基于多孔基底的电穿孔结合跨上皮电阻监测

摘要

多孔基质电穿孔（PSEP）可实现稳定、高通量的递送，并保持高细胞存活率。跨上皮电阻（TEEI）测量的引入为PSEP的中间过程提供了深入见解，并实现了无标记递送。本文介绍了一种同时进行PSEP递送实验与TEEI测量分析的方法。

摘要

多孔基底电穿孔（PSEP）是一种新兴的电穿孔方法，可实现高通量且稳定的递送效果。与其他多种细胞内递送技术类似，PSEP 高度依赖荧光标记物和荧光显微镜来判断递送是否成功。为了深入了解电穿孔过程中的中间步骤，研究人员开发了一种集成了跨上皮电阻（TEEI）监测功能的 PSEP 平台。细胞在市售的带有多孔膜的插入式培养小室中进行培养。经过 12 小时的孵育，形成完全融合的单层细胞后，将这些插入式小室置于 PSEP 装置孔中的转染培养基内。随后对细胞单层施加用户自定义的电脉冲波形，并通过荧光显微镜确认递送效率。在电脉冲处理与荧光显微镜观察之间加入 TEEI 测量，可显著增强该工作流程，从而获取有关 PSEP 过程的额外数据；这些额外的 TEEI 数据与递送效率和细胞活力等递送指标密切相关。本文介绍了一种结合 TEEI 测量进行 PSEP 操作的实验方案。

引言

电穿孔是一种将细胞暴露于电场中的技术，可在细胞膜上形成临时孔隙，使包括蛋白质、RNA和DNA在内的分子能够通过这些孔隙进入细胞^1,2。目前应用最广泛的是批量电穿孔（BEP）。BEP通过将含有数百万个细胞的电解质溶液注入电转杯中，施加高电压，使分子通过扩散或内吞作用进入细胞¹。BEP具有高通量以及多种商业化系统可选等优势。然而，BEP在递送过程中也存在局限性。由于细胞相对于电极的位置不一致，以及相邻细胞对电场的屏蔽效应，导致BEP过程中细胞所受电场强度存在显著差异^3,4。此外，BEP所需的高电压对细胞活力有明显的负面影响⁵。自2011年首次提出以来⁶，一种称为多孔基底电穿孔（PSEP）的技术受到越来越多关注，尽管该技术有时也被称为局域电穿孔或纳米/微米电穿孔^1,7,8。与BEP所用的悬浮细胞不同，PSEP是在贴壁于多孔基底上的细胞上进行的。不仅大多数人类细胞系更倾向于贴壁生长....

方案

本研究中所用试剂与设备的详细信息见材料表。

1. 试剂准备与细胞培养

1. 在500 mL的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中加入50 mL胎牛血清（FBS）和5 mL青霉素-链霉素，配制细胞培养基。分装成十一份各50 mL的等分试样，以降低污染风险，并于4 °C下冷藏保存。
2. 根据制造商说明书，用磷酸盐缓冲液（PBS）配制1 mL浓度为25 µg/mL的人血浆纤连蛋白储备液。
3. 用DMEM配制15 mL浓度为0.1 mg/mL的碘化丙啶储备液，以便进行不同载荷浓度的实验。
4. 将A431细胞培养于含有12 mL上述制备的细胞培养基的T75培养瓶中。每1–2天传代一次，以维持50%的汇合度。

2. 样品制备

1. 纤连蛋白包被
   1. 选取十二个插入式培养小室和两个24孔板。将插入式培养小室放入一个24孔板中，排列成两行，每行六个。将第二个24孔板暂置一旁，待后续使用。
   2. 在1.5 mL离心管中，将52 µL纤连蛋白储备液与1,248 µL PBS混合，配制1,300 µL浓度为1 µg/mL的纤连蛋白溶液。
   3. 向每个插入式培养小室中加入100 µL纤连蛋白溶液。将....

结果

本方案建立了一种利用 TEEI 测量来研究电穿孔中间过程并预测递送效率的方法，特别针对 A431 细胞系和 PI 货物。尽管本文后续讨论了对该方案的修改，但需注意的是，尽管具体数值可能发生变化，响应的整体趋势保持一致。例如，TEEI 数据低于初始基线表明细胞死亡，而 TEEI 值相对于最小值的最大增幅则对应递送效率¹³。下文将探讨这些总体趋势及其意义。

如图2A所示，在使用PSEP平台时可能出现多种TEEI测量结果和细胞成像趋势。本实验方案的理想结果是获得一条类似于图2Ai中所示优化健康数据的曲线。该曲线被定义为理想结果，因其未出现低于基线的下降，表明细胞死亡极少甚至没有。此外，优化后的健康曲线从最低值起TEEI上升幅度最大，表明递送效率较高¹³。这些推断得到了PSEP处理后细胞单层成像结果的支持，图像显示细胞死亡可忽略不计，细胞单层健康且完全汇合（

讨论

图2C 显示了每个PSEP波形电压对应的TEEI增加量和相对于基线的减少量。TEEI的增加量呈抛物线形变化，在约20伏时达到峰值后下降，而TEEI相对于基线的减少量则随电压升高呈指数增长。图2D 中的递送效率和死亡率百分比反映了类似趋势：递送效率呈抛物线形变化，在约30伏时达到峰值，而死亡率则随波形电压的升高呈指数增加。

导致TEEI升高的潜在机制之一，是由于在带负电荷的基底微通道中发生电渗作用，这一现象由外加电场引起^18,19。TEEI响应究竟是源于电渗流体流动引起的细胞肿胀所产生的机械刺激——这一因素已知在电穿孔过程中会发生²⁰，还是源于波形本身的电刺激，目前尚不明确。但可以确定的是，细胞单层的健康状态和完整性对于在细胞膜上实现电穿孔所需的适当电压降至关重要。因此，本方法中最关键的步骤是细胞接种以.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 圆锥形离心管	Thermo Scientific	339651
双芯片一次性血细胞计数板	Bulldog Bio	DHC-N01
75 cm2 组织培养瓶	fisherbrand	FB012937
A431 细胞	ATCC	CRL-1555
Calcein AM	Invitrogen	C3099
II 级 A2 型生物安全柜	Labgard	NU-543-600
定制组件	YangLab		https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI
一次性离心管（50 mL）	fisherbrand	05-539-6
DMEM	Gibco	11965092
胎牛血清	Gibco	A5670401
液体抽吸系统	vacuubrand	20727403
HERACELL 240i	Thermo Scientific	51026331
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
人血浆纤维连接蛋白	Sigma-Aldrich	FIBRP-RO
倒置荧光显微镜	Zeiss	491916-0001-000
倒置显微镜	Labomed	TCM 400
PBS	cytiva	SH30256.02
PCR 管 200 µL	Sarstedt	72.737
青霉素/链霉素	Gibco	15140148
移液器（0.2–2 µL）	fisherbrand Elite	FBE00002
移液器（100–1000 µL）	fisherbrand Elite	FBE01000
移液器（20–200 µL）	fisherbrand Elite	FBE00200
移液器（2–20 µL）	fisherbrand Elite	FBE00020
碘化丙啶	Invitrogen	P1304MP
反应管 1.5 mL	Sarstedt	72.690.300
Sorvall ST 16R 离心机	Thermo Scientific	75004240
Thincert（24 孔）	Greiner Bio-One	662 641	0.4 µm 孔径，2×106 cm-2 孔密度，透明 PET 材质
组织培养板（24 孔）	fisherbrand	FB012929
台盼蓝溶液	Sigma-Aldrich	T8154-20mL
胰蛋白酶	Gibco	15090046