配 0.1 μL 注入 1 μL ET-1。向前推动 Hamilton 注射器的柱塞以分配 0.1 μL，并等待一分钟，然后再注入下一个 0.1 μL，注射直到分配 1 μL。
    1. 分配完最终的 0.1 μL 后（0.1 μL x 10 次进样 = 总共 1 μL），将针头保持在原位 10 分钟以防止回流，然后缓慢向上抽出以取出注射器。
  17. 为确保针头在注射过程中不会堵塞，请释放少量 ET-1，直到在针尖观察到一滴。在进行注射之前，使用无菌棉签擦去多余的部分。在给下一只动物注射 PREempt 之前，先对注射器进行消毒，然后注射 70% 酒精，然后注射无菌 PBS。
  18. 为了闭合伤口，使用 4-0 polysorb 聚酯无菌缝合线将颅骨上的覆盖皮肤缝合在一起。
  19. 使用棉签在缝合区域涂抹抗生素软膏，以防止术后感染。
  20. 将鼠标从立体定位框架上取下，并将其转移到恢复区干净、预热的动物笼中。关闭异氟醚蒸发器和氧气。
  21. 在麻醉恢复期间将笼子放在加热垫的顶部。或者，如果使用加热灯，请将鼠标放在笼子的一侧，在灯下，这样鼠标在从麻醉中醒来时可以移动到笼子的凉爽一侧，以防止过热。在接下来的 5-10 分钟内监测小鼠从麻醉中出来。
  22. 在接下来的 3 天内监测小鼠（体重监测），提供术后护理（湿润的捣碎食物以确保水合作用）和镇痛药（2 mg/kg 美洛昔康，每天 2 次皮下注射，持续 2-3 天）根据当地动物护理委员会制定的规定。

2. 中风后腺相关病毒 （AAV） 分娩（7 天 - 亚急性模型或 21 天 - 慢性模型）

注意: 请参阅机构生物安全指南，了解如何使用 AAV。根据多伦多大学的指导方针，该手术在 2 级安全壳中进行。

注意:所有手术器械和材料在手术前都通过高压灭菌器进行消毒。立体定位框架用 PREempt 消毒。注射器用 PREempt、70% 酒精消毒，并用无菌 PBS 引发。在整个手术过程中，AAV 都储存在冰上。

  1. 在开始手术之前，通过在设置为 37 °C 的加热垫上放置一个干净的笼子来设置恢复区域。 或者，如果使用加热灯，则仅将笼子的一半置于高温下。
    1. 要使用异氟醚麻醉小鼠，请将小鼠置于麻醉诱导室中，将氧气打开至 1-1.5 L/min，然后将异氟醚蒸发器调节至 3%-5% 以启动麻醉（遵循机构批准的方案）。
  2. 一旦动物侧躺并且不能再站在干净的表面上，就将其从腔室中取出。通过在手术前和整个手术过程中确认没有脚趾捏反射，确保动物得到充分麻醉。
    1. 将从麻醉机伸出的鼻锥固定在动物身上，并将异氟醚调整至 1%-2% 以进行维护。尽量减少与异氟醚的接触（诱导在 3%-5% 下 5 分钟，剩余时间在 1%-2%），因为该过程可能需要长达 40 分钟才能完成。
  3. 称量动物并根据体重皮下注射适当剂量的术前镇痛药（美洛昔康（2.0 mg / kg））。
  4. 在小鼠的每只眼睛上涂抹眼润滑剂软膏，以防止角膜干燥处于麻醉状态。
  5. 用 70% 乙醇对剪过的皮毛区域进行消毒，然后用洗必泰醇消毒两次，形成手术区域。
  6. 首先将鼠标的鼻子放在立体定位鼻锥中，然后用耳杆稳定头骨，将鼠标转移到鼠标立体定位框架上。将鼠标放在设置为 37 °C 的加热垫上，以在整个手术过程中提供热支持。将异氟醚保持在 1%-2%，使小鼠显示 1 次呼吸/秒的呼吸频率。
  7. 如果需要，在手术过程中重复涂抹眼睛润滑剂以防止角膜干燥。在小鼠身体上，耳朵下方，涂上无菌手术布，以扩大无菌区域的大小。
  8. 如果仍然存在，请用一把手术剪刀剪断缝合线，然后用一把镊子去除结痂。缩回皮肤以露出头骨。
    注意:对于慢性模型，可能需要用 #10 手术刀刀片切除皮肤。
  9. 使用无菌棉签擦干颅骨并找到毛孔。
  10. 用针头支架设置立体定位装置的机械臂，该针头支架带有 26 G 注射器和 0.375 英寸长的针头。
  11. 将 3.4 μL AAV（急性研究为 1 x 109 基因组拷贝 （GC）/μL;慢性研究为 1 x10 10 GC/μL）装入注射器。为确保流速良好，释放少量 AAV，直到在针尖观察到一滴。在进行注射之前，使用无菌棉签擦去多余的部分。
  12. 将针尖降低穿过用于 ET-1 的第一个毛刺孔中的颅骨（在前囟前 + 0.0 和外侧 2.25 毫米的右侧感觉运动皮层），而不刺穿硬脑膜。对齐后，将针头降低到大脑中 1 毫米。（0 AP，+2.25 ML，-1.0 DV 来自前囟）。
  13. 一次分配 0.1 μL 注射 1 μL AAV（急性研究为 1 x 109 GC/μL;慢性研究为 1 x10 10 GC/μL）。向前推动 Hamilton 注射器的柱塞以分配 0.1 μL，并等待一分钟后再注入下一个 0.1 μL;进样至 1 μL 分液。分配完最终的 0.1 μL 后（0.1 μL x 10 次进样 = 总共 1 μL），将针头保持在原位 10 分钟以防止回流，然后缓慢向上抽出以取出注射器。
  14. 为确保针头在注射过程中不会堵塞，请释放少量 AAV，直到在针尖观察到一滴。在进行注射之前，使用无菌棉签擦去多余的部分。
  15. 重复步骤 2.11-2.14，将 AAV 注射到剩余的两个毛孔中（在距离前囟 +1 AP、+2.25 ML、-1.0 DV 和 -1 AP、+2.25 ML、-1.0 DV mm 的右侧感觉运动皮层中。在给下一只动物注射 PREempt 之前，对注射器进行消毒，然后是 70% 的酒精，最后是无菌 PBS。
  16. 为了闭合伤口，使用 4-0 polysorb 聚酯无菌缝合线将颅骨上的覆盖皮肤缝合在一起。
  17. 用棉签在缝合区域涂抹抗生素软膏，以防止术后感染。
  18. 将鼠标从立体定位框架上取下，并将其转移到恢复区干净、预热的动物笼中。关闭异氟醚蒸发器和氧气。
  19. 将鼠标放在笼子内，用 PREempt 和 70% 酒精对笼子外部进行消毒，然后将其放在加热垫顶部以从麻醉中恢复。
    1. 或者，如果使用加热灯，请将鼠标放在灯下方的笼子一侧，以便鼠标在从麻醉中醒来时可以移动到笼子的凉爽一侧，以防止过热。在接下来的 5-10 分钟内监测小鼠从麻醉中出来。
  20. 在接下来的 3 天内监测小鼠（体重监测），提供术后护理（湿润的捣碎食物以确保水合作用）和镇痛药（2 mg/kg 美洛昔康，每天 2 次皮下注射，持续 2-3 天）根据当地动物护理委员会制定的规定。

3. 组织制备和解剖

  1. 为了对小鼠实施安乐死，腹膜内注射三溴乙醇 （Avertin） （浓度 12.5 mg/mL，250 mg/BW（kg）） 并等待 2-3 分钟以完全诱导。通过将鼠标从笼子中取出并确认没有脚趾捏反射，确保动物得到充分麻醉。
  2. 在通风橱中，用生理盐水进行经心灌注26 ，然后用 4% 多聚甲醛。用 70% 乙醇喷洒安乐死动物的头部直至浸泡。
  3. 用一把大剪刀剪掉头骨底部的头部。用 4-1/2 英寸的直虹膜剪刀沿着整个头骨的中线剪开皮肤。缩回皮肤以露出头骨。
  4. 从颈部的脊髓腔开口开始，插入虹膜剪刀，沿着矢状线和额间缝合线切开颅骨。
  5. 然后将剪刀插入两个眼窝，剪断额鼻缝合线。
  6. 特别注意不要损伤大脑。向左和向右撬开颅骨板，直到大脑暴露出来。
  7. 将大脑转移到含有 4% 多聚甲醛的闪烁瓶中。将大脑在 4 °C 的 4% 多聚甲醛中保持 4 小时。
  8. 然后通过用 30% 蔗糖代替 4% 多聚甲醛对大脑进行冷冻保护。将大脑保持在 4 °C 的 30% 蔗糖中，直到大脑沉到小瓶底部（~12 小时）。

4. 切片冷冻的大脑

  1. 将低温恒温器室的温度设置在 -20 °C 至 -26 °C 之间。
  2. 在小脑上做一个冠状切口，并将大脑的扁平尾部连接到具有最佳切割温度化合物 （OCT） 的低温恒温器卡盘上。
  3. 将带有大脑的卡盘放入磁盘支架中，并将嗅球与刀片对齐。
  4. 将大脑切成厚度为 20 μm 的冠状切片。为避免切片脑切片上出现条纹或划痕，请在切片平台上放置一条胶带，在防滚板和平台上形成一个小间隙。可以使用画笔调整截面的方向，然后再将其捕获到带正电的载玻片上。
  5. 将含有脑切片的载玻片储存在-20°C。

5. 免疫组化和定量

  1. 根据标准方案，使用抗 NeuN（一种泛神经元标志物）的一抗处理切片进行免疫组织化学22,26。
  2. 在室温下解冻冷冻保存的脑切片 5 分钟。用 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
  3. 在室温下将切片在 PBS 中的 0.3% Triton X-100 中孵育 20 分钟以透化。
  4. 准备封闭溶液（5% 正常山羊血清和 0.3% Triton X-100 的 PBS 溶液），并在室温下将切片在封闭溶液中孵育 1 小时。
  5. 在封闭溶液中以 1:500 的比例稀释一抗兔抗 NeuN。将切片与一抗溶液在 4 °C 下孵育过夜。
  6. 用 0.3% Triton X-100 的 PBS 溶液洗涤切片 3 次，每次洗涤 5 分钟。
  7. 在 PBS 中以 1:1000 的比例稀释二抗山羊抗兔 568 或 488。将切片与二抗溶液在室温下避光孵育 1 小时。
  8. 在 PBS 中用 0.3% Triton X-100 进行 3 次洗涤，每次 5 分钟。在室温下用 DAPI（PBS 中 1:10,000）孵育切片 5 分钟。
  9. 用 PBS 再洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。将染色切片用荧光封固剂和玻璃盖玻片固定在载玻片上。让封固的玻片干燥过夜。
  10. 使用共聚焦显微镜的 20 倍物镜对载玻片进行成像，以获得每只动物在 3 个不同冠状切片（胼胝体前交叉和前连合交叉的解剖区域之间）中中风病变周围 Reporter+ 细胞的视图。
    注意:AAV 传播的距离在半球内会有所不同。然而，根据我们的经验和对 Reporter+ 细胞的组织处理后分析，AAV 扩散通常从囟开始跨越大约 +3 mm 至 -3 mm。应量化胼胝体穿过中线和前连合连接之间区域的卒中病变周围的报告 + 细胞（通过 NeuN 的缺失/稀疏染色确定）。
  11. 为了定量转导的神经元，进行共定位分析。手动计数脑切片中双阳性细胞的数量 （Reporter+NeuN +） 和转导的 （Reporter+） 细胞总数。对于此处的结果，从每只小鼠的 3 个冠状切片计算病变周围 （内侧、外侧和下部） 的 > 3 个视野。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

检查短 GFAP （gfaABC（1）D） 启动子驱动的异位 Neurod1 在野生型 （C57BL/6J） 和转基因 tdTom-Cre 报告菌株 （特别是 B6.Cg-Gt（ROSA）26Sortm14（CAG-tdTomato）Hze/J）22 两种基于 AAV5 的系统用于 ET-1 中风受伤小鼠（图 1A-C）。在亚急性中风模型中，Neurod1 被包装在 Cre-Flex AAV 系统中，并在中风后第 7 天递送给野生型小鼠（图 1B）。第二个 Flex 载体包含由 CAG 启动子驱动的 GFP 的倒置序列，该序列的两侧是异质性的、反平行的 loxP 型重组位点（图 1B）。中风后两种病毒构建体同时注射在一起。一旦 Cre 在转导的细胞中表达，GFP 就会在重组位点被倒置并切除，使序列定向到正义方向，从而允许 GFP 的表达。因此，表达 Cre 的细胞将是 GFP 阳性，表明它们已被 Cre-Flex 载体转导。在亚急性模型中，在转导后 21 天 （即中风后 28 天） 处死小鼠，并在中风受伤大脑的实质中计数转导细胞的数量 （GFP+） 以及 NeuN+GFP+ （表达 NeuN 的转导细胞） 细胞的数量。如图 2A 所示，神经元在缺血性损伤部位丢失。使用 Cre-Flex AAV 系统对亚急性范式中的转导细胞进行定量显示，与 Stroke-Cre 对照小鼠相比，Neurod1 处理的小鼠中标记的神经元（NeuN+GFP+/GFP+细胞）明显更多（43.05 +/- 5.50% vs. 18.43 +/- 3.03% NeuN+GFP+/GFP+ 细胞，在 Stroke-Neurod1 中对。分别是 Stroke-Cre（对照）治疗的小鼠）（p = 0.0172）（图 2B，C）。

在另一组实验中，AtN 转换是在慢性中风模型中进行的（图 1B、C）。转录因子 Neurod1 在中风后第 21 天被递送给 ET-1 中风损伤的 tdTom-Cre 报告小鼠 （图 1C）。与野生型小鼠中使用的 Cre-Flex 系统相同， Neurod1 表达由短 GFAP 启动子驱动。然而，在该系统中，单个 AAV 构建体与 Neurod1 之后的 Cre 重组酶一起使用（图 1B）。因此，表达 GGAP 的细胞将产生 Cre 重组酶，诱导 tdTom 报告基因，表明细胞已被 AAV 转导。小鼠在中风后 77 天 （AAV 后 8 周） 处死 （图 1C）。如图 3A 所示，在 tdTom-Cre 小鼠中风后第 77 天观察到皮质病变。量化表达神经元标志物 NeuN+ 的转导细胞的数量（中风后慢性期 （NeuN+tdTom+/tdTom+ 细胞的相对百分比），发现接受 Stroke-Neurod1 的小鼠与 Stroke-Cre 对照小鼠相比，具有显着更多的标记神经元（74.81 +/- 4.835% vs. 53.05 +/- 5.028% NeuN+tdTom+/tdTom+ 细胞在 Stroke-Neurod1vs.分别是 Stroke-Cre （对照）处理的小鼠）（p = 0.0355）（图 3B，C）。

总体而言，结果表明，在野生型和 tdTom-Cre 报告小鼠的亚急性和慢性中风后阶段，使用两种不同的基于 AAV 的系统，神经元的基线转导和表达 NeuN+ 和 Neurod1 递送的转导细胞数量增加。

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图 1: Neurod1 的异位表达、向量和时间线。 （A） 通过内皮素 1 （ET-1） 注射到小鼠运动皮层中诱导卒中的图形表示。腺相关病毒 （AAV） 在 ET-1 注射部位以及病变周围 1 毫米前部和后部的 3 个部位递送。放大面板显示运动皮层中带有 AAV-Neurod1 的转导细胞。（B） 将 Cre-Flex 系统中递送给野生型小鼠的两种 AAV 载体的示意图（上图）。AAV5 载体 1 包含短 GFAP 启动子、 Neurod1 转录因子和 Cre 重组酶序列，两侧是 loxP 位点（黑色三角形）和 lox2272 位点（白色三角形）。AAV5 载体 2 携带倒置的 GFP 基因报告基因序列，两侧是一对 loxP 和 lox2272 位点。两种载体在细胞中的转导导致 Cre 介导的切除和倒置，使 GFP 表达能够标记转导的细胞。 Neurod1 也使用一种 AAV5 载体（下图）递送给 tdTom-Cre 小鼠。在 AAV5 载体 1 中，包装了短 GFAP 启动子、 Neurod1 转录因子和 Cre 重组酶序列。转导细胞中的 Cre 表达驱动 loxP 位点（黑色三角形）终止密码子的切除，从而实现 tdTomato 表达。（C） 在中风后亚急性期（中风后第 7 天）注射 AAV 的野生型小鼠中对 Cre-Flex 系统进行了测试。野生型小鼠在 AAV 转导后 21 天 （卒中后 28 天） 处死。在卒中后慢性期 （卒中后第 21 天） 向 tdTom-Cre 小鼠递送 AAV，并在 AAV 转导后 56 天 （卒中后 77 天） 处死小鼠。 请单击此处查看此图的较大版本。

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图 2:在中风后亚急性期使用 Cre-Flex AAV 进行异位 Neurod1 递送导致表达 NeuN 的转导细胞数量增加。 （A） 中风后第 28 天，Stroke-Cre 对照（左）和 Stroke-Neurod1 （右）小鼠通过运动皮层对冠状脑切片进行免疫染色。在病变部位观察到神经元丢失（白色虚线）。在皮层中可以看到转导细胞 （GFP+， 绿色）、神经元 （NeuN+， 红色） 和共定位的 NeuN+GFP+ （橙色） 细胞。比例尺:250 μm。（B） Stroke-Cre 对照（上）和 Stroke-Neurod1 （下）脑组织的代表性图像，显示神经元（NeuN + ，红色）和 AAV 转导的 GFP + （绿色）。以白色勾勒的插图显示了每个单独通道的单元格特写。白色箭头表示 AAV 转导的细胞 （GFP+）。白色箭头表示共定位的 NeuN+GFP+ 细胞。比例尺:125 μm。（C） Stroke-Cre 和 Stroke-Neurod1 小鼠中 NeuN+GFP+/GFP+细胞的定量。N = 每组 3 只小鼠。数据表示为 SEM ±平均值。Shapiro-Wilk 检验 （p = 0.3223）。未配对 的 t 检验，*p < 0.05。 请单击此处查看此图的较大版本。

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图 3:中风后慢性期 tdTom-Cre 报告小鼠的异位 Neurod1 递送导致表达 NeuN 的转导细胞数量增加。 （A） 中风后第 77 天通过 Stroke-Cre 对照和 Stroke-Neurod1 小鼠通过运动皮层对冠状脑切片进行免疫染色。缺血性损伤部位可见神经元丢失（白色虚线）。转导的细胞在梗死周围用 tdTom （红色） 标记。NeuN+tdTom+（橙色）是表达神经元标志物的转导细胞。比例尺:250 μm。（B） Stroke-Cre 对照（上）和 Stroke-Neurod1 （下）脑组织的代表性图像，显示神经元（NeuN + ，绿色）和 AAV 转导细胞（tdTom +，红色）。以白色勾勒的插图显示了每个单独通道的单元格特写。白色箭头表示 AAV 转导的细胞 （tdTom+）。白色箭头表示共定位的 NeuN+tdTom + 细胞。比例尺:125 μm。（C） 慢性范式中 NeuN + tdTom + / tdTom + 细胞的定量显示，在 Neurod1 处理的小鼠中，表达 NeuN + 的转导细胞（NeuN + tdTom + / tdTom + 细胞）明显更多。N = 每组 3 只小鼠。数据表示为 SEM ±平均值。Shapiro-Wilk 检验 （p = 0.2044）。未配对 的 t 检验，*p < 0.05。 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

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该协议详细介绍了两个 AAV 系统和小鼠模型，用于在轻度至中度 ET-1 皮质卒中模型的背景下研究 Neurod1 的异位表达。与 ET-1 中风相关的许多关键步骤对于损伤的可重复性和一致性很重要。必须小心地钻出钻孔，不要刺穿硬脑膜，以防止意外的手术损伤。使用一致的标志（在本例中为前囟）以确保相似的感兴趣区域（本研究中为感觉运动皮层）非常重要。这对于使用行为评估的研究尤其重要，因为病变位置和大小会影响功能结果 13,22,25,27。最重要的是，ET-1 的注射速率和外科医生对注射器施加的压力需要一致，以获得可重复的结果。值得注意的是，注射器的针头可能会堵塞，需要在动物之间进行清洁，以确保 ET-1 的准确输送。在组织细胞分析过程中，如果未观察到中风病变，则针头可能在手术过程中堵塞。如果问题仍然存在，请从制造商处获取新批次的内皮素-1，因为过去曾观察到批次依赖性效力问题。

输送 AAV 的外科手术步骤与 ET-1 卒中诱导方案的步骤相似。因此，上述考虑因素至关重要。此外，AAV 病毒滴度和体积必须一致，以确保可以比较各组的转导效率。在该方案中，用于急性研究的 1 x 109 GC/μL AAV 和用于慢性研究的 1 x 1010 GC/μL AAV。关键是要选择足够低的病毒剂量，以尽量减少人为错误表达，同时仍然足够高以确保足够的细胞转导，从而能够检测实验组之间的差异。此类研究的最佳病毒剂量范围已确定为 10、7-10、10 GC/μL13,24。较高的 AAV 滴度不仅导致对照组中神经元的广泛标记，而且还被证明会诱导星形红细胞增多症，破坏血脑屏障，并上调炎症反应28,29。调查中风后病毒介导的转录因子递送的研究使用了不同的 AAV 注射递送部位。一项研究描述了使用单次 AAV 注射到卒中病变部位成功标记转导细胞13。其他研究针对梗死区域周围的 1 到 3 个区域30。在此，AAV 在三个位置给药，1 次在 ET-1 注射部位的坐标处注射，2 次在病灶部位周围注射（1 次在前 1.0 mm 注射，1 次在后 1.0 mm 注射），目的是在病灶周围神经胶质细胞边界转导反应性星形胶质细胞9。在组织细胞分析过程中，如果没有或很少（1-10 个细胞/切片）观察到荧光细胞，则可能是针头在注射过程中被堵塞，或者 AAV 冻融次数过多，导致病毒失活。

在轻中度卒中模型中检查了不同时间的转导效率，结果表明，在卒中后亚急性和慢性时间，在 Neurod1 治疗的大脑中标记的神经元明显更多。这里展示的工作首次证明了 Neurod1 在中风后慢性期的转导，并揭示了神经元在中风后长达 8 周内异位表达 Neurod1。虽然在接受 Neurod1 与对照载体的中风损伤大脑中观察到转导神经元数量增加的发现与 Neurod1 在 AtN 转换中发挥作用一致，但解释细胞结果需要对实验范式的局限性有充分的了解。绝大多数调查 AtN 转化的已发表研究都使用 GFAP 作为启动子，因为 GFAP 在神经退行性疾病（包括中风）的反应性星形胶质细胞中上调 4,31。然而，已经表明低 GFAP 表达也发生在神经元中 32。这与此处报道的发现一致，其中对照组 （Stroke-Cre） 中一定比例的转导细胞是预先存在的神经元32。具体来说，该方案中的 Stroke-Cre 对照组显示 NeuN + Reporter+ 细胞的标记为 18.43 +/- 3.03% 和 53.05 +/- 5.028%，这代表了预先存在的神经元的标记，表明神经元中 GFAP 启动子驱动的表达。事实上，Neurod1 的靶向表达取决于许多因素，包括病毒嗜性。AAV5 已被证明可以在不同的大脑区域（包括感觉运动皮层）以不同的效率转导神经元，表明 AAV 血清型具有区域细胞嗜性，这在诱导转录因子异位表达的研究中需要考虑31,33。小鼠品系也可影响 AAV 转导14,34。一项比较野生型 （C57BL/6J） 和 FVB/N 小鼠纹状体中 AAV 转导的研究发现，两种菌株的细胞嗜性和转导效率存在差异34。

Cre-Flex 系统的一个优点是它可用于野生型小鼠的长期标记，这可能减少 Cre-reporter 小鼠系中存在的非特异性 Cre 表达问题15,35。Cre-Flex 系统的一个缺点是，由于 0.1%-0.8% 的病毒颗粒在病毒生产过程中重组了 LoxP 位点，因此可能会发生不依赖 Cre 的转基因表达36。这些发现强调了谱系追踪实验的重要性，例如，在 AAV 给药前使用 Aldh1l1-CreERT2 小鼠系预先标记星形胶质细胞，以确保在报告结论时不会高估 AtN 转化率15。研究表明，通过下游基因（如 Neurod1）的顺式调控激活人 GFAP 启动子（如这些研究中使用的）可能导致内源性神经元中的 GFAP 表达，从而导致治疗组中标记神经元的数量增加15,32。总之，这些研究和此处的研究结果强调了谱系追踪实验的重要性，例如，在 AAV 给药前预先标记星形胶质细胞或神经元，以便在分析过程中区分预先存在的神经元和内源性神经元15。

在考虑可能减少神经元转导的后续步骤时，不同的 AAV 血清型和/或使用混杂程度较低的星形胶质细胞特异性启动子将是有用的19。如果星形胶质细胞的不同亚群通常更容易受到 AtN 转化的影响，则描述星形胶质细胞异质性的报告数量增加可能会进一步影响基因表达特异性 37,38,39,40。

损伤或疾病的临床前模型中使用的动物年龄也是一个重要的考虑因素，可能会引入可变结果。例如，在神经创伤的情况下，年龄会影响星形胶质细胞反应性，这会影响 AtN 转换的研究结果41。此外，Cre 诱导型报告基因系会随着时间的推移而失去表达特异性，这会影响结果测量42。迄今为止，尚未全面研究老年动物的重编程43。

该方案描述了中风后 AAV 的 2 个阶段:（1） 缺血性中风后亚急性期（7 天）和 （2） 慢性期（21 天）。尚未检查慢性卒中模型中 Neurod1 的异位表达;因此，观察到在这个晚期标记了更多的神经元，这对未来旨在促进慢性中风中风恢复的研究具有重要意义。检查 Neurod1 异位表达增强中风结果的可能性的研究需要纳入行为评估，因为中风后的功能结果是治疗干预成功的临床相关衡量标准 13,22,25,27。

目前没有可用于中风后亚急性和慢性中风致残患者的治疗方法，但康复除外，康复的益处有限。神经源性 bHLH 基因在神经胶质细胞中的强制表达已被证明可以改善中风后的功能结果22,30。这些发现与 AtN 重编程研究一致，表明与接受对照载体的小鼠相比，Neurod1 的异位表达在 AAV 递送后 3 周和 7 周增加了神经元转导。最重要的是，几篇文章概述了 AtN 重编程领域的研究控制、设计和解释的建议 17,18,19,22。为此，该方案描述了中风后转录因子异位表达的 AAV 系统和小鼠模型，可用于告知和推进对观察结果背后的细胞机制的进一步研究。

披露

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作者声明没有利益冲突。

致谢

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这项工作得到了心脏与中风基金会、安大略省再生医学研究所、加拿大第一研究卓越基金（Medicine by Design，MbD）和康诺特创新奖（多伦多大学）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#77 钻头 （.018"）David Kopf Instruments8177
AAV5-GFAP（0.7）-mNeurod1-2A-iCre载体 Biolabs
带针 Polysorb 的可吸收缝合线™聚酯CV-15 3/8圆锥点针尺寸4 - 0CovidienGL-881
抗NeuN抗体（兔） Millipore SigmaABN78 
C57BL/6 小鼠Charles River027
洗必泰溶液PartnarPCH-020
Contec™ 优先&贸易;RTU消毒剂溶液Fisher Scientific29-636-6212
恒温器Thermo Scientific HM525 NX 
内皮素1Millipore Sigma05-23-3800-0.5MG
羽毛安全剃须刀切片机刀片羽毛12-631P
Fisherbrand 盖玻片：矩形Fisher Scientific12-545M 
荧光封固剂Agilent TechnologiesS3023 
汉密尔顿注射器汉密尔顿公司7634-01
高速立体定位钻David Kopf Instruments1474
Metacam 溶液（美洛昔康）勃林格殷格翰
OCT 化合物Fisher Scientific23-730-571
pAAV2/5-GFAP-iCreVector BuilderP190924-1001suq
Polyderm 软膏 USPTARO2181908
SOMNI Scientific™ 动物温度加热垫Fisher Scientific04-777-177
立体定位仪器David Kopf Instruments902
型 Superfrost Plus 显微镜载玻片，白色Fisherbrand12-550-15
tdTomato 报告小鼠 Jackson 实验室007914
V-1 台式实验动物麻醉系统VetEquip901806
编织低温

参考文献

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Neurod1 GFAP 1

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