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优化的小鼠肠道卷（Swiss Rolls）制备及石蜡包埋组织免疫荧光染色方案

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DOI：

10.3791/66977

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2024年7月19日

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1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

肠道对消化和吸收至关重要。由于各区域具有独特的细胞结构，十二指肠、空肠、回肠和结肠分别承担不同的功能。研究肠道生理学需要对组织进行细致的分析。本方案概述了使用瑞士卷技术进行组织固定和处理的步骤，通过适当的组织保存和定向，确保免疫染色结果的准确性。

摘要

肠道是一个复杂的器官，由小肠和大肠组成。小肠可进一步分为十二指肠、空肠和回肠。肠道的每个解剖区域都具有独特的功能，这体现在细胞结构的差异上。研究肠道的变化需要对不同组织区域及细胞改变进行深入分析。为了研究肠道并可视化大块组织，研究人员通常采用一种称为肠道瑞士卷（intestinal Swiss rolls）的技术。该技术将肠道按各解剖区域分开，并以平坦的方向固定，随后小心地将组织卷起，并进行石蜡包埋处理。适当的组织固定与正确的方向定位虽常被忽视，但对后续分析至关重要。此外，肠道组织若瑞士卷操作不当，可能损伤脆弱的肠上皮，导致免疫染色所用组织质量下降。确保组织固定良好、方向正确且细胞结构完整，是实现肠道细胞最佳可视化的关键步骤。本文介绍了一种经济、简便的瑞士卷制备方法，可将肠道所有节段包含于单个石蜡包埋块中。同时，我们还描述了优化的肠道组织免疫荧光染色方法，用于研究肠上皮的多个方面。以下实验方案为研究人员提供了完整的操作指南，涵盖肠道组织固定、瑞士卷技术及免疫染色，以获得高质量的免疫荧光图像。采用这些优化方法可有效保持肠上皮复杂的形态结构，促进对肠道生理学及病理生物学的深入理解。

引言

在对肠道组织进行免疫染色保存时，肠道的细胞结构对其结构完整性的维持构成了独特挑战。小肠由称为绒毛的细长指状结构组成1。这些绒毛在包埋过程中常常发生形态改变。确保研究人员掌握正确包埋肠道的技术，以获得能够显示肠道所有区域及其各层结构（即固有肌层、黏膜层和浆膜层）的横切面，对于可靠的实验分析至关重要2。固定不足、过度固定以及不恰当的组织处理会破坏组织完整性，导致肠上皮意外受损3,4。在这些步骤中损伤肠上皮会显著降低后续分析（如免疫荧光）的质量，无论所采用的免疫组织化学方案和抗体效果如何。

免疫染色与适当的组织固定一样，是生物医学研究中的重要环节。操作得当的免疫染色能够揭示细胞结构与功能中此前未知的方面。由于固定和石蜡包埋过程引起的理化改变，石蜡切片的免疫荧光染色可能具有挑战性5。固定和石蜡包埋会导致抗原遮蔽，从而干扰目标表位的免疫荧光检测6。固定延迟可能引发蛋白水解降解，导致关键表位的染色减弱或缺失7。此外，抗体常存在特异性不足和背景信号过高的问题。能够促进抗体结合一致性与特异性、并实现高信噪比的免疫染色方案，可为研究人员提供有价值的信息。

本文提供了一套完整的实验方案，旨在通过肠道组织固定、瑞士卷制备8及免疫染色，获得高质量的免疫荧光图像。本方案强调保护肠道结构完整性的操作要点，旨在为研究人员提供一种可靠的方法，以提高免疫荧光成像研究的质量与可重复性。我们还力求采用经济实惠的资源，包括滤纸以及自制的抗原修复液、封闭液和抗体稀释液，使该方案更易于被经费有限的实验室所采用。与所有实验方案一样，研究人员应根据自身的实验方法和研究方向对本方案进行优化。

方案

南卡罗来纳医科大学的机构动物护理和使用委员会批准了所有动物护理、维持和处理方案。本研究使用的肠道组织取自成年C57BL/6J小鼠（雄性和雌性，3-5月龄，体重约30 g）。

1. 肠道组织固定

  1. 将已实施安乐死的小鼠整个肠道小心解剖取出，并置于含有磷酸盐缓冲液（PBS）的称量皿或培养皿中。
  2. 将肠道从 PBS 中取出，用剪刀轻轻去除多余的脂肪和结缔组织。剪除结缔组织有助于组织在后续步骤中平铺。
  3. 使用剪刀将肠道分为各个独立节段（即十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠）。根据解剖特征和/或长度进行分段，肠道总长度中约13%为十二指肠，58%为空肠，8%为回肠，6%为盲肠，结肠占15%9。十二指肠紧接胃部，回肠是小肠末端、位于盲肠前的节段。
  4. 用剪刀剪开结肠与盲肠连接处以分离结肠。将十二指肠、空肠、回肠和结肠放入盛有 PBS 的称量皿或培养皿中。弃去盲肠，或根据其他已发表的方法进行固定10。
  5. 用刀片切去 P200 移液器吸头的大端，将其连接至 10 mL 注射器上。用 PBS 填充注射器。
  6. 用镊子将注射器吸头插入肠段开口处。用镊子将肠段固定在注射器上，以约 50 µL/s 的速度轻柔冲洗，以去除肠内容物。将冲洗出的肠内容物收集至空的称量皿或培养皿中。
  7. 将湿润的肠段平直地放置在一条预先标记的纤维素滤纸条上（见 材料表）。确保肠段足够湿润，以便牢固粘附于干燥滤纸上。用铅笔在滤纸上标注小鼠编号、基因型、实验组等信息。
    注意：使用钢笔标记滤纸可能导致在固定过程中标签丢失。
  8. 使用解剖剪刀沿肠系膜缘纵向剪开肠管。每次剪开约 5 mm，同时用剪刀底缘或一对镊子将剪开的组织平铺于滤纸上。持续操作，直至整段肠道完全剪开并平铺于滤纸上。注意尽可能沿直线剪开肠道，以便后续卷绕组织。
    注意：此步骤可使用圆头剪刀，以避免组织损伤。
  9. 在肠段上方再覆盖一张滤纸。确保滤纸将肠段夹在中间，防止组织在固定过程中卷曲或失去平整形态。
  10. 用订书钉将滤纸边缘固定，以确保组织位置稳定。切勿将订书钉钉在组织上。在组织周围钉足够数量的订书钉，防止组织在固定过程中从滤纸上脱落。
  11. 对每个肠段（十二指肠、空肠、回肠和结肠）重复步骤 1.5–1.10。
  12. 将组织浸入 10% 中性缓冲福尔马林（或选择其他固定液，如 4% 多聚甲醛、Carnoy 固定液等）中，在 4 °C 下过夜固定。
    注意：固定液（如福尔马林）具有毒性，操作时务必穿戴适当的个人防护装备。

2. 肠道组织卷制与处理

警告：步骤 2.1-2.6 需在通风橱中进行。

  1. 轻轻取下顶层的滤纸（即接触肠腔面的那张滤纸）。用镊子小心地将肠组织从底部滤纸上剥离下来，弃去滤纸。
  2. 准备三个称量皿，均装入 PBS。用 PBS 清洗组织 3 次，以去除组织中的福尔马林。
  3. 使用反向镊子（见材料表），用镊子夹住肠段短边，使肠腔面朝上。转动镊子以卷起组织，同时使用另一把普通镊子辅助引导卷绕过程。若组织发生折叠，应将其展开并重新卷绕。
  4. 将卷好的组织置于干燥的称量皿或培养皿中。用一只手的镊子固定组织位置，另一只手小心打开反向镊子释放组织，并用另一把镊子将组织从反向镊子上轻轻取下。
  5. 将一枚 00 号解剖针或微量固定针插入组织中（见材料表）。使用金属剪线钳剪去针的尖锐部分。将组织放入一个大号包埋盒中，然后将包埋盒置于盛有 70% 乙醇的容器中，待后续处理。
  6. 对所有肠段（十二指肠、空肠、回肠和结肠）重复步骤 2.1–2.5，将四个组织卷均放入同一个大号包埋盒中（见材料表）。确保使用铅笔标记包埋盒，以防止标签在乙醇和二甲苯（见材料表）溶液中脱落。
  7. 所有样本完成卷绕后，将其放入组织处理机中。肠道组织处理程序如下：70% 乙醇 35 分钟；90% 乙醇 35 分钟；95% 乙醇 35 分钟；100% 乙醇 35 分钟，3 次；二甲苯 35 分钟，3 次；石蜡 60 分钟，3 次。包埋盒可在熔化的石蜡中长时间停留。
    注意：二甲苯为有毒化学品，操作时务必穿戴适当的个人防护装备。

3. 肠道组织包埋

  1. 预热大型包埋模具，以保持石蜡处于熔融状态。
  2. 从组织处理机中取出包埋盒，并将其放入盛有熔融石蜡的烧杯中。
  3. 在包埋台上，向模具中加入少量石蜡。将四个瑞士卷从包埋盒中取出，全部放入同一模具中，尽量使其平铺。再加入更多石蜡以填满模具。
  4. 将模具移至冷台，确保所有瑞士卷均平整地贴合于模具底部。将已标记的小型包埋盒盖（见材料表）置于模具上，必要时补充更多石蜡。
  5. 待石蜡完全凝固后，将蜡块从模具中取出。此时组织已准备好切成5 µm厚的切片，并漂浮至带电荷的玻片上，用于免疫染色11。

4. 组织粘附与玻片制备

  1. 为确保制备好的5 µm石蜡组织切片牢固粘附于载玻片上，将载玻片置于60 °C的玻片加热器或加热板上加热15–30分钟。也可延长加热时间；此步骤对时间不敏感。
  2. 让载玻片冷却至室温（约15分钟）。

5. 脱蜡

  1. 开始脱蜡载玻片时，应确保组织始终浸没在溶液中，在整个免疫染色过程中避免干燥。
  2. 使用载玻片架（参见 材料表）以夹持玻璃片并将其放入耐溶剂的培养皿中（参见 材料表）内充满透明/脱蜡试剂（参见 材料表）。确保试剂完全覆盖每张切片上的组织。在将切片完全浸入透明剂之前，先将切片架在透明液中反复浸入或轻轻晃动数次。使切片浸没于透明剂中10分钟或更长时间。
    注意：此步骤可能需要在通风橱中进行，因为所选透明剂可能产生有害烟雾。若使用无毒透明剂，则此步骤中组织的脱蜡过程对时间无严格要求。
  3. 取出并晃动载玻片架以去除多余的透明试剂。在新的耐溶剂培养皿中，重复步骤 5.2。
  4. 在新的耐溶剂染色缸中，重复步骤 5.3。将切片浸没其中 15 分钟或更长时间。此步骤对时间不敏感。

6. 重悬

  1. 取出载玻片架并轻轻振荡，以去除多余的透明试剂。将载玻片架浸入盛有100%乙醇的新耐溶剂培养皿中，反复浸入或晃动数次，然后使载玻片完全浸没5分钟。此步骤对时间敏感。重复2次。
  2. 取出载玻片架并轻轻振荡，以去除多余的100%乙醇。将载玻片架浸入盛有95%乙醇的新耐溶剂培养皿中，反复浸入或晃动数次，然后使载玻片完全浸没5分钟。此步骤对时间敏感。重复1次。
  3. 取出载玻片架并轻轻振荡，以去除多余的95%乙醇。将载玻片架浸入盛有70%乙醇的新耐溶剂培养皿中，反复浸入或晃动数次，然后使载玻片完全浸没5分钟。此步骤对时间敏感。
  4. 取出载玻片架并轻轻振荡，以去除多余的70%乙醇。将载玻片架浸入盛有50%乙醇的新耐溶剂培养皿中，反复浸入或晃动数次，然后使载玻片完全浸没5分钟。此步骤对时间敏感。
  5. 取出载玻片架并轻轻振荡，以去除多余的50%乙醇。将载玻片架浸入盛有去离子水（DI水）的新耐溶剂培养皿中，反复浸入或晃动数次，然后使载玻片完全浸没5分钟。此步骤对时间敏感。
    1. 若需在此暂停，请在完成5分钟水化步骤后，将载玻片转移至含有PBS的容器中，直至可继续进行免疫染色。

7. 抗原修复

  1. 将新的耐溶剂染色缸中加入适量的抗原修复缓冲液。直接将载玻片架转移至该溶液中。确保载玻片完全浸没在抗原修复液中，完全覆盖组织。
    注意：最佳抗原修复液可能因所使用的特定抗体而异。针对不同抗体所需的抗原修复条件可能需要研究人员自行确定。
    1. 配制1x柠檬酸抗原修复缓冲液：每1 L去离子水中加入2.94 g二水合柠檬酸钠（见材料表）。待二水合柠檬酸钠完全溶解后，逐滴加入盐酸（见材料表），调节溶液pH至6.0。最后，每1 L去离子水中加入500 µL Tween20（见材料表）。
    2. 配制1x Tris-EDTA抗原修复缓冲液：在1 L去离子水中加入1.211 g Tris碱和0.292 g EDTA。完全溶解后，调节pH至9.0。
  2. 用盖子盖紧装有抗原修复液和载玻片的耐溶剂染色缸，并用橡皮筋固定盖子。
  3. 将密封好的耐溶剂染色缸放置于压力锅（见材料表）内的金属支架或蒸架上。确保压力锅内加入足量水，使水位达到金属支架或蒸架位置，以便建立压力。
  4. 盖上压力锅盖，顺时针旋转以锁定锅盖。将锅盖上的限压阀旋转至压力档位。
  5. 在菜单设置中选择压力锅的高压模式，然后在时间设置中将压力锅设定为30分钟。选择“开始”。
  6. 30分钟后，压力锅会发出提示音并自动进入保温模式。等待压力自然释放，直至锅盖可轻松旋开。
  7. 使用耐热手套（见材料表）将耐溶剂染色缸从压力锅中取出，并移除橡皮筋和盖子。将染色缸置于冰浴中约30分钟，使载玻片冷却至室温。此步骤对时间无严格要求。
  8. 待冷却至室温后，将载玻片架从耐溶剂染色缸中取出，转移至另一个盛有去离子水的新耐溶剂染色缸中，以去除残留的抗原修复液。确保载玻片完全浸没。
  9. 将载玻片架从去离子水中取出，放入另一个盛有PBS的新耐溶剂染色缸中，孵育5分钟。确保载玻片完全浸没。此步骤对时间无严格要求。

8. 封闭非特异性背景染色

  1. 准备一个加湿染色缸：取一个大型载玻片盒，移除粘附在盖子上的纸板盖。在载玻片盒底部垂直放置湿润的纸巾，并确保纸巾平铺展开。
  2. 从浸没在磷酸盐缓冲液（PBS）中的载玻片架上逐个取出载玻片。小心擦拭载玻片上多余的PBS，避免接触组织区域。
  3. 使用疏水笔（见材料表），在组织周围画一个方框，形成包围组织的疏水屏障。注意避免接触组织，并不要将疏水笔画得离组织太近。
  4. 将画好边界的载玻片水平放置在湿润的纸巾上方。加入封闭缓冲液以覆盖组织（约100 µL）。
    1. 配制封闭缓冲液：将100 µL冷水产鱼皮明胶（Teleostein Gelatin；见材料表）加入9.85 mL PBS中。最后加入50 µL 20% Triton X-100（见材料表），混匀至完全溶解。
  5. 对每张载玻片重复步骤8.2–8.4。盖上加湿染色缸，室温孵育90分钟。

9. 小鼠体内小鼠抗体阻断

  1. 当使用小鼠来源的一抗对小鼠组织进行免疫染色时，需增加一个额外的封闭步骤。市面上可提供鼠源性组织封闭试剂（小鼠对小鼠封闭试剂；参见材料表）；配制小鼠对小鼠封闭试剂时，请遵循商品说明书中的操作步骤。
  2. 轻轻吸去封闭液，并立即加入配制好的小鼠对小鼠封闭试剂，以完全覆盖组织（约100 µL）。对每张将使用小鼠来源一抗进行染色的小鼠组织切片，重复此步骤。
  3. 将组织切片置于湿盒中，在室温下孵育15分钟。
  4. 从湿盒中取出载玻片，直接放入盛有PBS的染色架中，确保载玻片完全浸没于PBS内。静置5分钟，以洗去小鼠对小鼠封闭试剂。

10. 一抗

  1. 针对每张切片，选择由不同物种产生的目标一抗。根据生产商说明书，用抗体稀释液稀释一抗。以下一抗被使用：E-CADHERIN (1:100)，MUC2 (1:200)，PCNA (1:500)，LAMININ (1:200)，β-CATENIN (1:200) 和 LAMP1 (1:50)。
    注意：如果生产商未提供推荐稀释比例，1:100 稀释是一个良好的起始点。如果目标一抗已偶联荧光染料，请参见步骤 12.2。
    1. 如使用上述鱼明胶封闭缓冲液，将封闭缓冲液按 1:20 比例加入 PBS 中，以配制抗体稀释液。
  2. 从 PBS 或湿盒中取出切片，轻轻拍去多余的封闭液或 PBS，然后将其水平放回湿盒中。确保步骤 8.3 中使用疏水笔创建的屏障仍然存在；如有必要，重新勾画组织区域。
  3. 加入适当稀释的一抗，覆盖组织区域（约 100 µL）。
  4. 盖上湿盒，于 4 °C 避光条件下在水平面上孵育过夜。

11. 清洗玻片

  1. 从湿化室中取出载玻片，轻轻甩去一抗，将载玻片放入盛有 PBS 的染色架中，浸洗 5 分钟。
  2. 取出染色架，转移至新的耐溶剂染色缸中，加入 PBS 浸洗 5 分钟。重复此步骤 1 次。

12. 二抗与细胞核复染

  1. 针对每张切片，选择可与一抗物种结合的二抗荧光染料。将二抗荧光染料或荧光标记的一抗用二抗稀释液稀释。所使用的二抗包括：驴抗山羊488（1:200）、驴抗兔cy3（1:200）、驴抗小鼠647（1:200）、驴抗兔647（1:200）以及驴抗大鼠cy3（1:200）。荧光标记647的一抗γ-ACTIN以1:100的比例稀释后使用。
    1. 若使用上述鱼明胶封闭缓冲液，则通过将封闭缓冲液以1:100的比例加入PBS中来配制二抗稀释液。
  2. 从PBS中取出切片，轻轻拍去多余的PBS，并将其水平放回湿盒中。确保第8.3步中使用疏水笔所形成的屏障仍然存在；如有必要，重新勾画组织区域。
  3. 加入适量稀释的二抗荧光染料或荧光标记的一抗，覆盖组织（约100 µL）。
  4. 盖上湿盒，于室温避光孵育1小时。
  5. 用PBS稀释10 mg/mL的Hoechst（参见材料表）或DAPI，使终浓度为1 µg/mL的Hoechst 或DAPI，直接加入组织（约100 µL），于室温避光孵育5分钟。
  6. 从湿盒中取出切片，放入盛有PBS的切片架中，避光浸泡5分钟。
  7. 将切片架转移至另一个盛有PBS的耐溶剂培养皿中，避光浸泡5分钟。重复此步骤1次。

13. 显微镜观察的封片与制备

  1. 从 PBS 浸泡的载玻片架中一次取出一张载玻片，其余载玻片保持在 PBS 中避光保存。轻轻敲去多余的 PBS，如有需要，可使用无尘擦拭纸小心擦去载玻片上的多余 PBS，避免接触组织。
  2. 在组织中央加入一至两滴抗荧光淬灭封片剂（见材料表）。
  3. 用手捏住洁净的盖玻片（见材料表）边缘，以 45° 角缓慢将其放下，覆盖在载玻片上。确保封片剂均匀覆盖组织。
  4. 从组织中心开始，用两个手指轻轻按压盖玻片，以帮助排除气泡和多余的封片剂。如有需要，继续向边缘方向按压，并始终保持轻柔的压力。
  5. 剪去无滤芯 P200 移液器吸头的小端，并将其套在连接真空泵的血清移液管的尖端上。
  6. 沿盖玻片边缘，使用真空装置吸除多余的封片剂。
  7. 将载玻片水平放入新的玻片盒中，于室温避光条件下静置干燥。
  8. 对每张载玻片重复上述操作。

结果

按照先前所述方法进行苏木精和伊红（H&E）染色12。采用优化后的方法，将小肠的三个节段和大肠全部包含在单张载玻片的肠道瑞士卷（Swiss rolls）中。将整个肠道组织容纳于一张切片上，可使研究人员分析肠道各部位的变化，同时节省切片和染色试剂的成本（图1）。此外，在进行免疫染色时，所有肠道节段同时暴露于相同的溶液中，有助于确保结果的准确性。H&E显微图像显示了小肠和大肠各部分的肠道结构均得到良好保存（图2）。对十二指肠绒毛的测量结果显示，未切开的肠道组织与采用瑞士卷方法处理的组织在绒毛高度上无显著差异，表明切开肠道不会破坏组织结构（图2D）。对肠道瑞士卷进行免疫染色，可清晰显示肠壁的各个层次以及完整的绒毛-隐窝轴。荧光图像显示一抗和二抗染色背景信号较低，能够清楚地呈现上皮层中的单个细胞。图3展示了不同肠道节段的形态结构，以及杯状细胞（MUC2阳性细胞）13、顶端膜（γ-ACTIN）14、上皮细胞侧膜（E-CADHERIN）15和细胞核的染色结果。本方案适用于识别多种不同的细胞区域，包括增殖细胞（PCNA）16、间质（LAMININ；图4A）17、溶酶体区室（LAMP1）14以及上皮层（β-CATENIN；图4B）18。

肠道组织准备和包埋过程；使用镊子进行组织卷曲；石蜡包埋方法。
图 1：肠道瑞士卷制备与处理的工作流程。（A）使用含有 PBS 的注射器冲洗肠段，然后在 PBS 中洗涤。（B）将湿润的肠道组织置于干燥的滤纸上。（C）在滤纸上沿纵轴切开肠道，并（D）轻轻展开。（E）将一片滤纸覆盖在打开的肠组织上，轻轻夹紧后用订书钉固定。肠段固定过夜后，（F）使用镊子进行卷绕。（G）用反向作用镊子轻轻取出卷好的肠道组织，（H）呈现出玫瑰花结样外观。（I、J）将肠道组织用针固定并放入大号包埋盒中。（K）四个肠段均置于同一个包埋盒中进行组织处理和包埋。请点击此处查看该图的放大版本。

小肠显微镜检查、组织切片、肠绒毛、组织学分析、数据图表比较。
图 2：肠道四个节段的苏木精-伊红染色。（A）平铺扫描展示了在单张切片上可视化整个肠道的能力，包括十二指肠、空肠、回肠和结肠各自的瑞士卷结构。（B）肠道瑞士卷的显微图像，以及（C）高倍放大插图，显示绒毛和隐窝结构。（D）小肠绒毛长度的定量分析显示，瑞士卷处理组织与未展开组织之间无显著差异。比例尺 = 1000 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

肠道组织免疫荧光；蛋白 E-Cadherin、MUC2、γ-Actin；合并图像。
图 3：小肠四个节段的免疫荧光染色。成年 C57BL/6J 对照小鼠的组织经免疫荧光染色显示细胞核（青色）、侧膜标志物 E-CADHERIN（绿色）、由 MUC2 标记的杯状细胞（黄色）以及顶膜刷状缘标志物 γ-ACTIN（洋红色）。比例尺 = 50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

肠道组织免疫荧光；图像 A 和 B 显示细胞核、PCNA、层粘连蛋白、β-连环蛋白、LAMP1。
图 4．肠道的免疫荧光染色。（A）小鼠肠道免疫荧光染色的代表性显微图像，显示细胞核（青色）、增殖细胞 PCNA（绿色）以及固有层层粘连蛋白 LAMININ（洋红色）。（B）肠道中细胞核（青色）、细胞膜标志物 β-CATENIN（绿色）和溶酶体标志物 LAMP1（洋红色）的免疫荧光图像。比例尺 = 50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文介绍了一种采用瑞士卷（Swiss roll）技术进行组织固定的优化方法，可有效保持肠道结构完整性，并促进准确的免疫染色。一旦掌握，该技术可用于研究涉及肠道生理学和细胞生物学的多种科学问题19。已有多种优化的瑞士卷方法被发表，具有重要参考价值20,21。该技术的一个优势在于能够方便、准确地将肠道在滤纸上展开，使组织在固定时保持平整，防止卷绕过程中组织向内卷曲，这在分析肌层增厚的炎症组织时尤为有利。此外，必须强调组织切片在获得可靠结果中的关键作用。规范的切片操作可确保组织结构的完整保存，并有助于实现准确的免疫染色，从而为后续分析的成功提供保障11。与其他方案相比，该优化方法操作难度较低，不同操作者之间亦可获得一致的结果。本文提出的技术不仅能够良好地保存组织结构，还具有良好的通用性，并可利用多种抗体实现高度可重复的免疫染色。

本方案的一个关键环节是组织的固定和处理时间。不恰当的组织固定和处理会损害组织化学分析结果。过度固定的组织会变得脆硬，而固定不足的组织则过于柔软。无论是过度还是固定不足的组织，均难以切片，并会影响免疫染色效果。一旦将组织展平于滤纸上，应立即放入福尔马林中，以减少死后变化22。在本方案中，小鼠组织在福尔马林中固定过夜。已有多个研究采用此固定时间20,23,24。然而，Boenisch 等人表明，福尔马林固定时间长达 4 天时，免疫染色结果仍保持一致25。固定时间和固定液的选择需根据预期的分析目标进行优化。例如，卡诺伊固定液（Carnoy's fixative）通常更适用于黏液染色26。研究人员应根据自身的实验设计，优化固定液种类和固定时长。建议使用自动组织处理仪，以确保处理时间的准确性和一致性。本实验室使用小型金属针将肠道组织固定成卷状。若不使用金属针，组织在处理过程中可能松开。由于这些金属针非常细小且尖锐，操作时必须格外小心。我们建议在组织处理前，使用金属剪线钳剪除针的尖锐端。部分组织学核心实验室不接收带金属针的组织样本；因此，使用前最好先确认相关规定。另一种替代方法是在处理前使用琼脂固定组织27，或在包埋盒中使用海绵垫片以帮助维持组织卷的形态。

免疫染色是一种需要针对每种抗体进行优化的实验方案。建议尽可能使用经基因敲除验证的抗体。本组织固定与处理方法可实现清晰的染色效果，便于在使用未经验证的抗体时区分抗体结合信号与背景信号。固定剂的选择、抗原修复以及抗体稀释比例均可能影响抗体的特异性。我们建议研究人员通过调整固定条件、抗原修复方法和孵育时间，仔细评估并优化每种抗体的实验流程。为了获得最佳结果，应测试抗体在不同稀释比例下的表现以确定其最佳浓度，并尝试不同的抗原修复缓冲液。表位修复可通过断裂固定过程中形成的亚甲基交联桥来改善免疫染色效果。本方案采用热诱导表位修复而非蛋白酶消化诱导的表位修复，因为酶消化更有可能破坏组织形态28。最常见的热诱导表位修复缓冲液包括柠檬酸缓冲液、Tris-HCl 和 Tris-EDTA，其中柠檬酸缓冲液对组织形态的保护作用最为温和29。缓冲液的选择因抗体而异，需针对每种抗体进行确定。市面上有多种抗原修复缓冲液、封闭溶液及抗体稀释液可供选择，但这些商品化试剂价格昂贵，可能造成较高的成本负担。为此，我们提供了常用抗原修复液、封闭液及抗体稀释液的配制配方，以确保实验的经济性。

该方法的一个局限性在于固定和处理过程可能改变组织并掩盖表位。另一种方法是对新鲜冷冻组织进行免疫染色。新鲜冷冻组织采用速冻方式制备，可避免接触有毒固定剂，保持蛋白质结构，并提高某些表位的可及性。然而，其组织结构和形态学质量较固定石蜡包埋组织差。新鲜冷冻组织的其他挑战还包括切片和储存冷冻组织块及切片所需的材料与物流要求。对肠道组织瑞士卷（Swiss rolls）与条状组织的分析显示，绒毛高度和宽度以及固有层中免疫细胞存在差异，如先前研究报告所述30。这些结果表明，肠道瑞士卷可能改变某些肠道特征，在实验设计时应予以考虑。此外，还需对抗体重新验证，因为许多能特异性结合福尔马林固定石蜡包埋组织的抗体在新鲜冷冻组织中染色效果不佳31。

肠道组织的免疫染色可用于解答有关胃肠道细胞生物学和生理学的多种问题。该技术广泛应用于研究肠道炎症、细菌感染以及癌症进展过程中上皮细胞的变化。本文所述方法非常适合肠道组织的保存，因其成本低、操作简便且具有高度可重复性。为获得最佳结果，我们建议根据实验设计和待验证的假设，对本方案中所述步骤进行优化。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为K01 DK121869（ACE）；本出版物部分由以下项目支持：T32 GM132055（RME）、F31 DK139736（SAD）、T32 DK124191（SAD）、TL1 TR001451（RS）、UL1 TR001450（RS），以及HCS基石奖（SAD & RS）。本工作还得到了南卡罗来纳医科大学（MUSC）启动资金（ACE）的支持，并由MUSC消化系统疾病研究中心核心（P30 DK123704）和消化与肝脏疾病COBRE项目（P20 GM120475）提供资助。成像实验在MUSC细胞与分子成像核心设施完成。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
β-CATENINGeneTexGTX101435
纤维素滤纸Cytiva10427804厚型Whatman滤纸
带电荷载玻片Thermo Fisher Scientific23888114
盖玻片Epredia152440
解剖针（00号）PhusisB082DH4TZF
E-CADHERINR&D SystemsAF748
冷冻手套TempshieldUX-09113-02
加热金属块PremiereXH-2001载玻片加热板
Histo-Clear IIElectron Microscopy Sciences64111-04透明试剂
HoeschtThermo Fisher Scientific62249
盐酸Sigma Aldrich320331
疏水笔Millipore402176
LAMININGeneTexGTX27463
LAMP1Santa CruzSC-19992
大号包埋盒Tissue-Tek4173
显微外科用细针Fine Science ToolsNC9679721
小鼠抗小鼠封闭试剂Vector LaboratoriesMKB-2213小鼠抗小鼠封闭剂
MUC2GeneTexGTX100664
PCNACell Signaling Technology2586S
高压锅CuisinartB000MPA044
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂Thermo Fisher ScientificP36934封片介质
反向作用镊子Dumont5748
载玻片架Tissue-Tek62543-06
载玻片染色套装Tissue-Tek62540-01耐溶剂染色皿及金属框架
小号包埋盒Fisherbrand15-200-403B
二水合柠檬酸钠Fisher BioreagentsBP327-1
鱼类明胶（Teleostein Gelatin）SigmaG7765封闭缓冲液
Triton X-100Thermo Fisher ScientificA16046
Tween 20Thermo Fisher ScientificJ20605-AP
擦拭纸KimTech34155
二甲苯Fisher Chemical1330-20-7
γ-ACTINSanta CruzSC-65638

参考文献

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