本文介绍了一组用于测量嗅闻酒精饮料对芥末引起的刺痛感抑制能力的方法。
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摘要
摘要
常用于食品制备的市售芥末酱含有化学感应类异硫氰酸酯（ITCs）的同系化合物，食用后会引发刺激感。目前尚未有研究探讨嗅闻含酒精饮料对芥末辛辣感的影响。尽管大多数感官评价研究分别针对单一食物或饮料进行，但关于食用芥末时同时嗅闻烈酒的嗅觉效应研究仍属空白。本文建立了一种结合动物行为学实验与卷积神经网络的方法，用于分析小鼠在同时嗅闻酒精饮料并摄入芥末时的面部表情。结果表明，经过训练和验证的深度学习模型能够在无需预先筛选训练材料的情况下，识别出29%属于“芥末阴性-酒精阳性”类别的共处理图像。对所选视频帧图像提取的小鼠面部疼痛评分进行统计分析，结果显示有无酒精存在时差异显著（P < 0.01）。该发现提示膳食性酒精饮料可能减弱小鼠对芥末引发的反应。这种联合方法在未来具有用于单个ITC化合物筛选及烈酒成分感官分析的潜力。然而，仍需进一步研究以阐明酒精抑制芥末辛辣感的潜在机制。
引言
山葵（Wasabia japonica）俗称芥末，在食品加工中已广为人知1,2。食用后引起的强烈感官反应，如流泪、打喷嚏或咳嗽，是其广为人知的特点。山葵独特的辛辣味源于一类与化学感受异硫氰酸酯（ITCs）同源的化合物。这些化合物属于挥发性有机硫植物化学物质，可分为ω-烯基和ω-甲硫基烷基异硫氰酸酯3。在这些化合物中，烯丙基异硫氰酸酯（AITC）是十字花科植物（如辣根和芥菜）中最主要的天然ITC产物4。市售山葵酱通常由辣根制成，因此AITC被用作这些商业化产品质控的化学标志物5。
将含酒精饮料与芥末调味菜肴搭配食用可被视为一种文化习惯的体现6。主观上，这种组合可能增强芥末与酒类之间的辛辣感和热感，从而提升整体的饮食体验。动物定性行为评估（QBA）是一种全面的全动物方法学，通过数值术语来考察受试动物在短期或长期外界刺激下的行为变化7。该方法包括疼痛测试、运动功能测试、学习与记忆测试，以及专为啮齿类动物模型设计的情绪测试8。然而，迄今为止，关于味觉与嗅觉协同感官评价的研究在文献中仍十分有限9,10。大多数关于化学感觉的研究仍局限于单独考察单一食物或饮料的摄入过程11。因此，针对食用芥末时嗅闻烈酒这一行为所涉及的味觉-嗅觉相互作用，目前尚缺乏相关研究。
由于芥末引起的刺痛感被认为是一种伤害性感受12，动物行为学评估非常适合用于评价啮齿类动物的伤害性感觉反应8,13,14。Langford 等人开发了一种用于评估小鼠伤害性感受的方法，称为小鼠面部表情评分法（mouse grimace scale, MGS）15,16。这种行为学研究方法是一种与疼痛相关的评估手段，依赖于对实验小鼠面部表情的分析。实验装置简单，仅需一个透明笼子和两台用于视频录制的摄像机。通过结合先进的技术17,18,19实现自动数据采集，可以获得定量和定性的行为学指标，从而在行为监测过程中提升动物福利20。因此，MGS 有望被应用于以连续且自由接触（ad libitum）的方式研究各种外界刺激对动物的影响。然而，评分过程仅涉及由评审人员从视频中选取少量（少于10帧）图像进行评估，且需要事先培训。对大量样本图像进行评分可能非常耗时。为克服这一耗时难题，已有若干研究采用机器学习技术来预测 MGS 评分21,22。但需要注意的是，MGS 是一种连续性测量指标。因此，对于判断“同时摄入芥末并嗅闻烈酒的小鼠图像是否类似于正常小鼠”这类具有逻辑性和分类性的问题，采用多分类分类模型将更为合适。
本研究提出了一种用于探究小鼠味觉与嗅觉相互作用的方法。该方法结合动物行为学研究与卷积神经网络（CNN），以分析小鼠的面部表情。在特制的实验笼中，对两只小鼠分别在正常行为状态、芥末诱导的伤害性感受状态以及嗅闻酒类气味状态下各进行了三次观察。记录小鼠的面部表情视频，并将生成的帧图像用于优化深度学习（DL）模型的架构。随后，利用独立的图像数据集对该模型进行验证，并将其应用于对实验组获取图像的分类。为了确定小鼠在摄入芥末的同时嗅闻酒类气味时芥末辛辣感被抑制的程度，进一步通过另一种数据分析方法——MGS评分法16——与人工智能提供的分析结果进行交叉验证。
方案
本研究使用了两只7周龄、体重在17-25 g之间的ICR雄性小鼠进行动物行为学评估。所有饲养和实验程序均经香港浸会大学教学与科研中人类和动物使用委员会批准。动物房环境温度维持在25 °C，相对湿度保持在40%-70%，并采用12小时光照-黑暗循环。
1. 笼具设计
- 准备三种不同尺寸的丙烯腈-丁二烯-苯乙烯（ABS）积木用于笼子构建：8 mm × 8 mm × 2 mm、16 mm × 16 mm × 6 mm 和 32 mm × 16 mm × 6 mm。
- 准备一块丙烯腈-丁二烯-苯乙烯（ABS）板（312 mm × 147 mm × 2 mm）作为笼子底座。
- 准备一块尺寸为 239 mm × 107 mm、厚度为 2 mm 的不透明亚克力板，用作底板。
- 准备一块尺寸为 239 mm × 107 mm、厚度为 5 mm 的透明亚克力板，用作顶板。
- 准备一块尺寸为 107 mm × 50 mm、厚度为 7 mm 的透明亚克力板，用作端板。
- 通过堆叠积木构建两个不透明的侧墙，高度为 54 mm。
- 将亚克力板嵌入基于丙烯腈-丁二烯-苯乙烯（ABS）的笼体中，如图 1A所示。
- 准备一个饲料室，由五块尺寸为 90 mm × 50 mm、厚度为 2 mm 的透明亚克力板构成，如图 1B所示。在这五块透明亚克力板中，两块用作侧板，一块用作顶板，一块用作底板，一块用作端板。
- 准备一块尺寸为 60 mm × 50 mm × 2 mm 的透明亚克力板作为饲料引入板，并将其放置在饲料室内。
2. 动物行为学评估
- 将2只7周龄的ICR雄性小鼠同窝饲养于普通笼具中。
- 为2只小鼠的同窝幼鼠提供颗粒饲料和自来水，任其自由取食，适应1周时间。
- 1 周后，将 2 只小鼠的同窝仔鼠与一瓶乙醇（约 40% v/v）一起引入。
注意：确保他们仅被允许嗅闻或吸入所提供的水性乙醇 随意摄取 在限制饮水的情况下进行基础代谢测定。 - 使用9-10周龄小鼠模型和图示的透明立方体笼进行行为学实验 图1A.
- 拆卸所有亚克力板和丙烯腈-丁二烯-苯乙烯板，并彻底清洁。首先用超纯水冲洗至少3次，然后用纸巾擦干。接着喷洒75%乙醇，再用镜头纸擦拭清洁。最后静置空气中干燥至少15分钟。
- 称量小鼠体重，并在每次行为学实验重复前记录其体重。
- 称取1 g市售芥末和4.5 g花生酱，放入密封塑料袋中，新鲜配制混合物。
注意：由于芥末中的异硫氰酸酯具有挥发性，因此需将市售芥末储存在 -20 °C 冰箱中。 - 称取并提供两份各0.5 g的花生酱，或在饲料引入板上提供芥末与花生酱的混合物，如图所示 图1B，C.
- 将准备好的饲料引入板放置在幼崽饲养箱内，如图所示 图1B，C，以使这两只小鼠能够 随意摄取 每次视频录制期间的食物获取
- 在下方凹槽中加入 30 mL 液体（纯水或酒类液体，约 42% v/v 乙醇），以促进同步吸入，如图所示。 图1B，C.
- 使用放置在两端手机支架上的两部智能手机，开始录像。
注意：视频规格如下：帧宽度 1920；帧高度 1080；码率 20745 kbps；帧率 30.00 帧每秒（fps）。 - 将2只经过训练的同窝小鼠从上方小心放入指定的动物行为学研究平台，并立即用顶板固定笼具。
注意：确保此步骤在 15 秒内完成。 - 每个视频录制2-3分钟。
注意：确保整个实验过程，从花生酱-芥末混合物的制备到视频录制完成，总时长不超过5分钟。 - 重复整个实验3次。
注意：确保每次实验重复之间至少间隔6小时。 - 模拟不同场景。
注意：例如，在本研究中，采用上述实验设置模拟了4种不同情景，每种情景使用一对小鼠，共分为4组。这些情景包括情景A（背景研究）、情景B（阳性对照研究）、情景C（芥末-酒精味觉-嗅觉相互作用研究）和情景D（阴性对照研究）。 表1 对这些情景进行了总结。
3. 图像识别
与许多图像处理研究类似23,24,25，通过训练卷积神经网络（CNN）获得了分类模型。深度学习操作的脚本使用 Python v.3.10 在 Jupyter Notebook（anaconda3）中编写，可在以下 GitHub 仓库获取：git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git。为构建和训练 CNN，使用了多个开源库，包括 numpy v.1.21.5、seaborn v.0.11.2、matplotlib v.3.5.2、cv2 v.4.6.0、sklearn v.1.0.2、tensorflow v.2.11.0 和 keras v.2.11.0。这些库提供了开发和训练用于图像识别的卷积神经网络所必需的工具和功能。
- 使用提供的 Jupyter Notebook（名为 Step1_ExtractingAndSavingVideoFrameImages.ipynb）从采集的视频片段中导出一系列视频帧图像，以生成用于模型训练的数据集。
- 仅选择至少有一只小鼠在摄食所提供糊状物的图像。所选图像的示例如下：补充图1、补充图2、补充图3、补充图4、补充图5、补充图6 和 补充图7。
- 通过执行 Jupyter Notebook 中提供的脚本（名为 Step2_DataAugmentation.ipynb），对生成的图像进行水平翻转以实现数据增强。
- 保留每次实验的第二次重复所获得的图像数据，用于外部独立的 CNN 模型验证；使用每次实验的第一和第三次重复的图像数据进行内部模型训练与测试。
- 运行 Jupyter Notebook 中名为 Step3_CNNmodeling_TrainTest.ipynb 的脚本，对用于 CNN 建模的图像数据进行预处理，包括图像缩放、黑色背景转换以及图像信号归一化。
- 将训练数据以 8:2 的比例随机划分为内部训练集和测试集。
- 初始化 CNN 网络结构，并根据需检测的场景数量设计 CNN 的输出类别数。
注：例如，在本研究中，神经网络被设定为分类 3 个类别。请确保已编译用于处理类别权重不平衡问题的脚本。 - 寻找在内部测试样本上产生最小损失的超参数组合，用于 CNN 构建。
- 采用最优的超参数组合来构建 CNN 网络结构。
- 打开提供的 Jupyter Notebook 文件 Step4_CNNmodel_ExternalValOriginal.ipynb 和 Step5_CNNmodel_ExternalValFlipped.ipynb，利用动物行为实验第二次重复中获得的独立图像（原始及翻转图像）对所获得的模型进行验证。
- 部署经过验证的模型，使用 Jupyter Notebook Step6_CNNmodel_Application.ipynb 对实验组生成的视频帧图像进行分类。
注：例如，在本研究中为情景 C。
4. 小鼠面部表情量表人工评分
注意：为了验证卷积神经网络（CNN）模型预测所提供的结果，还应用了 Langford 等人先前开发并验证的另一种方法16。该方法基于5种特定的小鼠面部动作单元（AUs）对小鼠面部表情评分（MGS）进行评分：眼眶收缩、鼻部隆起、颊部隆起、耳朵外展收缩以及胡须变化。每种动作单元根据其缺失、中等程度出现或明显出现分别赋予0、1或2分。该评分系统可对每种动作单元进行量化和分级，以评估小鼠所经历的伤害性感受或不适程度。
- 为每个视频片段捕获同一窝幼鼠摄取膏状物的 3 帧视频图像。确保每帧之间至少间隔 3 秒。
- 使用提供的名为 "shuffleSlides.pptm" 的模板文件（补充文件 1），运行其中嵌入的宏代码，对来自不同情景类别的图像进行盲法编码并随机重新排序。
- 邀请至少 10 名评估人员对样本图像进行评分。
- 培训评估人员使用 MGS 对图像样本进行评分。向评估人员提供培训材料，包括关于 MGS 的原始文献及其操作手册15,16。
- 通过计算相应 5 个面部动作单元（AUs）评分点的平均值，得出每只实验动物在捕获帧中的 MGS 评分。以均值 ± 测量标准误（SEM）的形式呈现 MGS 评分。
- 采用单因素方差分析（ANOVA）结合 Bonferroni 多重比较事后检验，判断不同情景类别之间是否存在统计学显著差异。
注意：当 P < 0.05 时，认为差异具有统计学显著性。
结果
本研究的主要目标是建立一个用于探究小鼠味觉与嗅觉相互作用的稳健框架。该框架结合人工智能和定性行为评估（QBA），以构建预测性分类模型。此外，通过定量小鼠面部表情评分（MGS）进行内部独立分析，对深度学习（DL）所得结果进行交叉验证。该方法的主要应用是考察小鼠嗅闻饮食性酒精饮料时，芥末诱发的伤害性感受被抑制的程度。
深度学习模型对芥末阴性-酒精阳性组中29%的芥末-酒精联合处理图像的识别
食用市售芥末酱后，人类可能会出现面部过度反应。小鼠中也可能观察到类似现象（补充视频 1）。由于伤害性感觉与啮齿类动物的面部表情高度相关，本研究通过监测2只同窝幼鼠的行为，以确定其在摄食含有或不含市售山葵的饲料时的反应。本研究中，采用深度学习技术训练了一个卷积神经网络（CNN）。由于每种实验条件均设置了3个重复，因此从3次重复实验中获取的图像资料用于后续分析。st 和 3rd 用于CNN模型超参数调优以及模型内部训练与测试的重复实验。本研究中CNN架构的演变过程详见于 表2优化后的卷积神经网络架构包括一个分辨率为268 x 268像素的输入层，随后是4个二维卷积层，每个卷积层包含8个滤波器。此外，该架构还包含2个池化层、2个Dropout层、1个展平层以及2个全连接层，用于完成三分类任务。参见 补充文件 2 用于卷积神经网络架构。
本研究中的模型使用包含 35,486 张图像的数据集进行训练，并在 7 个训练周期中对 8,872 张图像进行测试。训练过程中模型在内部训练集和测试集上的表现，包括损失值、精确率-召回率比率、精确率以及敏感性（或称召回率）等指标，如图所示。 补充图 8A-D该模型在内部训练集和测试集上的准确率、精确率和灵敏度均为1，表明模型的预测结果与内部训练集和测试集中图像的实际类别完全一致。模型训练完成后，来自第2组的图像nd 使用重复实验以确保并独立验证所获得的卷积神经网络（CNN）模型不存在过拟合问题。该模型在背景研究（情景A，4,820张图像）、阳性对照研究（情景B，3,900张图像）以及阴性对照研究（情景D，2,731张图像）中，准确率、精确率和灵敏度均达到1，表现出优异的预测稳健性。所建立的预测模型被用于对小鼠嗅闻白酒并摄食含芥末的花生酱视频帧图像（情景C）进行分类，归入不同的研究情景，即情景A、B和D。结果显示，0%和29%的图像分别被归类为背景研究类别（情景A，存在纯水和不含芥末的花生酱）和阴性对照研究类别（情景D，存在中国白酒和不含芥末的花生酱），而71%的图像被分类为阳性对照组类别（情景C，存在纯水和芥末-花生酱混合物）。这些发现表明，饮食中摄入白酒可能减轻小鼠由芥末引发的伤害性感受。为评估机器从所提供训练材料中学到的内容，生成了每个卷积层的特征图。如图所示 补充图 9A-D观察发现，机器的注意力集中在多种面部特征上，如眼眶、鼻部、脸颊和面部边缘、耳朵，以及胡须的接触面。基于这些观察结果，采用了另一种数据分析方法——MGS。MGS专注于小鼠面部动作单元（AUs），可对呈现酒精饮料对芥末油诱导的伤害性感受的抑制能力进行统计评估和进一步验证。
手动小鼠面部表情评分在统计学上验证了机器学习预测结果。
通过MGS评分评估芥末油诱发的伤害性反应强度，该评分范围为0到2分，其中0分表示反应最轻微，2分表示反应最严重。本研究中，24只小鼠的MGS评分（即在选定的12张图像中每张包含2只小鼠） 补充图10，补充图11，补充图12，补充图13 由22名经过培训的评估人员进行评估（结果未显示）。对2只小鼠的同窝仔鼠进行分析，每组实验设三个重复，结果显示批内精密度和批间精密度的相对标准偏差分别在0%–25%和9%–33%之间。这表明MGS评分过程具有良好的精密度和一致性。给予花生酱糊的小鼠其MGS评分与对照组相比显示出显著差异。图 3A，0.73 ± 0.04）以及提供芥末与花生酱混合物的组别（图3B，1.59 ± 0.11）。这验证了动物行为学实验装置的合理性，并证实了山葵在诱导伤害性反应方面的有效性。尽管来自下方所含酒精饮料（约42% v/v乙醇）释放的酒精蒸气可能具有刺激性，但MGS评分（图3D，0.86 ± 0.16）与对照组相比无显著差异图 3A，0.73 ± 0.04）。然而，在提供芥末-花生酱混合物的小鼠的MGS评分之间观察到显著差异（图3B，1.59 ± 0.11）以及在食用山葵期间暴露于酒精蒸气的个体（图3C，0.95 ± 0.07）与一个 P 值 <0.05。这些结果提示，山葵与酒精饮料共同使用时，可能会减弱山葵引起的刺激感，这与人工智能的观点一致。有必要进一步研究所提供的中国白酒中抑制山葵辛辣感的有效成分，这种作用很可能归因于乙醇的存在。
已有可用代码的示例。与本次投稿相关的所有图像识别代码均可在公共 GitHub 仓库获取：git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git。任何更新也将在该 GitHub 仓库中发布，并引用本研究的最终 DOI。
图1疼痛相关动物行为学研究的实验装置。 (A使用放置在两端手机支架上的两部智能手机的摄像头录制两只小鼠面部表情的完整设置。B) 用于向2只小鼠提供两份各0.5 g花生酱或山葵与花生酱混合物的饲食室 随意 基础，并在糊剂下方的凹槽中加入30 mL液体（水或约42% v/v的酒类溶液），以同时进行吸入。C仔细观察装有30 mL液体并含有2份山葵-花生酱混合物的凹槽。该混合物由1 g市售山葵与4.5 g花生酱混合制备而成。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 2：卷积神经网络模型的架构及其输入与输出。 训练过程中使用了来自3种不同场景的图像，包括用于背景研究的场景A、用于阳性对照研究的场景B，以及用于阴性对照研究的场景D。在模型训练完成后，来自芥末-酒精味觉-嗅觉交互研究的场景C图像被分类为场景A、B或D。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：食用不同饲料的小鼠面部表情评分（MGS）。 MGS评分为0至2分，0分表示最轻微，2分表示最严重。参考的MGS评分标准改编自Langford等（2010）16。提供以下饲料的小鼠面部表情评分为：（A）供取食的花生酱，评分为0.73 ± 0.04；（B）供摄入的芥末-花生酱混合物（1 g市售芥末与4.5 g花生酱混合），评分为1.59 ± 0.11；（C）供摄入的芥末-花生酱混合物，同时从下方提供含酒精液体（约42% v/v酒精）供吸入，评分为0.95 ± 0.07；（D）供取食的花生酱，同时从下方提供含酒精液体供吸入，评分为0.86 ± 0.16。*，P < 0.05；**，P < 0.01；ns，在95%置信区间下，经单因素方差分析及Bonferroni多重比较事后检验，无显著差异。误差线表示测量值的标准误（SEM）。每种情况下对2只小鼠进行了三次重复测量。请点击此处查看此图的高清版本。
表1：动物行为评估中模拟的四种情景的总结。备注：a 混合物由1 g市售芥末与4.5 g花生酱混合制成。b 中国白酒，酒精含量约为42%（v/v）。请点击此处下载该表格。
表2：模型性能汇总。 批量大小为64、滤波器数量为1的超参数st 不带后续 dropout 的 8 个滤波器的二维卷积层，滤波器数量为 2nd 8个滤波器的二维卷积层，滤波器数量为3rd 8个滤波器的二维卷积层，dropout为0.1，第4个滤波器数量th 2D卷积层的卷积核数量为8，全连接层的滤波器数量为64，dropout值为0.5时，在内部划分测试集上获得了最低的损失值。这些超参数随后被用于训练一个三分类（情景A、B和D）模型，以预测情景C的图像。情景A用于背景研究，情景B用于阳性对照研究，情景D用于阴性对照研究，情景C用于芥末-酒精味觉-嗅觉相互作用研究。 请点击此处下载此表格。
补充图1：场景A类别深度学习的示例训练材料（背景研究）。 请点击此处下载该文件。
补充图2：情景B类别深度学习的示例训练材料（阳性对照研究）。 请点击此处下载该文件。
补充图3：深度学习场景D类（阴性对照研究）的示例训练材料。 请点击此处下载该文件。
补充图4：模型验证中情景A类（背景研究）的预测结果及独立材料示例。 请点击此处下载该文件。
补充图5：模型验证中情景B类（阳性对照研究）的预测结果及独立材料示例。 请点击此处下载该文件。
补充图6：模型验证中D类情景（阴性对照研究）的预测结果及独立样本示例。 请点击此处下载该文件。
补充图7：模型应用中C类场景（山葵-酒精味觉-嗅觉相互作用研究）的预测结果及示例材料。 请点击此处下载该文件。
补充图8：最优深度学习模型的预测性能。（A）7个训练周期中的训练损失与内部验证损失；（B）精确率-召回率曲线，（C）精确率，以及（D）7个训练周期中训练集与内部验证集的召回率。请点击此处下载该文件。
补充图9：各卷积层的特征图。 情景A、B和D中（A）第一层、（B）第二层、（C）第三层以及（D）最后一层卷积层的特征图，从上到下按顺序排列。情景A用于背景研究，情景B用于阳性对照研究，情景D用于阴性对照研究。请点击此处下载该文件。
补充图10：情景A（背景研究）手动小鼠面部表情评分的选定图像。 请点击此处下载该文件。
补充图11：情景B（阳性对照研究）手动小鼠面部表情评分的选定图像。 请点击此处下载该文件。
补充图12：场景C（芥末-酒精味觉-嗅觉相互作用研究）手动小鼠面部表情评分所选图像。 请点击此处下载该文件。
补充图13：场景D（阴性对照研究）手动小鼠面部表情评分所选图像。 请点击此处下载该文件。
补充视频 1： 小鼠在摄入芥末后，有或没有提供下方酒精饮料时的面部痛苦表情。从 0 秒到 8 秒，视频片段展示了小鼠在食用花生酱时的正常面部表情。从 8 秒到 17 秒，展示了小鼠在摄入芥末后出现的痛苦表情，表现为眼眶紧缩、鼻部隆起、脸颊隆起、耳朵外展紧缩以及胡须形态改变。从 17 秒到 29 秒，显示当下方提供酒精饮料时，芥末引起的伤害性感受可被抑制。从 29 秒至视频结束，展示了上述不同情境下小鼠痛苦表情的集合。请注意，所提供的视频仅用于示意说明，其质量不同于文中所述用于图像识别与建模的质量要求。请点击此处下载该视频。
补充文件 1：shuffleSlides.pptm。补充的 Microsoft PowerPoint 启用宏的演示文稿，名为“shuffleSlides.pptm”。该文件用于小鼠面部表情评分盲法测试中的图像随机排序。请点击此处下载该文件
补充文件2：卷积神经网络架构。 请点击此处下载该文件。
讨论
本研究中提出的用于分析味觉-嗅觉相互作用的方法，基于 Langford 等人开发的小鼠疼痛面部表情行为编码原始方法16。近年来发表的多篇文献已将卷积神经网络（CNN）应用于小鼠面部的自动追踪及后续的 MGS 评分21,26,27,28。相较于仅使用原始方法，应用 CNN 具有优势，因其可生成一系列视频帧图像，用于训练预测模型。相比之下，原始方法需预先选择有限数量的图像用于 MGS 评分，这可能引入主观性和偏差。
在先前发表的基于卷积神经网络（CNN）的方法中，所有方法均是针对将致痛物质直接注入血液循环后评估动物痛苦或不适程度而开发的26,28。这种药物引入方式的一个缺点是，需要耗费大量精力筛选出未捕捉到小鼠面部侧面轮廓的视频帧图像。在本研究中，采用商业山葵作为引起伤害性感受的刺激物，并以自由摄取（ad libitum）的方式提供。除了能够掩盖其挥发性成分AITC外，花生酱还能有效吸引小鼠呈现出清晰的正脸姿态，从而便于在视频录制过程中获取其面部轮廓。此外，该方法避免了针头插入所可能带来的疼痛干扰。然而需要注意的是，小鼠摄食时的动作可能会干扰面部疼痛评分（MGS）中对鼻部隆起和颊部隆起的判断。为解决这一问题，必须通过向小鼠提供纯花生酱进行基线对照实验。
在某些基于卷积神经网络（CNN）的动物行为研究算法中，仅从训练图像中选择一部分小鼠面部动作单元进行编程捕获21,22。这些计算方法依赖于预先定义的、与伤害性感觉相关的特征，而可能忽略了个体小鼠特有的其他重要特征，从而导致信息丢失。相比之下，本研究采用了一种不同的方法，即使用完整的小鼠面部图像来训练CNN模型。这种基于图像仅使用（image-only usage, IOU）的方法已被证明在图像分类中更为高效25。因此，本研究提出的CNN建模方法类似于一些已有方法：首先使用整幅图像（无需区域标注）训练CNN模型，然后通过人工主观评估对模型进行验证27,29。该方法能够保留图像中更多的信息，并避免引入主观性。
然而，本研究实验设计的一个局限性在于，小鼠受试对象以每2只为一窝的群体方式饲养，而非单独饲养。这一决定是出于有意考虑，因为小鼠是社会性动物，通常在群体环境中表现更佳。一个有趣的发现是，在动物训练期间，3个笼子中仅有1个笼子内的2只同窝小鼠被成功训练为适应中国白酒的存在。因此，仅针对这2只同窝小鼠开展了三次重复实验。在用于卷积神经网络（CNN）建模的训练材料中，包含这2只同窝小鼠的单张图像也被视为一个独立样本，未进行任何分割处理。该方法使我们能够捕捉同窝小鼠之间的互动行为，并结合面部表情对其进行集体分析。
与基于图像的MGS评分方法类似，本研究提出的方法预计可推广应用于其他种类的动物，例如猫科动物和马30,31。通过应用所提出的方法，结合计算机视觉技术的诱导性食物喂养引入方法，可能成为促进动物行为研究的一种途径，尤其适用于研究多种动物中味觉与嗅觉的相互作用。
披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
Cai Z. 感谢郭钟宝芬慈善基金在设立郭一羽环境与生物分析讲席教授职位过程中提供的资金支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 无水乙醇（EtOH） | VWR Chemicals BDH | CAS# 64-17-5 | |
| 丙烯腈-丁二烯-苯乙烯塑料砖 | Jiahuifeng 旗舰店 | https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html | |
| 丙烯腈-丁二烯-苯乙烯塑料板 | Jiahuifeng 旗舰店 | https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html | |
| 烯丙基异硫氰酸酯（AITC） | Sigma-Aldrich | CAS# 57-06-7 | |
| 无水二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | CAS# 67-68-5 | |
| 中国白酒 | 洋河青瓷 | https://www.chinayanghe.com/article/45551.html | |
| 市售芥末 | S&B FOODS INC. | https://www.sbfoods-worldwide.com | |
| 甲酸（FA） | VWR Chemicals BDH | CAS# 64-18-6 | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | https://www.graphpad.com | |
| 高效液相色谱级乙腈（ACN） | VWR Chemicals BDH | CAS# 75-05-8 | |
| 高效液相色谱级甲醇（MeOH） | VWR Chemicals BDH | CAS# 67-56-1 | |
| Microsoft Excel 2016 | Microsoft | https://www.microsoft.com | |
| Microsoft PowerPoint 2016 | Microsoft | https://www.microsoft.com | |
| Milli-Q 超纯水系统 | Millipore | https://www.merckmillipore.com | |
| 小鼠：ICR | 实验动物服务中心（中国香港，香港中文大学） | N/A | |
| 花生酱 | Skippy | https://www.peanutbutter.com/peanut-butter/creamy | |
| Python v.3.10 | Python 软件基金会 | https://www.python.org | |
| 透明亚克力板 | 淘宝店铺 | https://item.taobao.com/item.htm?_u=32l3b7k63381&id=60996545797 0&spm=a1z09.2.0.0.77572e8dFPM EHU |
参考文献
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