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方法文章

逆转录病毒CRISPR/Cas9介导的基因靶向技术用于体外研究Th17细胞分化

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DOI：

10.3791/66966

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2024年11月15日

 ,  ,  ,  , 
1Shanghai Immune Therapy Institute, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Zhejiang University-University of Edinburgh Institute (ZJU-UoE Institute), Zhejiang University School of Medicine, Zhejiang University, 3Institute of Immunology and Department of Rheumatology, Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍一种将引导RNA通过逆转录病毒转导至Cas9转基因小鼠原代T细胞的实验方案，为研究Th17细胞分化过程中的基因编辑提供了一种高效的替代方法。

摘要

产生IL-17A的辅助性T细胞，即Th17细胞，在免疫防御中发挥关键作用，并与自身免疫性疾病相关。CD4+ T细胞可通过抗原和明确定义的细胞因子混合物进行刺激。 体外 模拟 Th17 细胞分化 体内已对Th17分化调控机制开展了广泛的研究，使用了 体外 Th17 极化检测

传统的Th17极化方法通常需要从基因修饰小鼠中分离初始CD4 T细胞，以研究特定基因对Th17细胞分化和功能的影响。这些方法可能耗时较长、成本较高，并且可能受到基因敲除动物中细胞外在因素的干扰。因此，采用逆转录病毒转导向导RNA，在CRISPR/Cas9基因敲入的原代小鼠T细胞中实现基因敲除的技术，成为一种非常有用的替代方案。本文介绍了一种在逆转录病毒介导的基因靶向后，将初始原代T细胞分化为Th17细胞的实验方案，以及后续用于检测感染效率和分化效率的流式细胞术分析方法。

引言

Th17 细胞是 CD4+ 辅助性 T 细胞的一个独特亚群，在清除胞外细菌和真菌中发挥关键作用，并在多种自身免疫性疾病中具有重要作用1,2,3。新兴证据表明，Th17 细胞具有异质性，可在致病性和非致病性条件下发挥功能，其行为受到环境和遗传因素的影响。阐明调控 Th17 细胞分化、可塑性及异质性的分子机制，对于开发更有效的免疫治疗策略至关重要。

转基因动物已被广泛用于揭示 Th17 细胞分化与功能的关键调控因子。使用转基因动物涉及对基因组的完全操控 体内，以真实地系统研究其在生理条件或疾病模型中的作用。然而，采用这种方法进行高通量筛选在很大程度上是不切实际的。 体外 极化实验为研究Th17细胞分化提供了替代方法。已知白细胞介素6（IL-6）联合转化生长因子β1（TGFβ1）可促进非致病性Th17细胞的发育，而IL-6、IL-1β和IL-23则参与驱动致病性Th17细胞（pTh17）的分化。4,5.

CRISPR/Cas9 技术的出现使得在特定碱基位点进行精确的基因组编辑成为可能。当该技术与逆转录病毒转导相结合时，为筛选和功能研究 Th17 细胞中潜在的调控因子提供了一种强大、高效且经济的遗传学方法6,7。在本研究中，我们优化了 Th17 细胞极化体系中的逆转录病毒转导流程。利用逆转录病毒系统，我们感染了预先建立的、表达 Cas9 的小鼠初始活化 T 细胞。这些细胞被转导了由 U6 启动子驱动的向导 RNA（gRNA）构建体，同时携带在 EF1a 启动子控制下的荧光报告蛋白编码基因，以促进目标基因的敲除。随后，将转导后的 T 细胞在特定的细胞因子条件下培养，以诱导其分化为 Th17 细胞。值得注意的是，与对照组相比，敲除 RoRγt 显著降低了 IL-17A 的产生。该系统的有效性依赖于针对活化原代 T 细胞优化的逆转录病毒生产和转导条件，为研究 Th17 细胞分化与功能中的特定基因提供了一种快速且实用的方法。

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方案

​所有实验程序均经上海交通大学医学院仁济医院实验动物福利伦理委员会批准，并符合机构相关规定。

1. 慢病毒制备

  1.  逆转录病毒载体的制备
    1. 使用 CRISPick 工具（https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public）设计用于 RORγt 敲除的 sgRNA8。将参考基因组设置为Mouse GRCm38，并根据 CRISPRko 引导系统选择PAM 序列为NGG（适用于 SpyoCas9，Hsu (2013) tracrRNA）。验证目标基因名称或其他目标基因格式，并提交有效输入以获得 sgRNA 候选序列。将其他参数设为默认值，将 sgRNA 目标设为RORγt（Rorc，基因 ID：19885），以干扰 Th17 的分化，并从小鼠 GeCKO v2 文库中选择非靶向 sgRNA（简称 sgNT，序列：GCGAGGTATTCGGCTCCGCG）。
      注意：该工具提供多种可点击选项用于设计引导 RNA，便于根据特定需求进行定制。
      1. 在快速基因查找列下的搜索框中输入目标基因名称。系统将显示基因 ID 和目标基因的全名，以确保准确选择。
        注意：还可使用其他选项验证不同的目标基因格式。
    2. 根据较高的综合排名和选择顺序，选择一条靶向Rorc（简称 sgRorc）序列的 sgRNA，以避免脱靶匹配并提高靶向效率（sgRorc 序列：GTCATCTGGGATCCACTACG）。合成 sgRorc 和 sgNT 的两条寡核苷酸：对于正向寡核苷酸，在每条引导序列的 5' 端添加序列“gttttagagctagaaatagcaagttaaaat”；对于反向寡核苷酸，在每条引导序列的 3' 端添加序列“tttcgtcctttccacaagatatataaagc”。
      注意：通常存在多个 sgRNA 序列选项。为评估敲除效率，必须选择 2 或 3 条靶向相同基因型的 sgRNA 序列。在我们的初步实验中，选择了两条靶向Rorc的 gRNA 进行比较（sgRNA 序列1：GTCATCTGGGATCCACTACG；sgRNA 序列2：CTTGAGTATAGTCCAGAACG）。实验结果表明，当前方法中使用的 gRNA（sgRNA 序列1）在两者中表现出更高的敲除效率。
    3. 使用 DNA 聚合酶通过 PCR 扩增 sgRorc 和 sgNT 编码序列，并将其分别克隆至 pMX-U6-MCS 载体中（位于 U6 启动子与 gRNA 支架之间），并与 mCherry 荧光蛋白保持阅读框一致9。按照表 1设置反应体系（50 µL）。这些引物包含 sgRNA 序列（3'端），可将 sgRNA 插入载体，以及一段载体序列（5'端），用于扩增全长载体片段。此外，在 sgRNA 区域内设计正向和反向引物时，使其重叠约 18 bp（但不完全重叠），以促进连接过程中线性化克隆载体的组装。
      注意：应通过 PCR 获得在 sgRNA 序列位点处被引物线性化的载体片段，大小约为 5,551 kd。
    4. 使用凝胶提取试剂盒纯化构建体，并使用克隆试剂盒进行环化。将重组产物用于转化实验。
    5. 从平板上挑取单克隆，并使用 U6 启动子引物（序列：ATGGACTATCATATGCTTACCGTA）通过第一代测序验证 sgRorc 或 sgNT 编码序列。
    6. 选择理想的单克隆在 LB 肉汤中扩增。使用无内毒素质粒试剂盒从细菌细胞中提取高质量质粒 DNA。
      注意：确保质粒溶液质量高。我们建议质粒溶液浓度至少为 1 µg/µL。
  2. 包装细胞的制备
    1. 按以下步骤制备 Platinum-E（Plat-E）细胞：在 10 cm 培养皿中，使用含 10% 胎牛血清（FBS）、100 单位/mL 青霉素和 0.1 mg/mL 链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM 培养基）培养 Plat-E 细胞。后续将此称为细胞培养基。
      注意：为获得适当的转染效率，建议使用对数生长期且传代次数少于 15 次的细胞。
    2. 转染前一天，将一整板 10 cm 的 Plat-E 细胞（约 2.6 × 107 个细胞）按适当比例分种至新的 10 cm 培养皿中，使次日细胞融合度约为 80%，这是转染的最佳条件。转染前一天以 1:3 的比例进行细胞传代（在新的 10 cm 培养皿中接种约 8 × 106 个细胞）。
      注意：分种比例取决于细胞生长状况，生长旺盛的细胞可实现更高的转染效率。我们通常以 1:3 的比例进行 10 cm 培养皿的传代。对于不同规格的细胞培养皿，例如 6 cm 培养皿，建议转染前一天接种 1.5 × 106 个 Plat-E 细胞。
  3. 转染
    1. 转染前 1 小时，将细胞培养基替换为 8 mL 无酚红、含 5% FBS 的低血清培养基，但不含青霉素-链霉素，因其可能干扰转染试剂。使用前将低血清培养基预热至 37 °C 。
    2. 准备包含混合物 1 和混合物 2 的转染混合液：混合物 1 包含 18 µg 质粒 DNA（pMXs-U6-MCS-sgNT-mCherry/pMXs-U6-MCS-sgRorc-mCherry）和 6 µg pCL-嗜同性逆转录病毒载体（pCL-Eco），溶于 1,000 µL 低血清培养基中；混合物 2 包含 48 µL 转染试剂，溶于 1,000 µL 低血清培养基中。将混合物 2 逐滴加入混合物 1 中，轻轻且充分混匀。在 20–25 °C 下孵育复合物 15–20 分钟。
    3. 将混合液小心滴加至 Plat-E 细胞中，轻轻摇晃培养皿以确保均匀分布。在 37 °C 、5% CO2 条件下孵育 6–12 小时。
    4. 更换为 10 mL 新鲜细胞培养基，继续在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 48 小时。
    5. 通过荧光显微镜或流式细胞术检测逆转录病毒载体标签（作为替代指标）来评估 Plat-E 细胞中的转染效率。
      注意：在转染 pMX-U6-MCS 载体的 Plat-E 细胞中，相当比例的细胞显示出强烈的 mCherry 荧光信号（荧光阳性率超过 80%），表明转染成功。
    6. 收集含病毒的培养上清液，以 1,500 × g 离心 10 分钟以去除细胞碎片。将病毒上清液按每管 1 mL 分装，于 -80 °C 保存。
      注意：过滤是去除细胞碎片的替代方法。我们建议使用孔径为 0.45 µm、聚醚砜（PES）膜的注射器滤器，以最大限度减少病毒颗粒在滤膜上的滞留。

2. 活化CD4+ T细胞的逆转录病毒感染及Th17细胞分化

  1. 制备并激活初始型原代 CD4+ T细胞
    1. 用2 mL的溶液包被24孔细胞培养板的每个孔 µ微克/毫升抗-CD3ε 和 4 µ微克/毫升抗CD28于无菌500 µL PBS，用封口膜包裹培养板以防止蒸发和污染，随后在4℃孵育培养板 °C 过夜（或 37 °C 在铺板CD4细胞前孵育1-2小时+ T细胞）在分离初始CD4+ T细胞
      注意：在进行病毒转导之前，需要对小鼠 T 细胞进行平板包被刺激。
    2. 第二天，通过 CO2 窒息处死并用70%乙醇消毒。
    3. 收获小鼠脾脏并置于含 2% FBS 和 100 µM EDTA（FACS 缓冲液）
    4. 用无菌磨砂玻璃（磨砂面）在FACS缓冲液中研磨脾脏，将组织匀浆成单细胞悬液，并通过70 μm细胞滤网过滤细胞悬液 µm细胞滤器放入50 mL离心管中。
      注意：务必轻柔且持续地研磨组织，以保持组织湿润。剧烈研磨会显著影响细胞存活率。
    5. 将脾细胞悬液在800 × g离心 × g 5分钟。移除上清液，将细胞沉淀重悬于2 mL红细胞裂解液中。室温静置5分钟，然后加入FACS缓冲液至总体积为15 mL。以800 × g离心脾细胞 × g 5 分钟
    6. 重悬脾细胞，并通过40 μm细胞筛过滤 µm 细胞滤筛。将 CD4 细胞终体积调整至 1 mL+ T细胞分离。
    7. 分离 CD4+ 使用商业试剂盒并按照说明书中的指示处理 T 细胞。
    8. 标记 CD4+ 在4℃下用荧光标记抗体混合物（CD4、CD25、CD44和CD62L）孵育T细胞 °C 下孵育 30 分钟，用 FACS 缓冲液洗涤细胞，并分离初始 CD4+ 使用流式细胞分选仪分选T细胞。这将获得CD4+CD25-CD62L高CD44低 初始T细胞
    9. 从24孔细胞培养板（按步骤2.1.1制备）中移除包被刺激的上清液，并用500 μL PBS每孔洗涤两次 µL PBS。接种 1 x 106 初始 CD4+ 将1 mL淋巴细胞培养基中的T细胞加入24孔细胞培养板的一个孔中。将细胞置于细胞培养箱中孵育。
      注意：淋巴细胞培养基含有 10% FBS、100 单位/毫升青霉素、0.1 毫克/毫升链霉素、1 毫摩尔/升丙酮酸钠、10 毫摩尔/升 HEPES 和 50 µM β-ME 在 RPMI 1640 培养基中。
  2. 逆转录病毒感染
    1. 18–24 小时后，将每孔活化的细胞收集至 1.5 mL 离心管中，在 800 × g 条件下离心 × g 5 分钟后，弃去上清液。
    2. 将细胞沉淀重悬于1 mL感染混合液中（10 µ每毫升含六甲溴铵、10 mM HEPES的病毒上清液混合物，并向48孔细胞培养板的新孔中加入1 mL该混合物。同时，保留足够数量的细胞作为阴性（未转导）对照。
      注意：少于 1 x 106 活化的初始CD4+ 每孔 T 细胞数，但不建议使用少于 0.5 x 106 每孔细胞数。此外，48孔培养板的周边孔中不应接种任何细胞。
    3. 用封口膜封板，800 x g 离心 g 32℃孵育90分钟 °C. 将加速和减速均设为3。离心后去除封口膜，将细胞放入培养箱中孵育4小时，然后进行分化步骤。
  3. 感染细胞向 Th17 细胞的分化
    1. 在逆转录病毒感染期间准备抗原呈递细胞（APC）。首先，按照步骤 2.1.2 至 2.1.4 的说明从野生型小鼠获取脾细胞。用含有 50 的淋巴细胞培养基 1 mL 重悬脾细胞 µg/mL 丝裂霉素置于15 mL离心管中。将脾细胞在37℃孵育 °C 5% CO₂ 条件下2 1小时。
    2. 一小时后，加入 PBS 至 15 mL 刻度以洗涤脾细胞，在 800 × g 离心5分钟，弃去上清液，用1 mL淋巴细胞培养基重悬脾细胞，并计数细胞数量。抗原呈递细胞已成功制备。
    3. 在细胞孵育4小时后（如步骤2.2.3所述），收集转导的CD4+ 1.5 mL 管中的 T 细胞在 800 × g 离心 g 5 分钟。弃去上清液，将感染的细胞重悬于 600 µL PBS 洗涤。800 x g 5 分钟后离心，弃去上清液。
    4. 加入0.5 × 106 转导的 CD4+ 1 mL 淋巴细胞培养基中的 T 细胞，含 1.5 x 106 24 孔细胞培养板中的一孔含有抗原呈递细胞。补充 2 µg/mL 抗 CD3e，2 µ微克/毫升抗-CD28，以及含10的Th17细胞分化 cocktail µg/mL 抗-IFNγ, 10 µ微克/毫升 抗-IL-12/IL-23 p40，10 µg/mL 抗IL-4，2.5-3 ng/mL hTGF-ββ，以及20-30 ng/mL IL-6。培养细胞2天。
    5. 将每孔细胞收集至1.5 mL离心管中，以800 x g 5 分钟，弃去上清液。仅加入 1 mL 新鲜淋巴细胞培养基，其中含 3 ng/mL TGF-β 以及30 ng/mL IL-6。将细胞置于24孔细胞培养板的新孔中继续培养。换液后2天分析细胞。

3. 转导效率与分化结果的评估

  1. 更换培养基两天后，收集细胞，以 800 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。将已分化的细胞用含 50 ng/mL 佛波酯-12-十四烷酰-13-乙酸盐（PMA）、500 ng/mL 离子霉素和 5 µg/mL 布雷菲德菌素 A 的 500 µL 淋巴细胞培养基重悬，转移至 24 孔细胞培养板的新孔中，在 37 °C 培养箱中孵育 4 小时。收获一半细胞用于流式细胞术分析，另一半细胞用 RNA 提取缓冲液裂解，用于 qPCR 分析。
  2. 用于流式细胞术分析
    1. 将细胞收集至 1.5 mL 离心管中。每管加入 1 mL FACS 缓冲液，以 800 × g 离心 5 分钟，洗涤细胞。
    2. 用荧光标记抗体混合液（CD4 和可固定活力染料，溶于 100 µL PBS 中）重悬细胞沉淀，在 4 °C 避光孵育 30 分钟进行染色。
    3. 用 300 µL PBS 洗涤细胞，再用 300 µL 2% 磷酸盐缓冲甲醛（FA）在 4 °C 固定至少 60 分钟。
    4. 一小时后，用 PBS 洗涤细胞，加入 600 µL 1× 穿透缓冲液重悬细胞，以 800 × g 离心 5 分钟。
    5. 弃去上清液，加入抗 IL-17A 抗体，溶于 100 µL 1× 穿透缓冲液中，在室温孵育 60 分钟，或在 4 °C 过夜。
    6. 次日，用 1× 穿透缓冲液洗涤细胞，再用 200 µL PBS 重悬。通过流式细胞术进行分析10。参见代表性结果部分。
  3. 用于 qPCR 分析，按照 RNA 提取试剂盒说明书提取 RNA。将 RNA 反转录为 cDNA，用于储存或后续 qPCR 分析。引物设计应遵循通用的 qPCR 引物设计原则，同时应特异性靶向预期插入缺失（indel）位点区域，即 gRNA 介导切割发生的区域。在此位点若扩增效率降低或信号丢失，可作为基因敲除成功的指标。qPCR 引物序列如下：
    Rorc F: TCCACTACGGGGTTATCACCT; R: AGTAGGCCACATTACACTGCT。
    IL17a F: TCAGCGTGTCCAAACACTGAG; R: CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT。

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结果

在本研究中，我们将靶向Rorc的sgRNA及非靶向sgRNA的编码序列克隆至含有mCherry荧光蛋白的pMX-U6-MCS载体中（图1A、B）。逆转录病毒的制备按照图2中所述方案进行。转染于第0天开始，第2天收集逆转录病毒。可通过mCherry荧光强度检测转染效率（图1C）。在收集病毒前，对初始型CD4+ T细胞进行分选并激活。随后，使用离心感染法感染这些活化的CD4+ T细胞，并继续进行如上所述的分化步骤。最后，通过流式细胞术分析和qPCR分析评估转导效率及分化结果。

图3 展示了用于分选初始型 CD4+

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讨论

通过逆转录病毒递送进行CRISPR/Cas9基因组编辑是研究辅助性T细胞功能的可靠方法。本方案提供了一种快速且有效的途径，用于研究参与Th17细胞分化与功能的特定基因。为获得最佳实验结果，必须严格遵循若干关键步骤。首先，为提高基因敲除效率，应谨慎选择gRNA。鉴于CRISPR/Cas9基因编辑存在脱靶效应的风险，建议根据方案第1.1.1节中确定的评分，选取2-3个高分gRNA用于后续实验11,12。其次，高病毒滴度对于成功感染至关重要。Plat-E包装细胞系的适当维护尤为关键。转染当天，细胞汇合度应达到约80%，细胞数量过少或过多均会影响病毒滴度。若无法获得Plat-E细胞，也可将人胚胎肾293T细胞与pCL-Eco载体共转染，以获得高病毒滴度13,14。保持质粒浓度不低于1 µg/µL，对获得高病毒滴度具有重要意义。必须在病毒悬液变为柠檬黄色之前及时收集，因为病毒对pH变化敏感，因此应将培养基的pH严格...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

感谢上海免疫治疗研究所核心设施的Dou Liu、Dongliang Xu和Pinpin Hou在仪器使用方面提供的支持。本工作得到国家自然科学基金项目31930038、U21A20199、32100718和32350007（资助林荣禄）；32100718（资助金雪潇）；上海市高水平地方高校创新团队项目SHSMU-ZLCX 20211600（资助林荣禄）；瑞金医院内部孵化计划RJTJ24-QN-076（资助崔泽金）的资助。 图2 使用Figdraw软件绘制。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5 M EDTA (pH 8.0)SolarbioE1170
100 mm 细胞和组织培养皿BIOFILTCD010100
1 M Hepes（游离酸，无菌）SolarbioH1090
24 孔细胞和组织培养板NEST702002
48 孔细胞和组织培养板NEST748002
Brefeldin A 溶液（1,000 倍浓缩）BioLegend420601
Brilliant Violet 650 抗小鼠 CD4 抗体（RM4-5）BioLegend100546
CD3e 单克隆抗体（145-2C11），功能级，eBioscienceInvitrogen16-0031-82
CD44 单克隆抗体（IM7），PE 标记，eBioscienceInvitrogen12-0441-83
CD62L（L-选择素）单克隆抗体（MEL-14），APC 标记，eBioscienceInvitrogen17-0621-82 
细胞计数仪Nexcelom BioscienceCellometer Auto 2000
细胞筛（40 μm）biosharpBS-40-CS
细胞筛（70 μm）biosharpBS-70-CS
离心机 eppendorf5425 R
离心机 eppendorf5810 R
ChamQ SYBR Color qPCR Master MixVazymeQ411-02
ClonExpress II 一步克隆试剂盒VazymeC112
DH5α 感受态细胞Sangon BiotechB528413
Direct-zol RNA MiniprepZYMO RESEARCHR2050
DMEM 培养基BasalMediaL110KJ
EasySep 小鼠 CD4+ T 细胞分离试剂盒STEMCELL19852
eBioscience 可固定活力染料 eFluor 660Invitrogen65-0864-18
EndoFree 质粒小提中量试剂盒 IITIANGENDP118-02
ExFect 转染试剂VazymeT101-01
胎牛血清，优等品GibcoA5669701
荧光素标记抗小鼠 IL-17A 抗体（TC11-18H10.1）BioLegend506907
甲醛溶液MacklinF864792
HiScript IV 逆转录超级混合液用于 qPCR（含 gDNA 去除剂）VazymeR423-01
离子霉素BeyotimeS1672
丝裂霉素 CMaokang Biotechnology7/7/1950
小鼠 GRCm38NCBIRefSeq v.108.20200622
OPTI-MEM 减血清培养基Gibco31985070减血清培养基
Pacific Blue 抗小鼠 CD4 抗体（RM4-5）BioLegend100531
PE/Cyanine7 抗小鼠 CD25 抗体（PC61）BioLegend102015
PE/Cyanine7 抗小鼠 CD4 抗体（GK1.5）BioLegend100422
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Gibco15140122
PMA/TPA BeyotimeS1819
R26-CAG-Cas9 小鼠 上海模式生物研究中心货号 NM-KI-00120
重组人 TGF-beta 1（CHO 表达）蛋白，CF 级R&D Systems11409-BH
重组小鼠 IL-6PeproTech216-16
科研用细胞分析仪BD BiosciencesBD LSRFortessa
科研用细胞分选仪SONYMA900
RPMI 1640 培养基BasalMediaL210KJ
SimpliAmp 热循环 PCR 系统Applied BiosystemsA24811
丙酮酸钠溶液（100 mM）Sigma-AldrichS8636
Ultra-LEAF 纯化抗小鼠 CD28 抗体（37.51）BioLegend102121
Ultra-LEAF 纯化抗小鼠 IFN-γ 抗体（XMG1.2）BioLegend505847
Ultra-LEAF 纯化抗小鼠 IL-4 抗体（11B11）BioLegend504135
Ultra-LEAF 纯化抗小鼠 IL-12/IL-23 p40 抗体（C17.8）BioLegend505309
β-巯基乙醇（50 mM）SolarbioM8211

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