用于研究缺血性脑卒中亚急性期和慢性期转导细胞中 Neurod1 异位表达的 AAV 系统与小鼠模型

摘要

本方案描述了在皮层缺血性脑卒中后通过病毒介导的方式异位表达 Neurod1 的方法。Neurod1 的递送分为两种情况：（1）在脑卒中后亚急性期（7 天）利用 Cre-Flex AAV 系统在野生型小鼠中进行；（2）在脑卒中后慢性期（21 天）利用单个 AAV 载体在条件型报告小鼠中进行。

摘要

异位表达神经发生因子 体内 已成为在疾病模型中替代丢失神经元的一种有前景的策略。利用神经基本螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子 通过 非复制型病毒样颗粒系统，包括逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒（AAV），已有大量报道。对于 体内 实验, 腺相关病毒（AAVs）因其低致病性及潜在的可转化性而被日益广泛应用。本方案描述了两种AAV系统，用于研究缺血性脑卒中后转导细胞中转录因子的异位表达。在这两种系统中，Neurod1的表达由短片段GFAP（gfaABC(1)D）启动子驱动，该启动子在脑卒中后反应性星形胶质细胞中上调，当与神经发生因子共表达时，也可在内源性神经元中激活。在所述的缺血性脑卒中模型中，通过向小鼠运动皮层注射内皮素-1（ET-1）诱导局灶性缺血，形成一个周围环绕着表达GFAP的反应性星形胶质细胞和存活神经元的病灶。在脑卒中后的亚急性期（7天）和慢性期（21天）进行脑内注射AAV，以在病灶区域异位诱导Neurod1的表达。AAV注射后数周内，与接受对照AAV病毒的小鼠相比，异位表达Neurod1的小鼠在转导细胞中检测到显著更多的神经元。所采用的基于AAV的策略成功复制了在轻度至中度皮层脑卒中模型中，表达报告基因的神经元数量增加的现象。本方案建立了一个标准化平台，可用于探索通过AAV系统递送的转录因子异位表达的影响，有助于深入理解脑卒中背景下神经发生因子的表达机制。 关键词：实验, 腺相关病毒, 缺血性脑卒中, Neurod1, GFAP启动子, 内皮素-1, 转录因子, 异位表达, 神经发生, 反应性星形胶质细胞, 脑内注射, 报告基因

引言

脑卒中是全球范围内导致残疾的主要原因之一¹。当脑部血液供应中断时，就会发生脑卒中。这种情况可能由出血性脑卒中（约占病例的15%）引起，即脑内血管破裂；也可能由缺血性脑卒中引起，即脑部血流受阻¹。其中缺血性脑卒中最为常见，约占所有脑卒中病例的85%¹。脑卒中会减少葡萄糖和氧气向脑组织的输送，导致神经元迅速死亡以及神经功能受损。

缺血性脑卒中通过兴奋性毒性、氧化和亚硝基化应激、钙稳态失调、皮层扩散性去极化、水肿、血脑屏障（BBB）破坏以及炎症等机制，在数分钟内导致病灶核心区域的细胞死亡^2,3。梗死周围区域的细胞在卒中后数小时内开始发生凋亡性细胞死亡，并可持续数天⁴。梗死周围微环境暴露于促炎和抗炎信号之中，从而激活小胶质细胞和星形胶质细胞（"反应性"星形胶质细胞），这些细胞在损伤后发挥多种作用^5,6,7,8。....

方案

本方案已获得多伦多大学动物护理委员会的批准，并遵循 实验动物护理与使用指南 (2^nd 版本，加拿大动物护理委员会，2017）。本研究使用野生型（C57BL/6J）和转基因 tdTom-Cre 报告小鼠（B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm14(CAG-tdTomato)Hze}/J)²² 使用了小鼠品系。小鼠年龄为7-9周，包括雄性和雌性。所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 内皮素-1 脑卒中手术

注意：所有外科手术器械和材料均在手术前通过高压灭菌器进行灭菌。立体定位仪使用 PREempt 进行消毒。注射器在手术前用 PREempt 和 70% 酒精消毒，并用无菌 PBS 预冲洗。内皮素-1（ET-1）在整个手术过程中保持冰上保存。

1. 手术开始前，将清洁的笼盒置于设定为 37 °C 的加热垫上，以准备恢复区域。若使用加热灯，则仅将笼盒的一半置于热源下方。
   1. 使用异氟烷对小鼠进行麻醉时，应遵循动物护理委员会批准的方案。将小鼠放入麻醉诱导室，开启氧气，流速调至1-1.5 L/min，随后将异氟烷挥发罐调节至3%-5%，开始麻醉。
2. 当动物侧卧且....

结果

为了研究在野生型（C57BL/6J）和转基因 tdTom-Cre 报告小鼠品系（具体为 B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm14(CAG-tdTomato)Hze}/J）²² 中，由短片段 GFAP（gfaABC(1)D）启动子驱动的异位 Neurod1 表达对细胞的影响，在 ET-1 脑卒中损伤小鼠模型中使用了两种基于 AAV5 的系统（图 1A-C）。在脑卒中的亚急性模型中，将 Neurod1 包装于 Cre-Flex AAV 系统中，并于脑卒中后第 7 天注射至野生型小鼠体内（图 1B）。第二种 Flex 载体包含由 CAG 启动子驱动的反向 GFP 序列，该序列两侧为异型、反向排列的 loxP 类型重组位点（图 1B）。两种病毒载体在同一时间点（脑卒中后）同时注射。一旦在转导细.......

讨论

本方案详细介绍了两种腺相关病毒（AAV）系统及小鼠模型，用于在轻度至中度内皮素-1（ET-1）诱导的皮层卒中模型背景下研究Neurod1的异位表达。关于ET-1卒中模型的多个关键步骤对于损伤的可重复性和一致性至关重要，需予以充分考虑。钻颅骨孔时必须小心操作，避免刺破硬脑膜，以防造成意外的手术损伤。应使用一致的解剖标志（本研究中为前囟点）以确保目标区域（本研究为感觉运动皮层）的一致性。这一点对于采用行为学评估的研究尤为重要，因为病灶的位置和大小将直接影响功能结果^13,22,25,27。最为关键的是，ET-1的注射速率以及操作者在注射器上施加的压力必须保持一致，以获得可重复的结果。需要注意的是，注射器针头可能堵塞，因此在每只动物之间需进行清洁，以确保ET-1的准确递送。在进行组织细胞学分析时，若未观察到卒中病灶，则很可能在手术过程中针头 发生堵塞。如果问题持续.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#77 钻头（.018）”)	David Kopf Instruments	8177
AAV5-GFAP(0.7)-mNeurod1-2A-iCre	载体 Biolabs
可吸收缝合线（带针）Polysorb™ 聚酯线 CV-15 3/8 圆体锥形针 4-0号 编织线	Covidien	GL-881
抗NeuN抗体（兔）	Millipore Sigma	ABN78
C57BL/6 小鼠	查尔斯河实验室	027
氯己定溶液	Partnar	PCH-020
Contec™ PREempt™ 即用型消毒液	Fisher Scientific	29-636-6212
冷冻切片机	赛默飞世尔科技	HM525 NX
内皮素1	Millipore Sigma	05-23-3800-0.5MG
羽毛安全剃刀切片刀片	羽毛	12-631P
Fisherbrand 盖玻片：矩形	Fisher Scientific	12-545M
荧光封片剂	安捷伦科技	S3023
汉密尔顿注射器	Hamilton公司	7634-01
高速立体定位钻机	David Kopf Instruments	1474
美达佳溶液（美洛昔康）	勃林格殷格翰
O.C.T. 包埋剂	Fisher Scientific	23-730-571
pAAV2/5-GFAP-iCre	载体构建	P190924-1001suq
Polyderm 软膏 USP	TARO	2181908
SOMNI 科学™ 动物体温加热垫	Fisher Scientific	04-777-177
立体定位仪	David Kopf Instruments	Model 902
Superfrost Plus 显微镜载玻片，白色	Fisherbrand	12-550-15
tdTomato 报告基因小鼠	杰克逊实验室	007914
V-1 台式实验动物麻醉系统	VetEquip	901806