动物行为评估与卷积神经网络相结合研究芥末-酒精味-嗅相互作用

摘要

本文介绍了一组测量嗅探酒精饮料对芥末引起的刺痛感的抑制能力的方法。

摘要

通常用于食品制备的商业芥末酱含有化学感应异硫氰酸酯 （ITC） 的同源化合物，食用后会引起刺激感。从未研究过闻膳食酒精饮料对芥末辣味的影响。虽然大多数感官评估研究分别关注个别食品和饮料，但缺乏关于在食用芥末时闻酒的嗅觉研究的研究。在这里，开发了一种方法，该方法结合了动物行为研究和卷积神经网络的使用，以分析小鼠在同时闻酒和食用芥末时的面部表情。结果表明，经过训练和验证的深度学习模型识别了 29% 的图像，这些图像描绘了属于芥末阴性酒类阳性组的芥末和酒精的共处理，而无需事先进行训练材料过滤。对从所选视频帧图像中获得的小鼠鬼脸量表评分的统计分析显示，有酒和无酒之间存在显着差异 （P < 0.01）。这一发现表明，膳食酒精饮料可能对小鼠芥末引发的反应的影响减弱。这种组合方法在未来具有用于单个 ITC 化合物筛选和烈酒成分感官分析的潜力。然而，需要进一步的研究来探讨酒精诱导抑制芥末辛辣味的潜在机制。

引言

Wasabia japonica，俗称 wasabi，在食品制备方面已获得认可 ^1,2。它在食用时会引发强烈的感官体验，其特征是流泪、打喷嚏或咳嗽，这是众所周知的。芥末的这种独特的辛辣味可归因于化学感应异硫氰酸酯 （ITC） 的同源化合物。它们是挥发性有机硫植物化学物质，可分为 ω-烯基和 ω-甲基硫代烷基异硫氰酸酯³。在这些化合物中，异硫氰酸烯丙酯 （AITC） 是十字花科植物（如辣根和芥末⁴）中发现的最主要的天然 ITC 产物。商业芥末酱通常由辣根制成，这使得 AITC 成为用于这些商业产品质量控制的化学标志物⁵。

将膳食酒精饮料与芥末菜肴搭配可以被认为是文化性格的一个例子⁶.主观上，这种组合可能会补充芥末和烈酒之间的辣味和热量，从而增强整体烹饪体验。动物定性行为评估 （QBA） 是一种全面的全动物方法，它使用数字术语⁷ 检查受试者对短期或长期外部刺激的反应行为变化。该方法包括疼痛测试、运动测试、学习和记忆测试，以及专为啮齿动物模型设计的情绪测试⁸。然而，直到现在，调查味觉与嗅觉的协同感官评估的研究在文献中仍然很少 ^9,10。大多数关于化学感觉的研究仅限于分别检查个人食物和饮料的消费¹¹。因此，缺乏关于味觉-嗅觉相互作用的研究，涉及在食用芥末时闻酒的行为。

由于芥末诱导的刺痛感被认为是伤害感受的一种形式¹²，因此动物行为评估非常适合评估啮齿动物的伤害感受反应 ^8,13,14。Langford 等人开发了一种评估小鼠伤害感受的方法，称为小鼠鬼脸量表 （MGS） 评分^15,16。这种行为研究方法是一种与疼痛相关的评估方法，依赖于对实验小鼠表现出的面部表情的分析。实验设置很简单，包括一个透明笼子和 2 个用于视频录制的摄像头。通过结合先进技术 17,18,19 进行自动数据捕获，可以获得定量和定性的行为测量，从而提高行为监测期间的动物福利 ²⁰。因此，MGS 有可能以不间断和随意的方式应用于研究各种外部刺激对动物的影响。但是，评分过程仅涉及选择少量（少于 10 个）视频帧图像供小组成员评估，并且需要事先进行培训。对大量样本图像进行评分可能是一项劳动密集型工作。为了克服这个耗时的挑战，一些研究采用了机器学习技术来预测 MGS 评分^21,22。然而，重要的是要注意 MGS 是一项持续的衡量标准。因此，多类分类模型更适合评估逻辑和分类问题，例如确定小鼠同时摄入芥末和嗅酒的图像是否与正常小鼠的图像相似。

在这项研究中，提出了一种研究小鼠味觉-嗅觉相互作用的方法。该方法将动物行为研究与卷积神经网络 （CNN） 相结合，以分析小鼠受试者的面部表情。在正常行为条件下，在芥末诱导的伤害感受期间以及在专门设计的笼子中嗅酒时，对两只小鼠进行了三次观察。对小鼠的面部表情进行视频记录，并利用生成的帧图像来优化深度学习 （DL） 模型的架构。然后使用独立的图像数据集对模型进行验证，并部署以对从实验组获取的图像进行分类。为了确定小鼠在食用芥末期间同时闻酒时芥末刺激性抑制的程度，人工智能提供的见解通过与另一种数据分析方法（MGS 评分¹⁶）的交叉验证进一步证实。

方案

在本研究中，两只体重在 17-25 g 之间的 7 周龄 ICR 雄性小鼠用于动物行为评估。所有房屋和实验程序均已获得香港浸会大学关于在教学和研究中使用人类和动物受试者的委员会的批准。在 12 小时的明暗循环中，动物室保持在 25 °C 的温度和 40%-70% 的室内湿度。

1. 保持架设计

1. 准备 3 种不同尺寸的丁苯乙烯砖用于笼式结构:8 mm x 8 mm x 2 mm、16 mm x 16 mm x 6 mm 和 32 mm x 16 mm x 6 mm。
2. 准备一个丙烯腈丁二烯苯乙烯板 （312 mm x 147 mm x 2 mm） 作为笼式底座。
3. 准备一块 239 毫米 x 107 毫米、厚度为 2 毫米的非透明亚克力板作为底板。
4. 准备一块 239 毫米 x 107 毫米、厚度为 5 毫米的透明亚克力板作为顶板。
5. 准备一块 107 mm x 50 mm 的厚度为 7 mm 的透明亚克力板作为接线板。
6. 通过将积木堆叠到 54 毫米的高度来构建 2 个不透明的侧墙。
7. 将丙烯酸板嵌入丙烯腈丁二烯苯乙烯基笼中，如图 1A 所示。
8. 准备一个由五个 90 毫米 x 50 毫米的透明丙烯酸板构成的 chows' 室，厚度为 2 毫米，如图 1B 所示。在 5 个透明亚克力板中，侧面使用 2 个板，顶部 1 个板，底部 1 个板，端子 1 个板。
9. 准备一个 60 毫米 x 50 毫米 2 毫米的透明亚克力板作为食物介绍板，并将其放入食物室中。

2. 动物行为评估

1. 将 2 只 7 周龄 ICR 雄性小鼠的同窝小鼠一起放在一个普通笼子里。
2. 为 2 只小鼠的同窝小鼠提供为期 1 周的适应期，免费获得食物颗粒和自来水。
3. 1 周后，用一瓶乙醇 （~40% v/v） 引入 2 只小鼠的同窝小鼠。
   注意:确保他们只被允许在限制饮酒的情况下 随意 闻或吸入提供的乙醇水。
4. 使用 9-10 周龄的小鼠模型和 图 1A 中描述的透明隔间笼进行行为实验。
5. 拆卸所有亚克力板和丙烯腈丁二烯苯乙烯板并彻底清洁它们。首先用超纯水冲洗至少 3 次，然后用纸巾擦干。接下来，用 75% 乙醇喷洒它们，然后用镜头纸清洁它们。最后，让它们风干至少 15 分钟。
6. 在每次重复行为实验之前，称量小鼠并记录它们的体重。
7. 称量 1 克市售芥末和 4.5 克花生酱，新鲜制备芥末和花生酱的混合物。将它们混合在一个拉链塑料袋中。
   注意:由于芥末中异硫氰酸盐的挥发性，将市售芥末储存在 -20 °C 冰箱中非常重要。
8. 称重并在食物介绍板上提供两种 0.5 克花生酱糊或芥末和花生酱的混合物，如图 1B、C 所示。
9. 如图 1B、C 所示，将准备好的食物介绍板放在 chows' 室中，以允许 2 只小鼠在每次视频录制期间 随意 获取食物。
10. 用 30 mL 液体填充下面的凹槽，纯水或白酒（~42% v/v 乙醇），以促进同时吸入，如图 1B、C 所示。
11. 使用放置在每个终端的手机支架上的 2 部智能手机上的相机开始录制。
    注:视频规格如下:帧宽，1920;框架高度，1080;数据速率，20745 kbps;帧速率，每秒 30.00 帧 （fps）。
12. 小心地将 2 只训练有素的同窝小鼠从顶部放入设计的动物行为研究平台中，并立即用顶板固定笼子。
    注意:请确保在 15 秒内完成此步骤。
13. 录制每个视频 2-3 分钟。
    注意:确保实验的整个持续时间，从准备花生酱-芥末混合物到完成视频录制，都限制在 5 分钟以内。
14. 重复整个实验 3 次。
    注意:确保实验的每个重复分离至少 6 小时。
15. 模拟不同的场景。
    注意:例如，在这项工作中，一对小鼠被分成 4 组，有 4 种不同的场景，通过使用上述实验设置来模拟。这些情景包括背景研究的情景 A、阳性对照研究的情景 B、芥末-酒精味-嗅相互作用研究的情景 C 和阴性对照研究的情景 D。 表 1 提供了这些场景的摘要。

3. 图像识别

与许多关于图像处理的研究 23,24,25 类似，分类模型是通过训练 CNN 获得的。DL 操作的脚本是在 Jupyter Notebook （anaconda3） 上用 Python v.3.10 编写的。它位于以下 GitHub 存储库中:git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git。为了构建和训练 CNN，使用了开源库，包括 numpy v.1.21.5、seaborn v.0.11.2、matplotlib v.3.5.2、cv2 v.4.6.0、sklearn v.1.0.2、tensorflow v.2.11.0 和 keras v.2.11.0。这些库提供了开发和训练用于图像识别的 CNN 所需的工具和功能。

1. 从收集的视频剪辑中导出一系列视频帧图像，以使用提供的名为 Step1_ExtractingAndSavingVideoFrameImages.ipynb 的 Jupyter Notebook 生成用于模型训练的数据集。
2. 仅选择至少有 1 只鼠标使用提供的粘贴的图像。所选图像的示例在 补充图 1、补充图 2、补充图 3、补充图 4、补充图 5、补充图 6 和 补充图 7 中提供。
3. 通过实施 Jupyter Notebook 中提供的名为 Step2_DataAugmentation.ipynb 的脚本，通过水平翻转生成的图像来执行数据增强。
4. 保留每秒复制的图像数据，用于外部独立的 CNN 模型验证。使用来自每个第一个和第三个重复的图像进行内部模型训练和测试。
5. 通过在 Jupyter Notebook 中运行名为 Step3_CNNmodeling_TrainTest.ipynb 的脚本，对 CNN 建模中使用的图像数据进行预处理，包括图像大小调整、黑色转换和图像信号归一化。
6. 以 8:2 的方式随机将训练材料拆分为内部训练和测试数据集。
7. 初始化 CNN 的体系结构。根据要检查的场景数量设计 CNN 的输出数量。
   注意:例如，在本研究中，神经网络被指定对 3 个类别进行分类。确保编译了用于处理类权重数据不平衡的脚本。
8. 找到在 CNN 构建的内部测试样本上产生最小损失的超参数组合。
9. 采用最优超参数组合构建 CNN 架构。
10. 打开提供的 Jupyter Notebook Step4_CNNmodel_ExternalValOriginal.ipynb 和 Step5_CNNmodel_ExternalValFlipped.ipynb。使用来自动物行为实验的第二个复制品的独立（原始和翻转）图像验证获得的模型。
11. 部署获得和验证的模型，以使用 Jupyter Notebook Step6_CNNmodel_Application.ipynb 对实验组生成的视频帧图像进行分类。
    注意:例如，这是本作品中的场景 C。

4. 手动鼠标鬼脸量表评分

注:为了验证 CNN 模型预测提供的见解，应用了 Langford 等人先前开发和验证的另一种方法¹⁶。该方法涉及根据 5 个特定的小鼠面部动作单位 （AU） 对 MGS 进行评分:眼眶收紧、鼻子隆起、脸颊隆起、耳朵向外收紧和胡须变化。每个 AU 都分配了 0 、 1 或 2 的分数，分别表示 AU 的缺失、中度存在或明显存在。该评分系统允许对每个 AU 进行量化和缩放，以评估小鼠所经历的伤害感受或不适程度。

1. 捕获同窝动物为每个视频剪辑摄取糊状物的 3 个视频帧图像。确保每帧之间至少相隔 3 秒。
2. 通过使用提供的名为 "shuffleSlides.pptm" 的模板文件（补充文件 1）并运行嵌入的宏代码，按顺序对来自不同类别的场景的图像进行盲代码和随机重新排序。
3. 邀请至少 10 位答疑者对示例图像进行评分。
4. 培训专家使用 MGS 对图像样本进行评分。向小组成员提供培训材料，其中包括有关 MGS 的原始文章及其手册^15,16。
5. 通过对对应 5 个面部 AU 的所有得分点求平均值，计算捕获帧中每个动物受试者的 MGS 分数。将 MGS 分数表示为测量误差 （SEM） 的平均值±标准误差。
6. 通过使用 Bonferroni 的多重比较事后检验的单因素方差分析 （ANOVA） 来确定不同类别的场景之间是否存在统计显著差异。
   注: P < 0.05 的值被认为具有统计显著性。

结果

本研究的主要目的是建立一个强大的框架来研究小鼠的味觉-嗅觉相互作用。该框架结合了人工智能和 QBA 的使用来开发预测分类模型。此外，从 DL 获得的见解与定量 MGS 评估进行交叉验证，以进行内部独立分析。该方法的主要应用是检查小鼠嗅闻膳食酒精饮料时对芥末引发的伤害感受的抑制程度。

深度学习模型识别了 29% 的芥末-酒精共处理图像，这些图像属于芥末阴性酒类阳性组
人类在食用市售芥末酱后可能会出现面部反应过度。在小鼠中也可以观察到类似的经历（补充视频 1）。由于伤害感受与啮齿动物的面部表情密切相关，因此监测了 2 只同窝动物的行为，以确定它们在提供含有或缺乏商业芥末的食物时的反应。在这项研究中，使用 DL 技术对 CNN 进行了训练。由于每个场景进行了 3 次重复，因此第 1^次 和^{第 3 次} 重复的图像材料用于 CNN 模型超参数调整和建模内部训练和测试。 表 2 详细介绍了本研究中 CNN 架构的演变。CNN 的优化架构包括一个分辨率为 268 x 268 像素的输入层，然后是 4 个二维卷积层，每个层有 8 个滤波器。此外，2 个池化层、2 个 dropout 层、1 个展平层和 2 个密集层被纳入 3 类分类任务。请参阅 补充文件 2 了解 CNN 架构。

本研究中的模型是使用包含 35,486 张图像的数据集进行训练的，并在 7 个时期的 8,872 张图像上进行了测试。在内部训练和测试数据集上，可以看到训练模型在训练期间的性能，包括损失、精度-召回率、精度和灵敏度（或召回率）等指标，请参见 补充图 8A-D。该模型在内部训练集和测试集中的准确度、精密度和灵敏度均为 1。这表明模型的预测与内部训练和测试数据集中图像的实际类别一致。模型训练后，使用^第 2 个复制的图像来确保并独立验证过拟合对于获得的 CNN 模型来说不是问题。该模型在背景研究（情景 A）中对 4,820 张图像的准确度、精密度和灵敏度值为 1，在阳性对照研究中为 3,900 张图像（情景 B），在阴性对照研究中为 2,731 张图像（情景 D）。部署获得的预测模型，将小鼠嗅探烈酒和食用含芥末花生酱（场景 C）的视频帧图像分类为不同的研究场景，即场景 A、B 和 D。结果显示，0% 和 29% 的图像分别分为背景研究（情景 A，存在纯水和无芥末花生酱）和阴性对照研究（情景 D，存在中国烈酒和无芥末花生酱）类别，而 71% 的图像被归类为阳性对照组（情景 C，存在纯净水和芥末-花生酱混合物）。这些发现意味着膳食酒的存在可能会减少小鼠中芥末诱发的伤害感受。为了评估机器学习从提供的训练材料中学到的内容，为每个卷积层生成了特征图。如 补充图 9A-D 所示，观察到机器的注意力集中在各种面部特征上，例如眼睛眼眶、鼻子、脸颊和身体边缘、耳朵，以及 chow 的接触表面。基于这些观察结果，进行了另一种数据分析方法 MGS。MGS 侧重于小鼠的面部 AU，允许进行统计评估并进一步验证将酒精饮料呈现给芥末诱导的伤害感受的抑制能力。

手动鼠标鬼脸量表评分在统计上验证了机器学习预测。
使用 MGS 评分评估芥末诱发的伤害感受的强度，该评分从 0 到 2 不等，其中 0 分代表最不严重，2 分表示最严重的反应。在这项研究中，24 只小鼠的 MGS 评分（即，2 只小鼠在 12 个选定的图像中显示为补充图 10、补充图 11、补充图 12、补充图 13）由 22 名训练有素的小组成员进行评估。对 2 只小鼠的窝仔数进行一式三份实验分析，结果显示，批内精密度和批间精密度的相对标准推导范围分别为 0%-25% 和 9%-33%。这表明 MGS 评分过程具有良好的精度和一致性。观察到给予花生酱的小鼠（图 3A，0.73 ± 0.04）和给予芥末和花生酱混合物的小鼠（图 3B，1.59 ± 0.11）的小鼠的 MGS 评分之间存在显着差异。这验证了动物行为研究的实验设置，并证实了芥末在诱导伤害性反应方面的功效。尽管从下面提供的酒精饮料（~42% v/v 酒精）释放的酒精蒸气可能具有刺激性，但 MGS 评分（图 3D，0.86 ± 0.16）与对照组相比没有显示出显着差异（图 3A，0.73 ± 0.04）。然而，观察到使用芥末-花生酱混合物的小鼠的 MGS 评分（图 3B，1.59 ± 0.11）与在食用芥末期间暴露于酒精蒸气的小鼠（图 3C，0.95 ± 0.07）之间存在显着差异，P 值为 <0.05。这些发现表明，芥末和酒精饮料的共同应用可能会减少芥末引起的刺激，这与人工智能的观点一致。有必要进一步调查以探索所提供的中国烈酒中有助于抑制芥末刺激性的有效成分，这可能是由于乙醇的存在。

已可用的代码示例。与当前提交相关的所有用于执行图像识别的代码都可以在公共 GitHub 存储库中找到:git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git。任何更新也将发布在 GitHub 存储库上，并引用这项工作的最终 DOI。

图 1:与疼痛相关的动物行为研究的实验装置。 （A） 使用放置在每个终端上的手机支架上的 2 部智能手机上的摄像头对 2 只小鼠的面部表情进行视频录制的整个设置。（B） chows 室用于 随意 向 2 只小鼠提供两剂 0.5 g 花生酱糊或芥末和花生酱的混合物，并将 30 mL 液体（水或 ~42% v/v 液）填充在糊状物下方的凹槽中，以便同时吸入。（C） 仔细观察由 30 mL 液体填充并包含 2 个芥末-花生酱混合物糊状物的凹槽。通过将 1 g 市售芥末与 4.5 g 花生酱混合来制备混合物。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:卷积神经网络模型的架构及其输入和输出。 来自 3 个不同场景的图像用于训练，包括用于背景研究的场景 A、用于阳性对照研究的场景 B 和用于阴性对照研究的场景 D。经过模型训练，将芥末-酒精味-嗅相互作用研究的场景 C 图像分为场景 A、B 或 D。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:提供不同选择小鼠的小鼠鬼脸量表 （MGS） 评分。 MGS 评分从 0 到 2，其中 0 分代表最不严重，2 分代表最严重。参考 MGS 量表改编自 Langford 等人 （2010）¹⁶。提供 （A） 食用花生酱的小鼠的鬼脸得分为 0.73 ± 0.04;（B） 芥末和花生酱的混合物（1 克市售芥末兑 4.5 克花生酱）的摄入量得分为 1.59 ± 0.11;（C） 用于摄入芥末和花生酱的混合物，而从下面提供的烈酒中吸入酒精（~42% v/v 酒精），得分 0.95 ± 0.07;（D） 当从下面吸入酒精时食用的花生酱，提供的烈酒得分为 0.86 ± 0.16。*， P < 0.05;**， P < 0.01; ns，在 95% 置信区间下，通过单向方差分析与 Bonferroni 的多重比较事后检验没有显着差异。误差线表示测量的标准误差 （SEM）。在每个场景中对 2 只小鼠进行了一式三份测量。 请单击此处查看此图的较大版本。

表 1:动物行为评估中模拟的四种情景总结。 备注: ^a 混合物是通过将 1 克市售芥末与 4.5 克花生酱混合制备的。 ^b 含 ~42% v/v 酒精的中国烈酒。 请点击此处下载此表格。

表 2:模型性能摘要。 批量大小为 64 的超参数，^{第 1 个} 2D 卷积层的滤波器编号为 8，没有后续 dropout，第 2^个 2D 卷积层的滤波器编号为 8，第 3^个 2D 卷积层的滤波器编号为 8，dropout 为 0.1，^{第 4 个} 2D 卷积层的滤波器编号为 8， 和 64 个滤网层的滤光片编号为 0.5 dropout 的滤波器编号在内部拆分测试集中产生的损失最低。然后采用这些超参数来训练 3 组 （场景 A、B 和 D） 分类模型，以预测场景 C 的图像。情景 B 用于阳性对照研究。情景 D 用于阴性对照研究。情景 C 用于芥末-酒精味觉-嗅觉相互作用研究。 请点击此处下载此表格。

补充图 1:场景 A 类深度学习的示例培训材料（背景研究）。请点击此处下载此文件。

补充图 2:场景 B 类深度学习的示例培训材料（阳性对照研究）。请点击此处下载此文件。

补充图 3:场景 D 类深度学习的示例培训材料（阴性对照研究）。请点击此处下载此文件。

补充图 4:用于模型验证的情景 A（背景研究）类的预测和示例独立材料。请点击此处下载此文件。

补充图 5:用于模型验证的情景 B 类（阳性对照研究）的预测和示例独立材料。请点击此处下载此文件。

补充图 6:用于模型验证的情景 D（阴性对照研究）类的预测和示例独立材料。请点击此处下载此文件。

补充图 7:用于模型应用的情景 C 类（芥末-酒精味-嗅相互作用研究）的预测和示例材料。请点击此处下载此文件。

补充图 8:最佳深度学习模型的预测性能。 （A） 沿 7 个 epoch 的训练损失和内部验证损失;（B） 精度-召回率曲线，（C） 精度，以及 （D） 沿 7 个时期的训练和内部验证的召回率。 请点击此处下载此文件。

补充图 9:每个卷积层的特征图。 场景 A、B、D 中 （A） 第一层、（B） 第二层、（C） 第三层、（D） 最后一层的特征图，从上到下排序。场景 A 用于背景研究。情景 B 用于阳性对照研究。情景 D 用于阴性对照研究。 请点击此处下载此文件。

补充图 10:场景 A 的手动鼠标鬼脸量表评分的选定图像（背景研究）。请点击此处下载此文件。

补充图 11:场景 B（阳性对照研究）手动鼠标鬼脸量表评分的选定图像。请点击此处下载此文件。

补充图 12:场景 C 的手动小鼠鬼脸量表评分的选定图像（芥末-酒精味觉-嗅相互作用研究）。请点击此处下载此文件。

补充图 13:场景 D（阴性对照研究）手动鼠标鬼脸量表评分的选定图像。请点击此处下载此文件。

补充视频 1: 食用芥末后老鼠的鬼脸，存在或不存在低于供应的酒精饮料。从 0 s 到 8 s，视频剪辑呈现了小鼠食用花生酱后的正常面部表情。从 8 秒到 17 秒，它说明了小鼠在摄入芥末时的鬼脸。小鼠表现出眼眶收紧、鼻子隆起、脸颊凸起、耳朵向外收紧和胡须变化。从 17 秒到 29 秒，它表明当烈酒在下面可用时，可以抑制芥末诱导的伤害感受。从 29 秒到结束，它在上述不同场景中展示了一系列鬼脸。请注意，提供的视频仅用于说明。其质量与所描述的图像识别和建模的质量要求不同。 请点击此处下载此视频。

补充文件 1:shuffleSlides.pptm。补充的 Microsoft PowerPoint 启用宏的演示文稿，名为 "shuffleSlides.pptm"。此文件是为鼠标鬼脸量表评分的盲测随机排列图像而准备的。 请点击此处下载此文件。

补充文件 2:CNN 架构。请点击此处下载此文件。

讨论

本研究中提出的研究味觉-嗅觉相互作用的方法基于由 Langford 等人开发的小鼠面部疼痛表情的原始行为编码方法¹⁶。最近发表的几篇文章介绍了 CNN 用于自动鼠标面部跟踪和随后的 MGS 评分 21,26,27,28。与单独的原始方法相比，应用 CNN 具有优势，因为它可以生成一系列可用于训练预测模型的视频帧图像。相比之下，原始方法需要为 MGS 预先选择有限数量的图像，这可能会引入主观性和偏见。

在先前发表的基于 CNN 的方法中，所有方法都是为评估将致痛剂直接注射到血液循环中后的痛苦或不适程度而开发的^26,28。这种药物引入方法的一个缺点是，需要花费大量精力来过滤掉无法捕获鼠标面部轮廓的视频帧图像。在这项研究中，在随意的基础上提供了引起伤害感受的药剂商业芥末。花生酱除了掩盖挥发性成分 AITC 外，还能够吸引小鼠受试者呈现清晰的前视手势，从而有助于在视频录制过程中捕捉他们的面部轮廓。此外，这种方法消除了针头插入引起的疼痛的任何潜在干扰。然而，重要的是要注意，小鼠的摄入运动可能会干扰鼻子隆起和脸颊隆起的 MGS 评分。为了解决这个问题，必须通过为小鼠提供纯花生酱来进行基线对照实验。

在某些基于 CNN 的动物行为研究算法中，只有小鼠面部动作单元的子集是从训练图像中选择的，并被编程为被捕获^21,22。这些计算方法依赖于与伤害感受相关的预定义特征，同时可能忽略特定于单个小鼠受试者的其他重要特征。因此，它可能会导致信息丢失。相比之下，这项研究采用了不同的方法，使用整个小鼠面部图像来训练 CNN 模型。这种基于图像的纯使用 （IOU） 方法已被证明对图像分类更有效²⁵。因此，本研究中提出的 CNN 建模方法类似于一些提出的方法，这些方法首先使用没有区域注释的整个图像来训练 CNN 模型，然后通过人工评估来验证模型^27,29。这种方法可以在图像中保留更多信息并防止主观性引入。

然而，这项工作中实验设置的一个局限性是小鼠受试者被安置为 2 个同窝伴侣，而不是在单个栖息地。这个决定是有意为之的，因为老鼠是群居动物，通常在群体环境中茁壮成长。一个有趣的发现是，在动物训练期间，3 个笼子中只有 2 个笼子里的同窝同胞被训练以适应中国精神的存在。结果，仅对这 2 只同窝仔进行了一式三份的实验。对于 CNN 建模的训练材料，还取了包含 2 个同窝伙伴的单个图像作为单个样本，不进行任何分割。这种方法使我们能够捕捉同窝动物之间的互动，并集体分析它们的行为和面部表情。

与基于图像的 MGS 评分方法类似，本研究中提出的方法有望转移到其他种类的动物，例如猫科动物和马^30,31。通过应用所提出的方法，应用计算机视觉的食物诱导食物引入方法可以成为促进动物行为研究的方法，特别是各种动物的味觉-嗅觉相互作用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无水乙醇 （EtOH）	VWR 化学品 BDH	CAS# 64-17-5
丙烯腈丁二烯苯乙烯砖	嘉辉丰旗舰店	https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
烯腈丁二烯苯乙烯板	嘉辉丰旗舰店	https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
异硫氰酸烯丙酯 （AITC）	Sigma-Aldrich	CAS# 57-06-7
无水二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	CAS# 67-68-5
中国烈酒	洋河青辞	https://www.chinayanghe.com/article/45551.html
商业芥末	S&B 食品公司
甲酸 （FA）	VWR 化学品 BDH	CAS# 64-18-6
GraphPad Prism 5	GraphPad	https://www.graphpad.com
HPLC 级乙腈 （ACN）	VWR 化学品 BDH	CAS# 75-05-8
HPLC 级甲醇 （MeOH）	VWR 化学品 BDH	CAS# 67-56-1
Microsoft Excel2016	Microsoft	https：//www.microsoft.com
Microsoft PowerPoint 2016	Microsoft	https://www.microsoft.com
Milli-Q 水系统	Millipore	https://www.merckmillipore.com
小鼠：ICR	实验动物服务中心（中国香港中文大学）	N/A
花生酱	Skippy	https://www.peanutbutter.com/peanut-butter/creamy
Python v.3.10	Python 软件基础	https：//www.python.org
透明亚克力板	淘宝店	https://item.taobao.com/item.htm?_u=32l3b7k63381&id=60996545797 0&spm=a1z09.2.0.0.77572e8dFPM EHU