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方法文章

感染中的免疫代谢回路推动宿主导向治疗的发展

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DOI：

10.3791/66980

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2024年9月13日

 , 
1Systems Medicine Laboratory, Biotechnology Research and Innovation Council - National Centre for Cell Science (BRIC-NCCS)

本文内容

摘要

本文介绍了一种设计、构建和递送基于四环素调控的可诱导合成回路的实验方案。通过利用本方案所提供的技术流程，可研究合成回路对寄生虫清除及细胞因子表达的影响。该方案适用于从事感染性疾病中基于合成回路治疗研究的科研人员。

摘要

免疫代谢是利什曼病进展的关键决定因素。基于合成生物学的方法因其能够靶向驱动利什曼病的宿主相关因子，作为治疗干预的一种策略，已受到广泛关注。合成生物学以正交且模块化的方式对遗传元件进行工程化设计，从而精确调控生物系统，并赋予细胞新的功能。本研究旨在阐明一种系统性流程，用于开发基于可诱导四环素调控（TetON）的合成基因线路，以递送琥珀酸脱氢酶作为治疗剂，促进清除细胞内Leishmania寄生虫。文中所述方案详细描述了合成基因线路的设计及其后续验证过程。该策略还聚焦于将合成基因线路整合至质粒骨架中作为递送载体。此外，采用基于聚复合物纳米颗粒的递送系统，在不破坏细胞形态的前提下，将合成基因线路递送至小鼠巨噬细胞系。本研究对转染细胞的筛选及合成基因线路表达的最佳诱导浓度进行了方法学标准化。观察结果显示，与感染细胞相比，转染细胞内的寄生虫负荷显著降低。在转染并诱导合成基因线路的细胞中，感染后表达促炎性细胞因子，作为促进寄生虫清除的机制之一。这凸显了基于合成生物学的方法通过靶向与疾病进展相关的宿主因子，在利什曼病治疗中的强大潜力。

引言

整体性和整合性医学的进步揭示了免疫细胞代谢改变与其在感染性疾病中调节免疫细胞表型能力之间的重要关联。免疫代谢学为阐明人类常见感染性疾病的发病机制提供了新的视角，同时通过发现新的干预靶点，为疫苗和药物的开发提供了有前景的技术1。在包括利什曼病在内的多种感染性疾病中，均已观察到免疫细胞的代谢重编程。Leishmania spp. 是导致利什曼病的病原体，其中Leishmania major （L. major）引起皮肤利什曼病（CL）。L. major 作为胞内寄生虫，对宿主细胞（尤其是巨噬细胞）的代谢产生显著影响，以促进其自身的增殖与存活2。巨噬细胞通常可极化为经典活化型（M1）或替代性活化型（M2）亚群：M1细胞通过氮代谢途径分泌大量促炎性细胞因子并产生一氧化氮（NO）；而M2细胞则表现出较高的抗炎性细胞因子水平，并通过氮代谢展现出高精氨酸酶活性3。因此，这两种表型不仅在免疫应答上存在差异，在其代谢通路上也各不相同。

利什曼病的系统生物学旨在通过药物设计与开发，识别用于设计新型治疗手段的分子靶点。信号网络和代谢通路的重建有助于将利什曼病作为一个整体模型来理解，并为识别驱动疾病状态的关键组分提供洞见。数学建模是理解利什曼病复杂性的最受青睐的应用分析方法之一4。免疫代谢网络与数学模型帮助识别出琥珀酸脱氢酶（SDHA）是M1表型的关键组分，该表型表达以清除寄生虫5。合成生物学在利什曼病的诊断、疫苗开发和治疗方面具有应用价值。通过合成生物学工具，可实现以代谢为靶点的免疫反应调控。为了调控肌醇磷酸神经酰胺合成酶（该酶调控鞘脂代谢并改变宿主免疫信号通路），研究人员使用了一个具有双稳态行为的基因回路，对L. major感染模型的内在鲁棒性进行人工调控6,7。因此，系统生物学与合成生物学可为Leishmania模型系统中精准医学的发展提供基于模型的基因工程平台。

M1 表型的特征是免疫代谢信号网络的表达，其中炎性细胞因子的产生与代谢通路协同增强寄生虫的清除。M1 极化表现为促炎性细胞因子的生成，如白细胞介素-12（IL-12）、γ-干扰素（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）。在 M1 表型中高度富集的代谢通路包括糖酵解、磷酸戊糖途径以及截短的三羧酸循环（TCA 循环）5。截短的 TCA 循环通过提高琥珀酸和柠檬酸水平，驱动一氧化氮（NO）的生成，从而促进寄生虫清除机制3。由 SDHA 介导的琥珀酸积累可激活转录因子缺氧诱导因子1-α（HIF-1α），进而诱导 IL-1β 的产生8。在 M2 表型中，可观察到脂肪酸氧化、谷氨酰胺利用增加以及葡萄糖的氧化磷酸化增强，同时伴有抗炎性细胞因子的产生，如白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子β（TGF-β）、白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-13（IL-13）3。M2 型巨噬细胞以线粒体延长为显著特征，从而提高能量生成效率。它们利用脂肪酸、葡萄糖和谷氨酰胺作为底物驱动 TCA 循环，通过更高效的氧化磷酸化生成 ATP，以促进寄生虫的生长与增殖9。负责通过截短 TCA 循环积累琥珀酸的 SDHA 酶不仅可促进 NO 的生成，还可通过电子传递链启动琥珀酸依赖性的氧气消耗10。在利什曼原虫感染的巨噬细胞中，SDHA 的表达水平下调了 2.17 倍，提示有氧呼吸可能也受到抑制11。为了增加琥珀酸的消耗，诱导促炎性细胞因子介导的 NO 生成并促进寄生虫清除，SDHA 的表达至关重要。

该合成回路可提供精准靶向治疗，可能改变病变系统，实现双稳态振荡，从而在时空水平上恢复健康表型。合成回路的递送与表达使系统具备动态性和鲁棒性。推动合成生物学发展的一个关键因素在于能够以模块化方式组装基因元件和功能单元，从而构建复杂的结构并实现定制化的功能12。传统表达技术相关的局限性促使基于四环素操纵子的可诱导质粒合成回路应运而生，从而实现质粒的快速评估以及在多种细胞类型中的高效递送13。四环素响应阻遏蛋白（TetR）以二聚体形式存在时，对四环素操纵子（TetO）具有强结合亲和力，可有效抑制转录。然而，当其与配体强力霉素（dox）结合后，TetR发生构象改变，从而从TetO上解离，继而允许转录无障碍进行。该回路可实现对蛋白质翻译的调控14。因此，通过既定方法，设计出基于四环素操纵子的可诱导质粒合成回路，可在pEGFP-N1载体中表达SDHA。对回路转化效率及其产物的评估有助于了解递送的有效性。通过载体的限制性酶切，验证了克隆效率。此外，观察了转染后的RAW264.7小鼠巨噬细胞系（源自Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞）在强力霉素剂量依赖下的绿色荧光蛋白（GFP）表达情况。同时，转染细胞中寄生虫清除效应与合成回路的表达相互印证。此外，在转染并诱导合成回路的细胞中，随着感染时间点的延长，促炎性细胞因子的诱导与表达亦被观察到，这直接关联于合成回路的功能发挥。

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方案

1. RAW264.7 细胞的细胞培养

注意：实验应使用低代次细胞。RAW264.7 细胞系购自印度浦那生物技术研究创新委员会-国家细胞科学中心（BRIC-NCCS）国家细胞库。由于 RAW264.7 细胞系为巨噬细胞细胞系，随着传代次数增加可能开始发生分化。细胞复苏后，需传代 2 次后再用于转染实验。

  1. 在25 cm2培养瓶中接种5 × 105个RAW264.7细胞系细胞，加入5 mL含10%胎牛血清（FBS）和100 I.U./mL青霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）作为完全培养基。
  2. 将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养，直至细胞融合度达到90%。
  3. 弃去培养基，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次。向 培养瓶中加入1 mL PBS，用细胞刮铲刮下细胞，并将细胞收集至1.5 mL离心管中。
  4. 在24 °C下以300 × g离心5分钟，用1 mL移液器将沉淀重悬于1 mL完全DMEM培养基中。
  5. 使用0.5%台盼蓝染色，在细胞计数板中计数细胞，以确定活细胞百分比。

2. L. major 寄生虫的细胞培养

注意：L. major 前鞭毛体（MHOM/Su73/5ASKH）由BRIC-NCCS提供。前鞭毛体的传代次数应少于10次。较低的传代次数可确保寄生虫处于健康状态，并具有更强的感染巨噬细胞的能力。

  1. 在补充了20%胎牛血清（FBS）的RPMI完全培养基中培养L. major前鞭毛体（MHOM/Su73/5ASKH）。
  2. 将1 × 106个前鞭毛体接种至含有5 mL完全培养基的非通气25 cm2培养瓶中。于27 °C培养5天，并在明场显微镜下以20倍物镜观察处于静止期的L. major前鞭毛体寄生虫。
    注意：静止期前鞭毛体通常在培养后4–7天获得，其特征为细长的具鞭毛形态及运动能力降低。

3. 设计质粒中的合成回路作为递送载体

  1. 设计合成回路的组成部分
    1. 打开 Tinker Cell 软件，进入“Parts”选项卡。选择 启动子 从元件库中选取一个组件并将其放置到画布上，以表示合成回路中的巨细胞病毒（CMV）启动子。从“元件”选项卡中调取阻遏蛋白结合位点（类似于TetO），并将其放置在画布上紧邻启动子的位置，与CMV启动子无缝整合。
    2. 整合 四环素操纵子（TetO），内部核糖体 进入位点（IRES）以及编码区 拖拽并放置阻遏蛋白结合位点， 核糖体结合位点（rbs）和编码区 到画布上，将它们与 现有的遗传组分
    3. 将编码区重命名为TetR，代表四环素响应性阻遏蛋白，其在合成回路中作为假定的负调控因子发挥作用。合并这些遗传元件以促进合成元件的构建。
    4. 在载体上引入一个间隔区（sd1），该间隔区设计为可被细胞蛋白酶（如猪捷申病毒-1 2A蛋白酶，P2A）切割。向合成构建体中添加代表目的基因的额外编码区，将其标记为SDHA，并与其他元件整合。
    5. 在 SDHA 编码区的邻近位置，插入另一段蛋白酶可切割的间隔区（sd2），该间隔区可被细胞蛋白酶 P2A 切割。将代表报告基因的编码区引入载体，并将其标记为 GFP。
      注意：GFP 表达可能用于评估 SDHA 的产生情况，并确保合成回路具有逻辑功能13.
    6. 在GFP旁边添加一个终止子（ter1），并通过检查所有部件是否已连接来验证组装结果。点击任一部分时，电路必须显示为红色，以确认功能性的基因电路已成功构建。
    7. 在“反应”选项卡中，为 TetR、SDHA 和 GFP 分配调控速率，包括蛋白质合成的参数和初始值，以界定合成回路中的翻译反应。
    8. 从“部件”选项卡中添加一个小分子，将其命名为多西环素（dox），并通过选择为其分配一个波函数 输入 从“部件和连接”选项卡中，然后单击 波输入.
    9. 从 调控 标签，点击 抑制反应. 拖放 反应速率 在画布上设置多西环素（dox）与 TetR 之间的反应动力学，通过双击 dox 与 TetR 之间的连接来完成 波函数 在多西环素上调整图标 多西环素.sin.振幅 至 10。
    10. 通过从反应列表中选择 TetR 蛋白与阻遏物结合位点之间的转录调控反应来实现 调控 选项卡并将其放置在 TetR 和 TetO 之间的画布上。
    11. 双击每一个 组分与反应，设置模拟的初始浓度和参数。点击 模拟，选择 确定性的 并模拟电路运行100个时间单位。通过随图形弹出的控制面板调整仿真图形，观察SDHA和TetR蛋白的图形变化模式。
  2. 从iGEM元件库中鉴定遗传组分
    1. 打开标准生物部件注册库（Registry of Standard Biological parts）材料表）并点击 搜索输入遗传组分的名称，例如 CMV 启动子。
      注意：必须对合成回路中的所有遗传组分执行iGEM ID的搜索流程。此处列出了识别CMV启动子iGEM ID的步骤；随后，其他组分需重复上述步骤。
    2. 要获得CMV启动子的核苷酸序列，请点击 获取片段序列 选项，并将文件保存为文本文件。
      注意：所有遗传元件的库存均是可获取的。
    3. 重复步骤 3.2.1 和步骤 3.2.2，针对所有遗传元件（四环素操纵子、Kozak 序列、TetR、P2A 和 GFP），但 SDHA 除外。
    4. 为了获得 SDHA 的蛋白质编码序列，打开 NCBI 并选择 核苷酸 从搜索窗口旁边的下拉菜单中。输入琥珀酸脱氢酶和 小家鼠 并搜索核苷酸序列。
    5. 点击 CDS选项 获取SDHA的编码序列并将序列保存在文本文件中。
    6. 将所有遗传调控元件的核苷酸序列依次合并到一个文件中。在Kozak序列之后紧接添加起始密码子（ATG），并去除内部的终止密码子，以避免新生多肽的形成。
    7. 打开 ExPASy 网站15 并粘贴核苷酸序列。点击 翻译序列 选项。选择 5'3' 框架 1 并移除终止密码子，这些终止密码子将在结果部分以红色高亮显示。
      注意：为了确定核苷酸序列是否有效翻译为所需的多肽序列，可使用 ExPASy 等翻译工具。这有助于防止产生非预期的新生多肽。选择 pEGFP-N1 载体用于表达合成回路是最佳方案，因为该载体中已预先存在 CMV 启动子和 GFP 基因。所有遗传元件均通过克隆方案（外包完成）进行组装。用于克隆插入片段的限制性内切酶为 NotI 和 XhoI。这些限制性内切酶位点位于 pEGFP-N1 载体的多克隆位点内。

4. 将合成回路转化至大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）DH5α细胞中

  1. 制备 E.coli DH5α 感受态细胞
    注意：建议对试剂进行高压灭菌。试剂可于4 °C保存至使用。
    1. 在37 °C、180 rpm条件下，将1 mL新鲜接种物接种于50 mL LB（Luria Broth）培养基中培养，培养约2小时，直至菌液在600 nm处的光密度（OD）达到0.4–0.6。
    2. 以 4,696 x g 离心细胞 g 4 °C 下离心 15 分钟。将 50 mL 离心管倒置，手动将上清液弃入废液瓶中，收集细胞沉淀。
    3. 轻轻用1 mL移液器将沉淀重悬于2 mL预冷的0.1 M氯化镁（MgCl₂）溶液中。再用预冷的MgCl₂溶液定容至20 mL。2.
    4. 以 4,696 x g 离心试管 g 4 °C下离心10分钟，弃去上清液。用1 mL移液器将细胞轻轻重悬于1 mL预冷的0.1 M氯化钙（CaCl₂）溶液中。2）并在冰上孵育2小时。使用新鲜制备的感受态细胞进行转化。
  2. 合成回路构建物转化感受态细胞
    1. 取50 µL感受态细胞，加入1.5 mL离心管中，将离心管置于冰上。向分装的感受态细胞中加入10 ng合成回路构建物，冰上孵育3 min。
    2. 将细胞置于42 °C干式加热块中热激3分钟。干式加热块孵育结束后，立即将细胞放回冰上孵育3分钟，向细胞中加入1 mL LB培养基，于37 °C、250 rpm条件下振荡孵育1小时。
    3. 孵育完成后，以 4,696 x g 离心细胞 g 室温（RT）孵育5分钟，用1 mL移液器弃去上清液。将细胞重悬于100 µL LB培养基中，涂布于含50 µg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上。将平板倒置，于37 °C培养24小时。

5. 合成回路结构的分离

  1. 在50 mL离心管中，取10 mL LB培养基，并加入50 µg/mL卡那霉素作为筛选培养液，用于培养转化细胞以进行质粒提取。用200 µL枪头挑取一个转化菌落，加入该筛选培养液中。
  2. 使用接种环另选一个单菌落，采用五区划线法在平板上划线，并于37 °C培养24小时，以维持单菌落分离状态。
  3. 将细胞在37 °C、180 rpm条件下过夜培养。次日，在24 °C下以4,696 × g离心20分钟。离心后，通过倒置离心管弃去上清液，向沉淀中加入1 mL重悬缓冲液（50 mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）、10 mM乙二胺四乙酸（EDTA）、100 µg/mL RNase A（pH 8.0）），并通过轻柔吹打重悬细胞。
    注意：在将混合液加入细胞沉淀前5分钟，向重悬缓冲液中加入RNase A。
  4. 室温孵育5分钟。向细胞中加入1 mL裂解缓冲液（0.2 N氢氧化钠（NaOH）、1%十二烷基硫酸钠（SDS）），通过倒置离心管混匀2分钟。室温孵育5分钟。
  5. 向细胞中加入1 mL中和缓冲液（3 M乙酸钾（CH3CO2K）），通过多次倒置离心管混匀。室温下以4,696 × g离心20分钟，收集上清液至1.5 mL离心管中。
  6. 向上清液中加入500 µL异丙醇，通过倒置充分混匀。将上清液置于冰上孵育15分钟，然后在4 °C下以12,000 × g离心30分钟。
    注意：孵育时间可在5分钟至1小时之间调整。在此期间，建议每隔5分钟轻轻倒置混匀一次。
  7. 弃去上清液，向沉淀中加入1 mL预冷的70%乙醇，于4 °C下以12,000 × g离心5分钟。重复此步骤一次。
  8. 将沉淀空气干燥，用20 µL无菌无核酸酶水（NFW）重悬所得质粒。使用分光光度计在260/280 nm波长下测定质粒浓度。
    注意：若质粒浓度过高无法通过NanoDrop准确测定，可加入更多NFW进行稀释。质粒稀释操作必须在超净工作台中进行。

6. 合成回路的琼脂糖凝胶电泳（AGE）

  1. 琼脂糖凝胶电泳（AGE）质粒样品的制备
    1. 在1.5 mL离心管中，加入20 µL 1x Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液。加入4 µL 6x上样缓冲液，通过移液充分混匀。
    2. 短暂离心后，加入1 µg合成回路质粒载体，并通过移液充分混匀混合物。该反应混合物可直接上样至琼脂糖凝胶。
      注意：避免剧烈移液，以免破坏质粒结构。建议通过短暂离心混合试剂。
  2. 合成回路的限制性酶切
    1. 在1.5 mL离心管中，加入2 µL 10x限制性酶缓冲液、1 µL NotI和1 µL XhoI限制性内切酶，短暂离心使内容物充分混匀。加入1 µg合成回路质粒载体，并再次短暂离心混匀。
    2. 用无核酸酶水（NFW）补加至总体积为20 µL，并短暂离心混匀。将离心管置于37 °C孵育1小时。
    3. 孵育结束后，将离心管置于70 °C干式加热块中15分钟，以灭活限制性内切酶。冷却后，在反应体系中加入6 µL上样缓冲液，短暂离心混匀。该反应混合物可上样至琼脂糖凝胶。
    4. 制备琼脂糖凝胶，并按照先前描述的方案16进行电泳。简要步骤如下：每孔上样20 µL样品，加入5 µL 1 Kb DNA Marker，以100 V电压进行电泳。电泳完成后断开电源，使用凝胶成像系统获取图像，并开启荧光模式以观察条带。

7. 在 RAW264.7 细胞系中转染合成回路构建体

  1. 样品制备
    1. 制备样品以通过诱导型合成回路确定其杀灭寄生虫的效果。第一个样品为未转染的 RAW264.7 细胞（对照组），第二个样品为感染利什曼原虫前鞭毛体（L. major promastigotes）6 小时的 RAW264.7 细胞（6 小时感染组），第三个样品为转染合成回路并用多西环素（dox）诱导的 RAW264.7 细胞（IMT）；感染时间点样品为转染合成回路并用多西环素诱导后感染 L. major 前鞭毛体的 RAW264.7 细胞（IMTI），分别在感染后 6 小时（6 小时 IMTI）、12 小时（12 小时 IMTI）、18 小时（18 小时 IMTI）和 24 小时（24 小时 IMTI）取样。
    2. 制备所有样品时，从 25 cm2 培养瓶中刮取 RAW264.7 细胞，并在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。
    3. 将沉淀重悬于 1 mL 完全 DMEM 培养基中。取 10 µL 重悬细胞加入 100 µL 离心管中，加入 10 µL 0.5% 台盼蓝溶液，充分混匀。
    4. 取 10 µL 细胞与台盼蓝混合液滴加至细胞计数板，对四个计数室进行细胞计数。
    5. 将细胞以每孔 2 × 104 个的密度接种于盖玻片底 96 孔板中，于 37 °C 培养 24 小时。此样品作为对照组。该步骤在制备其他样品时保持不变。
      注意：使用前需将培养基在 37 °C 水浴中预热。
    6. 制备 6 小时感染样品时，取 1 mL 处于静止期的 L. major 前鞭毛体，在 7,273 × g 条件下离心 10 分钟。将沉淀重悬于 500 µL 完全 DMEM 培养基中，并按照步骤 7.1.3–7.1.4 使用细胞计数板进行细胞计数。
    7. 向每孔加入 2 × 105 个 L. major 前鞭毛体，在含 5% CO2 的环境中 37 °C 孵育 6 小时。孵育结束后，用 PBS 洗涤细胞 3 次。
    8. 制备 IMT 样品时，按照步骤 7.1.2–7.1.5 接种细胞，并执行转染步骤 7.2.1–7.2.6。
    9. 制备 IMTI 不同时间点样品时，先执行步骤 7.1.2–7.1.5 并完成转染步骤 7.2.1–7.2.6。弃去含有 500 µg/mL 遗传霉素（G418）和 1 µg/µL 多西环素的完全 DMEM 培养基，用 1× PBS 洗涤细胞 3 次。
    10. 向各孔加入 2 × 105 个 L. major 前鞭毛体，分别孵育 6 小时、12 小时、18 小时和 24 小时。感染结束后，弃去含前鞭毛体的完全 DMEM 培养基，用 1× PBS 洗涤各孔 3 次。向每孔加入 200 µL 含 500 µg/mL 遗传霉素（G418）和 1 µg/µL 多西环素的完全 DMEM 培养基，于 37 °C 孵育 24 小时。
  2. 合成回路的转染
    1. 在 1.5 mL 离心管中加入 24 µL 减血清培养基（一种改良的最低必需培养基），再向其中加入 1 µg 含合成回路质粒的 pEGFP-N1 载体。
    2. 在另一支新的 1.5 mL 离心管中加入 24 µL 最低必需培养基，并加入 1 µL 聚乙烯亚胺（PEI；1 µg/µL）。通过移液器反复吹打至少 10 次充分混匀，室温孵育 5 分钟。
    3. 将 PEI 混合液转移至含有 DNA 混合液的 1.5 mL 离心管中，逐滴吹打混匀至少 10 次。将 DNA:PEI 混合物在室温下孵育 10 分钟。
    4. 弃去 96 孔盖玻片底板中的培养基，用 PBS 洗涤细胞 3 次。使用移液器将 DNA:PEI 混合液逐滴轻柔加入细胞中，并轻轻摇动培养板。将细胞置于含 5% CO2 的环境中 37 °C 孵育 3 小时。
    5. 孵育结束后，向每孔加入 200 µL 新鲜的最低必需培养基，轻柔摇动培养板，继续在含 5% CO2 的环境中 37 °C 孵育 24 小时。
      注意：PEI 具有细胞毒性，因此建议转染后孵育时间不超过 24 小时。
    6. 次日，弃去培养基，用 PBS 洗涤细胞 2 次。向细胞中加入含 500 µg/mL 遗传霉素（G418）和 1 µg/µL 多西环素的完全 DMEM 培养基，孵育 24 小时。
  3. 共聚焦显微镜样品的固定
    1. 固定所有样品时，用 1× PBS 洗涤细胞 3 次，每孔加入 100 µL 4% 多聚甲醛，室温孵育 10 分钟。
    2. 用 PBS 洗涤细胞 3 次。洗涤完成后，向每孔加入 1 µg/mL 的 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），避光室温孵育 15 分钟。
    3. 孵育结束后，用 PBS 洗涤细胞 3 次。在共聚焦显微镜下观察 GFP 表达情况及 DAPI 染色结果。

8. 通过共聚焦显微镜获取转染细胞并进行定量分析

  1. 使用吸水纸清洁孔板底部盖玻片。打开共聚焦激光扫描显微镜的控制开关，随后打开压缩机和汞灯。
  2. 操作仪器时，必须依次打开显微镜控制装置、扫描头控制、激光钥匙、激光模块、光源、显微镜控制器和中央处理器（CPU）。
  3. 在计算机上打开软件（材料表），点击启用 XY 载物台控制。弹出窗口将询问是否执行7S3的清洁程序，点击否。关闭实时图像窗口并调整设置界面。
  4. 在60倍物镜上滴加一滴浸油，将96孔板底部带盖玻片的培养板放置于载物台上，并在X-Y平面移动载物台以调整物镜对准孔位。点击目镜，选择Alexa-488通道。点击关闭快门，通过目镜聚焦细胞。使用粗调和微调旋钮调节目镜焦距。
  5. 点击显微镜控制盒上的打开快门，移动物镜以调整其位置，利用微分干涉差（DIC）模式观察目标区域的细胞。在显微镜控制盒上切换至EPI模式，使用Alexa-488波长滤光片观察GFP表达的细胞，此时细胞应呈现绿色。
  6. 点击关闭快门，进入LSM成像界面，将图像分辨率设置为1,024 × 1,024。点击添加相位，并拖动以添加绿色通道作为相位通道。
  7. 在Olympus程序中点击LSM，再点击实时按钮，以相位对比和Alexa 488 nm通道观察细胞。按住Control键并滚动鼠标滚轮，通过软件对焦以捕获图像。
  8. 调节增益和偏移量，以优化探测器捕获的荧光强度。点击捕获，为图像命名后点击保存。
  9. 在成像软件中点击文件，选择所有扩展名为.oir的图像，然后点击打开。
  10. 点击拼接视图以在所有通道中查看图像。如需为图像添加比例尺，点击视图，然后选择比例尺选项。
  11. 如需将单通道图像保存为16位灰度图像，请点击文件，选择导出图像。选择图像并在所有通道上勾选刻度标记。在“分割视图”选项的“选择帧”标签页中选择是。在“输出”标签页中，选择24位RGB颜色格式，并启用“burn-in info”选项，文件类型选择tiff。在导出文件夹中选择合适的保存路径，然后点击确定。
  12. 如需保存合并图像，请遵循相同步骤，但在“分割视图”选项中选择“否”，在“输出”标签页中选择合并通道并包含Burn-in信息。
  13. 为分析细胞中GFP的表达情况，在Windows系统中打开Fiji软件并导入tiff文件。选择绿色通道以分析GFP表达。
  14. 使用手绘工具选择细胞区域，点击分析以测量荧光强度。对3张图像重复此过程。
  15. 将数据导出至分析软件，并对定量数据进行统计学检验。

9. 寄生虫载量检测

  1. 在共聚焦显微镜下观察细胞时，计数单个巨噬细胞内存在的寄生虫总数。
  2. 随机检测100个巨噬细胞，并记录其胞内寄生虫的数量。对IMTI样本的感染组与不同时间点进行统计学检验，以分析SDHA表达对寄生虫数量的影响。

10. 通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）定量检测IL-10和IL-12

  1. 按照步骤 7.1 和 7.2 准备样品，并将培养基收集至 1.5 mL 离心管中。将样品置于冰上，或于 -20 °C 保存备用。根据试剂盒使用说明书操作，进行 IL-10 和 IL-12 的 ELISA 检测。

11. 使用定量实时逆转录PCR（qRT-PCR）进行细胞因子谱分析

  1. 按照步骤 7.1 和 7.2 准备样品。使用移液器弃去上清液，加入 500 µL TRIzol 试剂，在室温下孵育细胞 2 分钟。
    注意：为防止 RNase 污染，RNA 提取步骤应在超净工作台中进行。
  2. 将样品收集至 1.5 mL 离心管中，加入 100 µL 氯仿，通过反复倒置离心管 5–8 次进行混匀。在室温下孵育 15 分钟。在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 15 分钟。
  3. 将出现三层，收集清晰的上层水相至新的 1.5 mL 离心管中。向上层水相中加入 500 µL 异丙醇，反复倒置 10 次充分混匀，并在室温下孵育 15 分钟。每隔 5 分钟再次倒置混匀一次。
  4. 在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 15 分钟。弃去上清液，用含有 0.1% 焦碳酸二乙酯（DEPC）的 75% 乙醇洗涤沉淀 2 次，每次 5 分钟，并在 4 °C 条件下以 8,000 × g 离心。
    注意：含 DEPC 的水可降解 RNase，因此建议在 RNA 提取过程中使用。
  5. 最后，在室温下将沉淀空气干燥 5 分钟，用 20 µL 含 DEPC 的水溶解，使用分光光度计测定所提取 RNA 的浓度以及 260/280 和 260/230 比值。
    注意：260/280 比值应约为 2.0，通常表明 RNA 纯度较高；260/230 比值应在 2.0–2.2 之间，以表明所提取的 RNA 不含 TRIzol 等杂质化学物质。
  6. 为制备每份 20 µL 的 cDNA 样品，将试剂在冰上解冻，并在室温下短暂离心 15 秒。所有试剂及 RNA 样品在使用前均需短暂离心。
  7. 在已灭菌的 100 µL 离心管中，加入 0.8 µL 25× dNTP、2 µL 10× 引物、2 µL 10× 缓冲液。加入浓度为 1 µg/µL 的 RNA 及 0.5 µL 逆转录酶。用含 DEPC 的水定容至 20 µL。
  8. 将 cDNA 样品在室温下短暂离心 1 分钟。将样品置于冰上保存。
  9. 打开 PCR 仪，旋松顶部面板以松开固定架，将样品放置于加热模块上。放置完毕后，旋紧盖子。
  10. 系统启动后，点击 运行。选择 主菜单，进入程序菜单并选择 CDNA 选项。将样品体积设为 20 µL，点击 运行。PCR 仪将按四个步骤运行程序：第一步为 25 °C 持续 10 分钟，第二步为 37 °C 持续 2 小时，第三步为 85 °C 持续 5 分钟，最后一步为 4 °C 持续保持。
  11. 当循环进入第四步时，点击 确认 以结束循环。收集样品并进行 qRT-PCR 分析。RNA 样品应储存于 -80 °C，cDNA 样品应储存于 -20 °C。
  12. 为检测细胞因子，将所需的试剂（2× PCR 主混合液、cDNA 以及针对 TNF-α、IFN-γ、TGF-β 和 NFW 的探针）在冰上解冻。
    注意：所有试剂、反应混合物和样品均需保持在冰上。
  13. 在 100 µL 离心管中，通过加入 1 µL cDNA 和 3.5 µL NFW 制备 cDNA 样品。为制备主混合液，在 100 µL 离心管中取 5 µL 主混合液并加入 0.5 µL 探针。短暂离心混匀。根据样品数量和目标基因数量相应地计算并配制反应混合液。
    注意：将 NFW 和主混合液加至 100 µL 离心管底部。为确保准确加样并避免试剂交叉污染，将 cDNA 和探针加至离心管管壁。
  14. 将 8 孔条带置于 PCR 冷却器中。将含 5.5 µL 主混合液和探针的混合液转移至 8 孔条带各孔底部。针对所有目标基因重复此步骤。
  15. 将 4.5 µL cDNA 与 NFW 的混合液转移至 8 孔条带各孔的管壁。针对所有样品重复此步骤。
  16. 用盖子密封条带，并短暂离心 10 秒以混匀孔内的基因与样品。将条带放入 qRT-PCR 仪的样品槽中，并关闭槽盖。
  17. 在桌面启动软件并以访客身份登录。屏幕将弹出提示窗口，点击 无需连接继续。
  18. 在设置菜单中，点击 高级设置。在实验属性中，在 实验名称 标签页中输入实验名称。在“您要设置何种类型的实验”选项中，选择 定量-相对 CT 法（ΔΔ CT）。
  19. 在“您希望仪器使用何种升降温速率？”标签页中，点击 快速（约 40 分钟完成一次运行）。在板设置菜单中，在“定义目标”选项中输入基因名称，在“定义样品”中输入样品名称。
  20. 在运行方法标签页中，将每孔反应体积设为 10 µL。在初始孵育阶段前点击 添加阶段，并选择 孵育阶段。将温度设为 50 °C，时间设为 2 分钟。第二个孵育阶段无需更改，保持为 95 °C 持续 1 秒。
  21. 在循环阶段的第一步中，将温度设为 95 °C，时间设为 3 秒。第二步中，将温度设为 60 °C，时间设为 30 秒。点击 运行 以启动 qRT-PCR 循环。

12. 统计分析

注意：对于所有数据，均值以条形表示，标准差以条形图中的误差线表示（p 值< 0.05 被认为具有显著性）。

  1. 打开数据分析软件，并导入共聚焦实验获得的数据。
  2. 进行共聚焦显微镜分析时，采用普通单因素方差分析（One-way ANOVA），并使用Tukey校正法进行多组间比较，以分析GFP表达水平。将p < 0.05的数据视为具有统计学显著性。绘制数据的图形表示，其中均值以柱状图表示，标准差以误差线表示。
  3. 进行寄生虫载量检测时，新建一个工作表，输入100个巨噬细胞中的寄生虫计数数据。在所有样本之间应用普通单因素方差分析（One-way ANOVA）并结合Tukey校正法进行多重比较。将p值< 0.05视为具有统计学显著性。
  4. 对于ELISA实验，采用双因素方差分析（Two-way ANOVA），并进行Tukey多重比较检验；对于qRT-PCR实验，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）并结合Tukey校正检验。

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结果

合成回路中遗传元件的排列方式以及该合成回路的表达结构如（图1A）所示。相应的元件以正交且模块化的方式克隆至pEGFP-N1载体中，如图1B所示。对合成回路的模拟结果显示，SDHA和四环素阻遏蛋白（TetR）均呈现振荡动力学行为。该结果提示二者存在一种以周期性波动函数为特征的相互表达模式。SDHA浓度的升高可能归因于多西环素的诱导作用，而TetR的表达则可能源于多西环素浓度的下降（图1C）。鉴于在in silico模拟中观察到SDHA与TetR的可诱导振荡表达，本研究设计并实施了通过pEGFP-N1质粒载体递送该合成回路的策略。

本研究中鉴定的 iGEM 部件包括：TetO 对应 BBa_K1493803，Kozak 序列对应 BBa_K4344028，TetR 对应 BBa_C0040，P2A 对应 BBa_K1537016。SDHA 的 NCBI 登录号为 NM_025848。这些元件...

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讨论

所得结果凸显了该流程的高效性，该流程已专门用于合成回路的设计与构建。该合成回路的构建是朝向开发针对利什曼病等传染性疾病的精准医疗迈出的重要一步。通过in silico方式组装基因元件并进行确定性模拟，监测到了TetON系统显著的调控效应。值得注意的是，该回路可能导致TetR与SDHA/GFP的相互双稳态表达。SDHA的表达呈周期性，这可能表明其表达水平仅在存在多西环素时才会升高。为观察一段时间内表达模式的潜在变化，选取了100个时间单位。结果表明，该合成回路在TetR和SDHA/GFP上表现出周期性行为，这很可能归因于其正交特性21。来自iGEM元件库的基因元件组装起到了关键作用，因其提供了构建合成回路所必需的遗传组分22。基因元件的模块化排列至关重要，因为回路的翻译与功能可能受到影响，进而导致细胞中表达效率降低及调控效果不佳23。

合成回路的插入片段大小约为 1.3 kb，以确保载体总大小不会过大，从而避免可能降低转化效...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢浦那生物技术研究与创新委员会-国家细胞科学中心（BRIC-NCCS）主任对本研究以及BRIC-NCCS生物信息学平台的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 μL 吸头Tarson521050
10X 限制性酶切缓冲液BioLabsR0146S限制性酶切
1mL 吸头Tarson521016
1mL 离心管Eppendorf30121023
200 μL 吸头Tarson521010
25cm² 培养瓶Corning430639用于细胞培养
4',6-二脒基-2-苯基吲哚ThermoFischer ScientificD1306细胞核染色
50mL 离心管Corning352070
60mm 培养皿Falcon353002
6X TrackIt 青色/橙色上样缓冲液ThermoFischer Scientific10488085用于琼脂糖凝胶电泳上样
96 孔玻底培养板ThermoFischer Scientific160376用于共聚焦成像和转染
96 孔平底微量检测板Tarson941196
琼脂糖SigmaA9539用于琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳装置GeNei93用于琼脂糖凝胶电泳
细菌用层流洁净台ESCO Lifesciences2120765用于转化实验
氯化钙MerckC4901缓冲液/试剂配制
细胞培养用层流洁净台ThermoFischer Scientific1323TS用于细胞培养
细胞刮刀Genetix90020用于细胞培养
涂布棒Fischer Scientific12822775
适用于 1.5mL 离心管的离心机EppendorfEP5404000537
适用于 50mL 离心管的离心机ThermoFischer Scientific75004210
氯仿Fischer Scientific67-66-3用于 RNA 提取
CO₂ 培养箱ThermoFischer Scientific3110用于细胞培养
比色皿Eppendorf6138000018质粒浓度测定
CYTIVA IQ 500 凝胶成像系统Cytiva29655893用于琼脂糖凝胶电泳
DEPC 处理水 1000 mLThermoFischer Scientific750023用于 RNA 提取
多西环素Merck33429用于转染细胞的诱导表达
干式加热块Labnet用于转化及限制性内切酶失活
杜尔贝科改良伊格尔培养基国家细胞科学中心用于细胞培养
乙醇Sigma-Aldrich1.00983缓冲液/试剂配制
溴化乙锭SigmaE7637用于琼脂糖凝胶电泳
乙二胺四乙酸Fischer Scientific12635缓冲液/试剂配制
Evos 明场显微镜ThermoFischer ScientificAMEX1000
ExPasyhttps://web.expasy.org/translate/用于合成回路构建
胎牛血清Gibco16000-044用于细胞培养
FV31S-SW 软件Olypmus图像采集
遗传霉素Gibco1563411用于转染
克隆用 Gibson 组装法BIOMATIK合成回路构建
Graphpad PrismGraphpad统计分析
高容量 cDNA 反转录试剂盒ThermoFischer Scientific4368814用于 cDNA 合成
异丙醇Fischer Scientific13825缓冲液/试剂配制
卡那霉素Sigma60615用于转化及菌落筛选
LB 培养基HimediaM1245用于培养 E.coli
氯化镁Fischer ScientificBP214缓冲液/试剂配制
Micro Filt 垂直层流洁净台Microfilt
MicroAmp 快速 8 管条，0.1 mLThermoFischer Scientific4358293用于 qRT-PCR
MicroAmp 光学 8 孔盖条ThermoFischer Scientific4323032用于 qRT-PCR
微波炉LGMC-7649DW用于琼脂糖凝胶电泳
Mm00434228_m1 (IFN-γ)ThermoFischer Scientific4331182TaqMan 探针
Mm00443258_m1 (TNF)ThermoFischer Scientific4331182TaqMan 探针
Mm01321739_m1(TGFB)ThermoFischer Scientific4331182TaqMan 探针
小鼠 IL-10 ELISA 试剂盒ThermoFischer ScientificBMS614用于 ELISA
小鼠 IL-12 ELISA 试剂盒ThermoFischer ScientificBMS616用于 ELISA
Multiskan Sky 触摸屏酶标仪 + μDrop 板ThermoFischer Scientific51119600DP用于 ELISA
MX-M 微孔板混匀器，96 孔细胞培养板混匀器，转速可调 0-1500 rpm，实验室摇床振荡器DIAB
国家生物技术信息中心https://www.ncbi.nlm.nih.gov用于合成回路构建
血细胞计数板（Neubauer 计数室）Marienfeld superior640010用于细胞计数
无通气口 25cm2 培养瓶Corning353014用于寄生虫培养
NotIBioLabsR3189M限制性内切酶
无核酸酶水Biodesign1QIA试剂配制
Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 软件Olypmus图像处理
Olympus FV 3000Olympus用于共聚焦成像
OPTI-MEM 培养基Gibco31985070转染用培养基
携带合成回路的 pEGFP-N1 载体（已克隆）Biomatik
青霉素ThermoFischer Scientific15070063用于细胞培养
聚乙烯亚胺MERCK764965用于转染
乙酸钾Fischer ScientificYBP364500缓冲液/试剂配制
氯化钾Fischer ScientificBP366缓冲液/试剂配制
磷酸二氢钾SigmaP5655缓冲液/试剂配制
电源装置BIORAD1645070用于琼脂糖凝胶电泳
标准生物元件注册库https://parts.igem.org/Main_Page用于合成回路构建
RNAiso PlusTakara38220090用于 RNA 提取
RNase AThermoFischer Scientific12091021缓冲液/试剂配制
罗斯韦尔帕克纪念研究所培养基国家细胞科学中心用于寄生虫培养
摇床培养箱REMICIS 24 plus用于培养 E.coli
氯化钠QualigensQ27605缓冲液/试剂配制
十二烷基硫酸钠Sigma-AldrichL3771缓冲液/试剂配制
氢氧化钠Fischer Scientific15895缓冲液/试剂配制
磷酸氢二钠SigmaS5136缓冲液/试剂配制
分光光度计Eppendorf质粒浓度测定
Spin winTrason1020
StepOne Plus 实时荧光定量 PCR 系统Life technologies272006777用于 qRT-PCR
StepOne 软件版本 2.3Life technologies用于 qRT-PCR
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X)，不含 AmpErase UNGThermoFischer Scientific4366072
Tinker Cell合成回路构建与模拟
TrackIt 1 Kb Plus DNA 标准分子量标记ThermoFischer Scientific10488085用于琼脂糖凝胶电泳
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐HimediaMB029缓冲液/试剂配制
Tris-乙酸-EDTA 缓冲液SERVA42549.1缓冲液/试剂配制
台盼蓝SigmaT8154用于细胞计数
XhoIBioLabsR0146S限制性内切酶

参考文献

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