本方案提供了一种可重复的方法，用于在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本中可视化基因扩增。
本文内容
摘要
摘要
局灶性基因扩增，例如染色体外DNA（ecDNA），在癌症发生及治疗耐药中发挥重要作用。尽管基于测序的方法能够无偏倚地鉴定ecDNA，基于细胞遗传学的技术（如荧光原位杂交） 原位 荧光原位杂交（FISH）在临床样本中检测染色体外DNA（ecDNA）方面仍具有时间和成本效益。FISH在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本中的应用为检测基因扩增提供了独特途径，尤其适用于无法获得可存活样本进行核型分析的情况。然而，目前该技术尚缺乏统一的操作流程。本方案提供了全面且经过完全优化的分步操作指南，用于在FFPE组织样本中开展FISH以检测基因扩增（包括ecDNA），并旨在克服和标准化此类样本所特有的技术挑战。通过遵循本方案，研究人员可重复地获得高质量的成像数据，以评估基因扩增状态。
引言
局灶性癌基因扩增的研究至关重要，因为它驱动癌症的发生、发展和治疗耐药性1。重要的是，癌基因和免疫调节基因可能以染色体外DNA（ecDNA）的形式扩增，其不对称遗传促进了癌症中的遗传异质性2,3。ecDNA已被证实与治疗耐药性和不良临床预后相关4,5,6。
福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织标本是病理学实验室中重要的存档资源，为回顾性研究提供了丰富的信息。然而，由于固定过程中核酸发生片段化、降解和交联，通过PCR或测序技术从FFPE标本中提取分子数据具有较大挑战性7在可用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织分子分析的多种技术中，荧光 原位 荧光原位杂交（FISH）已被证实可有效用于可视化特定的DNA序列8.
尽管现代分子诊断技术不断进步，FISH 能够在单细胞水平上可视化和定量基因扩增，从而为肿瘤发生机制及临床预后提供宝贵的见解。通过使用与目标基因互补的荧光标记探针，FISH 可便捷地确定癌基因的定位，并推断单个细胞内癌基因扩增的形式（例如 ecDNA），而这一点通过其他技术手段通常难以实现或成本高昂。因此，FISH 为评估肿瘤异质性和克隆演化提供了一种经济有效的方法9。此外，自动化、成像技术和计算分析的进步促进了 FISH 数据的高通量分析，使得在大规模组织样本队列中对基因扩增进行可靠定量成为可能10。
然而，将FISH技术应用于FFPE组织样本时存在固有的挑战，包括交联伪影和背景自发荧光。克服这些障碍需要对每个实验步骤进行细致优化，以确保结果的准确性和可重复性。本文提供了一套逐步完善且经过全面优化的实验方案，用于在FFPE组织样本中应用FISH技术检测基因扩增。通过使用靶向ERBB2（HER2）基因位点的探针，我们证明了FISH能够可靠地检测乳腺癌患者FFPE样本中的ERBB2扩增状态，甚至可以判断ERBB2是否以染色体外DNA（ecDNA）形式扩增。结合现有文献与我们的实验结果，本文阐明了基于FISH分析的方法学考量、技术难点及潜在陷阱。同时，我们还讨论了在多种癌症类型中进行基因扩增谱型分析的临床意义，强调其在预后评估及个体化治疗策略中的潜在价值。
总之，本文强调了FISH作为一种研究FFPE组织标本中基因扩增的重要工具的价值，为肿瘤生物学提供了无与伦比的洞察，并指导肿瘤学领域的临床决策。随着技术的持续优化及其与互补性分子检测方法的整合，基于FISH的分析有望进一步加深我们对癌症发病机制的理解，并在精准医学时代改善患者的预后。
方案
本研究方案已获得德克萨斯大学西南医学中心机构审查委员会（IRB）的批准。所有患者在手术前均已签署知情同意书。
1. 试剂与材料准备
- 在通风橱中，缓慢将 8.212 mL 盐酸（HCl，37% w/w 或 12.1 N）加入 491.788 mL 去离子水中，配制 0.2 N 盐酸（HCl）溶液。2O. 室温（RT）保存。
警告：应缓慢将酸加入水中，切勿将水加入酸中。 - 将 1.47 g 三水合柠檬酸钠溶于 400 mL 去离子水中，配制 pH 6.0 的 10 mM 柠檬酸溶液2O. 使用 HCl 调节 pH 至 6.0，然后用 ddH₂O 定容至 500 mL。2O. 将缓冲液在室温下保存。
- 通过加入100 μL Tween-20至1 mL水中，配制10% Tween-20溶液 µL 的吐温-20 至 900 µddH₂O 升2O. 在室温下保存。
- 通过将5 mL IGEPAL CA-630加入45 mL ddH₂O中，配制10% IGEPAL溶液。2O. 在室温下保存。
- 将 44.1 g 三水合柠檬酸钠（二水合物）和 87.65 g 氯化钠（NaCl）溶于 900 mL 去离子水中，配制 20x SSC 溶液（pH 7.0，3 M NaCl，0.3 M 柠檬酸钠）。2O. 使用 HCl 调节 pH 至 7.0，然后用 ddH₂O 定容至 1000 mL。2O. 将缓冲液在室温下保存。
- 将100 mL 20x SSC加入900 mL ddH₂O中，配制2x SSC溶液。2O. 如有必要，加入0.5 mL防腐剂（材料表。在室温下保存。
- 通过混合910 µL 的 ddH2O, 500 µ20x SSC 50 L µ10% Tween-20 溶液 40 L µL RNase A、1 mL 50% 硫酸葡聚糖和 2.5 mL 甲酰胺。分装为每份 1 mL，于 -20 ℃ 保存 ˚C.
- 将100 mL 2x SSC、15 mL 10% IGEPAL与385 mL ddH₂O混合，配制0.4x SSC含0.3% IGEPAL的溶液。2O. 在室温下保存。
- 将5 mL 10% IGEPAL加入495 mL 2x SSC溶液中，配制含0.1% IGEPAL的2x SSC溶液。室温保存。
- 使用前新鲜配制蛋白酶K消化缓冲液，加入1 µ蛋白酶K L 加至99 µL 的 Tris-EDTA 缓冲液
- 将1 mg DAPI溶解于1 mL ddH₂O中，配制1 mg/mL DAPI储存液。2O. 在 -20 ℃ 保存 °C，并避光。通过加入1 µL 的 DAPI 储存液至 999 µ2x SSC 溶液的 L。避光保存至使用。
2. 样品预处理
注意：此处使用的载玻片含有样本。
- 将载玻片在 60–90°C 下烘烤 20 分钟或过夜（图 1）。
注意：此步骤有助于熔化石蜡。通常，加热 20 分钟已足够，也可延长至过夜以适应实验安排。 - 将载玻片浸入 Coplin 染色缸中的二甲苯或其替代品中 10 分钟以脱蜡。用新鲜的二甲苯或其替代品重复此步骤一次。后续所有预处理和洗涤步骤均在 Coplin 染色缸中进行。
注意：二甲苯替代品是安全且环保的二甲苯替代物。其中一种替代品（参见材料表）的效果与二甲苯相当甚至更优。尽管二甲苯替代品产生的气味较轻，但仍建议在通风橱内使用。若无法获得二甲苯替代品，所有步骤均可兼容基于二甲苯的脱蜡过程，无需任何修改。 - 用 100% 乙醇洗涤 5 分钟以去除残留的二甲苯替代品。
- 用 70% 乙醇浸泡 5 分钟以使组织复水。
- 将载玻片在室温下浸入 0.2 N 盐酸（HCl）中 20 分钟。
注意：HCl 可有效提取酸溶性蛋白（如碱性核蛋白），从而提高 DNA 对 FISH 探针的可及性11。 - 将载玻片浸入 10 mM 热柠檬酸溶液中，在 90–95 °C 下孵育 20 分钟。
注意：高温下的柠檬酸处理同样可提取酸溶性蛋白。两种酸处理均被认为可去除细胞外基质蛋白，从而降低自发荧光12。建议在将柠檬酸溶液加至载玻片前，先将其预热至目标温度范围。微波加热是一种便捷的方式。水浴（如使用 sous vide 烹饪器）则是高温孵育最有效且经济的方法。 - 用 2x SSC 快速冲洗载玻片以中和 pH。
- 加入 100–200 µL 蛋白酶 K 消化缓冲液（用量需完全覆盖组织，具体取决于切片大小），消化组织并在室温下孵育 1 分钟。
注意：蛋白酶 K 消化可进一步提高 FISH 探针的可及性并降低自发荧光。消化时间应根据组织类型进行优化。大多数情况下，1 分钟的消化时间已足够。过度消化会导致细胞核呈晕环状形态，此时应缩短消化时间。 - 立即终止蛋白酶 K 消化，并通过将载玻片依次浸入 70% 乙醇（2 分钟）、85% 乙醇（2 分钟）和 100% 乙醇（2 分钟）进行脱水。
3. 荧光原位杂交与成像
- 通过稀释2来制备FISH杂交混合液 µFISH 探针原液 8 微升 µL杂交缓冲液，然后将其加至载玻片上。用盖玻片覆盖样本。
注意：使用的总FISH探针原液量范围为0.5–4 µL，具体取决于图像质量。如果信号过弱，可增加探针用量；如果背景过高，尤其是观察到细胞核外存在荧光碎片时，应减少FISH探针用量。杂交缓冲液可使用商业探针配套提供的缓冲液，或按照第1节所述自行配制。 - 将载玻片置于加热板上，例如载玻片槽杂交系统，于75 ℃下变性DNA °在75℃条件下持续2至5分钟。随后，将载玻片转移至另一设定为37℃的加热板上 °在37摄氏度的加热板上过夜杂交。
注意：如果热板带有用于在杂交过程中维持湿度的水盘或储水槽，则无需使用橡胶胶水密封盖玻片。 - 杂交后，将载玻片浸入40–60 °将预热的含0.3% IGEPAL CA-630的0.4x SSC洗涤缓冲液加入，然后小心移除盖玻片。在避光条件下继续洗涤两次，每次5分钟，第一次加入缓冲液后的10-15秒内进行振荡。
注意：将载玻片浸入洗涤缓冲液中可轻柔地去除盖玻片。 - 在室温避光条件下，用含 0.1% IGEPAL CA-630 的 SSC 缓冲液洗涤载玻片，振荡 5 分钟，前 10–15 秒需持续振荡。
- 为淬灭自发荧光，使用自发荧光淬灭试剂盒处理载玻片（参见 材料表) 通过施加 150 µ升试剂（50 µL + 50 µL + 50 µL 的试剂 A、B、C）中孵育 2-5 分钟，然后用 2x SSC 洗涤 5 分钟。
注意：此为可选步骤。组织自发荧光主要来源于细胞外基质成分，例如胶原蛋白和弹性蛋白。由于溶酶体和线粒体含有脂褐素、NADPH和黄素辅酶，也会显著影响自发荧光。醛类固定剂的使用以及血液细胞的存在也可能明显增强自发荧光13,14. - 用 DAPI 染色 10 分钟。用 2x SSC 缓冲液冲洗 5 分钟。
注意：如果未使用自发荧光淬灭试剂盒处理载玻片，DAPI 染色时间可缩短至 2 分钟。 - 将载玻片迅速浸入去离子水中不超过1秒，然后用纸巾吸去多余水分，迅速擦干。
注意：此步骤为可选步骤。去离子水处理可有效防止 SSC 缓冲液在载玻片上形成盐结晶，从而提高成像质量。然而，在这种低离子条件下，FISH 探针与靶向 DNA 之间的氢键会被削弱，导致探针解离和信号丢失。因此，必须将水处理步骤的时间控制得非常短暂。 - 干燥玻片，然后用抗荧光淬灭封片剂封片。成像前用指甲油密封盖玻片。
注意：如果载玻片经过自发荧光淬灭试剂处理，应根据制造商说明使用抗荧光淬灭封片介质进行封片。此外，根据封片介质的类型（硬化型或非硬化型），样品需在封固和成像前固化1至24小时。建议至少过夜固化，以获得最佳成像折射率。 - 使用60× 使用油镜捕捉荧光信号。利用 DAPI 通道调节焦距。确保获取多个 Z 层切片。通常，以 1-µm 间隔已足够。进行最大强度三维投影以获得最佳分辨率。应用去卷积或其他背景清除算法以进一步提高图像质量。
结果
我们采用来自 HER2 阳性和阴性乳腺癌的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本，以展示 FISH 成像的结果。HER2（由ERBB2基因编码）的扩增是一个有利的标志物，因为针对 HER2 的分子靶向治疗已有多种可用且疗效显著的方案。相反，三阴性乳腺癌患者由于缺乏 HER2、雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）的表达，治疗选择有限，预后较差。因此，确定HER2状态在乳腺癌的研究与治疗中至关重要15。
在三阴性乳腺癌样本中，大多数细胞核显示两个独立的点状信号，代表HER2/ERBB2 FISH信号。由于切片偏差，部分细胞核可能仅显示一个点状信号（图2，左）。相比之下，HER2阳性样本中FISH信号丰富，呈现两种不同模式。一种模式表现为信号点在细胞核内弥散分布（图2，中），这是ecDNA形态的典型特征，因为ecDNA可能不占据特定且有序的核内区域16。此外，ecDNA在有丝分裂过程中不对称分离，导致拷贝数变异，从而引起细胞核间信号异质性17。部分细胞核可能偶尔出现信号簇集，提示存在ecDNA集线（hubs）18（图2，右）。另一种HER2扩增类型主要表现为杆状、致密的聚集结构，该形态可能提示基于染色体的扩增机制，例如均一染色区（homogeneously staining regions, HSR）19或断裂-融合-桥（breakage-fusion-bridge, BFB）循环20。值得注意的是，ecDNA、HSR和BFB扩增可在同一细胞核中共存。因此，建议观察多个细胞核以推断局灶性扩增的具体形式。
图 1：FFPE 样本中 FISH 的示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：乳腺癌FFPE样本中典型的FISH图像。 放大倍数：600倍；比例尺：10 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。
讨论
FISH 是一种快速且经济的细胞遗传学诊断方法。特别是在确定癌症中是否存在 ecDNA 时，FISH 证据仍是金标准1。对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织进行 FISH 检测，可快速判断患者活检样本中的基因状态，从而实现更迅速的诊断，并在疾病进展过程中持续追踪其变化。该技术对于已为病理学目的采集的临床样本检测尤为有价值。
本方案包含多个关键步骤。第一步是彻底脱蜡。残留的石蜡可能干扰FISH杂交。如果在步骤2之后样本仍呈现蜡状，应使用新鲜的二甲苯或其替代品再次处理。
其次，蛋白质提取和消化至关重要。这些步骤不仅能增强DNA对FISH探针的可及性，还能显著降低自发荧光。本方案包含三个去蛋白步骤。尽管使用0.2 N HCl和10 mM柠檬酸的处理较为简单，但蛋白酶K消化可能需要优化。使用蛋白酶K时最常见的错误是过度消化，会导致细胞核呈现晕环状。缩短消化时间可改善细胞核形态。此外，建议同时消化的样本不超过四个，以尽量减少第一个与最后一个样本之间的处理时间差异。需要注意的是，即使完整的细胞核在高倍镜和高分辨率显微镜下也可能呈现晕环状，这是因为细胞核不在同一焦平面上。因此，建议采集多个Z轴层扫描图像，并进行最大值投影以观察细胞核形态。
最后，建议淬灭自发荧光。尽管酸提取和蛋白酶K消化可显著降低蛋白质来源的背景信号，但荧光代谢物仍可能影响成像质量。
尽管 FISH 在识别局灶性基因扩增方面具有无与伦比的空间分辨率，但它也存在局限性。首先，与 PCR 或基于下一代测序（NGS）的方法相比，其通量和检测内容有限。通常，在无需特殊设备的情况下，一张切片上仅能应用一到三种不同颜色的 FISH 探针。然而，自动化技术的进步已使得高通量、高含量的 FISH 技术（如in situ测序21）成为可能。其次，FISH 探针的设计需要预先掌握目标序列信息。目前针对癌症中反复出现的局灶性扩增事件的研究，已推动了预设计 FISH 检测面板的开发，可用于实验室和临床应用。例如，在小细胞肺癌中，MYC 家族癌基因常以染色体外 DNA（ecDNA）形式扩增，从而介导化疗耐药性。因此，靶向 MYC、MYCL 和 MYCN 基因的 FISH 检测面板可加快对活检样本治疗反应的判断。相比之下，NGS 能够对目标基因进行更无偏倚的筛查。然而，在基于 NGS 的技术中，只有通过计算成本较高的分析进行全基因组测序22，才能实现对 ecDNA 的表征。
综上所述，我们提供了针对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中局部基因扩增研究的可靠且全面的操作指南。通过分析荧光原位杂交（FISH）信号模式，可以明确判断基因位点是否发生扩增以及其扩增方式。我们预期将机器学习技术引入间期细胞核图像分析23，以提取有关拷贝数及扩增形式（染色体或染色体外DNA，ecDNA）的细胞遗传学信息，从而简化分子诊断流程，并加深对癌症致病机制的理解。
披露
S.W. 是 Dimension Genomics Inc. 科学咨询委员会的成员。
致谢
S.W. 是德克萨斯州癌症预防与研究所（RR210034）的支持学者
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DAPI | Tocris Bioscience | 5748 | 细胞核染色 |
| 50% 硫酸葡聚糖溶液 | EMD Millipore Sigma | S4030 | 探针杂交缓冲液 |
| ERBB2 (HER2) FISH 探针 | Empire Genomics | ERBB2-20-RE | FISH 探针 |
| 乙醇 | Decon Labs | 2716 | 组织脱水和水化 |
| 甲酰胺 | Thermo Scientific Chemicals | 205821000 | 探针杂交缓冲液 |
| Formula 83（二甲苯替代物） | CBG Biotech | CH0104A | 去除石蜡 |
| 盐酸 | Fisher Chemical | A144-500 | 样本预处理 |
| IGEPAL CA-630 | Thermo Scientific Chemicals | J19628K2 | 玻片洗涤 |
| Proclin 300 | Sigma-Aldrich | 48914-U | SSC 缓冲液防腐剂（可选） |
| 蛋白酶 K（800 单位/mL） | New England Biolabs | P8107S | 蛋白质消化 |
| RNase A（20 mg/mL） | New England Biolabs | T3018L | 探针杂交缓冲液 |
| Slide Moat 杂交系统 | Boekel Scientific | 280001 | 样本变性与杂交。可使用其他加热板替代。 |
| 氯化钠 | Fisher Chemical | S2713 | SSC 缓冲液 |
| 二水合柠檬酸钠 | Fisher BioReagents | FLBP3271 | SSC 缓冲液和样本预处理 |
| Tris-EDTA (TE) 缓冲液 | Fisher BioReagents | BP2473500 | 蛋白酶 K 消化缓冲液 |
| Tween-20 | Fisher BioReagents | BP337-500 | 探针杂交缓冲液 |
| Vectashield 抗荧光淬灭封片介质 | Vector Laboratories | H190010 | 玻片封片 |
| Vector TrueVIEW | Vector Laboratories | SP8400 | 自发荧光淬灭试剂盒 |
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