本文介绍了一组用于测量嗅闻酒精饮料对芥末引起的刺痛感抑制能力的方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
常用于食品制备的市售芥末酱含有化学感应类异硫氰酸酯（ITCs）的同系化合物，食用后会引发刺激感。目前尚未有研究探讨嗅闻含酒精饮料对芥末辛辣感的影响。尽管大多数感官评价研究分别针对单一食物或饮料进行，但关于食用芥末时同时嗅闻烈酒的嗅觉效应研究仍属空白。本文建立了一种结合动物行为学实验与卷积神经网络的方法，用于分析小鼠在同时嗅闻酒精饮料并摄入芥末时的面部表情。结果表明，经过训练和验证的深度学习模型能够在无需预先筛选训练材料的情况下，识别出29%属于“芥末阴性-酒精阳性”类别的共处理图像。对所选视频帧图像提取的小鼠面部疼痛评分进行统计分析，结果显示有无酒精存在时差异显著（P < 0.01）。该发现提示膳食性酒精饮料可能减弱小鼠对芥末引发的反应。这种联合方法在未来具有用于单个ITC化合物筛选及烈酒成分感官分析的潜力。然而，仍需进一步研究以阐明酒精抑制芥末辛辣感的潜在机制。
引言
山葵（Wasabia japonica）俗称芥末，在食品加工中已广为人知1,2。食用后引起的强烈感官反应，如流泪、打喷嚏或咳嗽，是其广为人知的特点。山葵独特的辛辣味源于一类与化学感受异硫氰酸酯（ITCs）同源的化合物。这些化合物属于挥发性有机硫植物化学物质，可分为ω-烯基和ω-甲硫基烷基异硫氰酸酯3。在这些化合物中，烯丙基异硫氰酸酯（AITC）是十字花科植物（如辣根和芥菜）中最主要的天然ITC产物4。市售山葵酱通常由辣根制成，因此AITC被用作这些商业化产品质控的化学标志物5。
将含酒精饮料与芥末调味菜肴搭配食用可被视为一种文化习惯的体现6。主观上，这种组合可能增强芥末与酒类之间的辛辣感和热感，从而提升整体的饮食体验。动物定性行为评估（QBA）是一种全面的全动物方法学，通过数值术语来考察受试动物在短期或长期外界刺激下的行为变化7。该方法包括疼痛测试、运动功能测试、学习与记忆测试，以及专为啮齿类动物模型设计的情绪测试8。然而，迄今为止，关于味觉与嗅觉协同感官评价的研究在文献中仍十分有限9,10。大多数关于化学感觉的研究仍局限于单独考察单一食物或饮料的摄入过程11。因此，针对食用芥末时嗅闻烈酒这一行为所涉及的味觉-嗅觉相互作用，目前尚缺乏相关研究。
由于芥末引起的刺痛感被认为是一种伤害性感受12，动物行为学评估非常适合用于评价啮齿类动物的伤害性感觉反应8,13,14。Langford 等人开发了一种用于评估小鼠伤害性感受的方法，称为小鼠面部表情评分法（mouse grimace scale, MGS）15,16。这种行为学研究方法是一种与疼痛相关的评估手段，依赖于对实验小鼠面部表情的分析。实验装置简单，仅需一个透明笼子和两台用于视频录制的摄像机。通过结合先进的技术17,18,19实现自动数据采集，可以获得定量和定性的行为学指标，从而在行为监测过程中提升动物福利20。因此，MGS 有望被应用于以连续且自由接触（ad libitum）的方式研究各种外界刺激对动物的影响。然而，评分过程仅涉及由评审人员从视频中选取少量（少于10帧）图像进行评估，且需要事先培训。对大量样本图像进行评分可能非常耗时。为克服这一耗时难题，已有若干研究采用机器学习技术来预测 MGS 评分21,22。但需要注意的是，MGS 是一种连续性测量指标。因此，对于判断“同时摄入芥末并嗅闻烈酒的小鼠图像是否类似于正常小鼠”这类具有逻辑性和分类性的问题，采用多分类分类模型将更为合适。
本研究提出了一种用于探究小鼠味觉与嗅觉相互作用的方法。该方法结合动物行为学研究与卷积神经网络（CNN），以分析小鼠的面部表情。在特制的实验笼中，对两只小鼠分别在正常行为状态、芥末诱导的伤害性感受状态以及嗅闻酒类气味状态下各进行了三次观察。记录小鼠的面部表情视频，并将生成的帧图像用于优化深度学习（DL）模型的架构。随后，利用独立的图像数据集对该模型进行验证，并将其应用于对实验组获取图像的分类。为了确定小鼠在摄入芥末的同时嗅闻酒类气味时芥末辛辣感被抑制的程度，进一步通过另一种数据分析方法——MGS评分法16——与人工智能提供的分析结果进行交叉验证。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本研究使用了两只7周龄、体重在17-25 g之间的ICR雄性小鼠进行动物行为学评估。所有饲养和实验程序均经香港浸会大学教学与科研中人类和动物使用委员会批准。动物房环境温度维持在25 °C，相对湿度保持在40%-70%，并采用12小时光照-黑暗循环。
1. 笼具设计
- 准备三种不同尺寸的丙烯腈-丁二烯-苯乙烯（ABS）积木用于笼子构建：8 mm × 8 mm × 2 mm、16 mm × 16 mm × 6 mm 和 32 mm × 16 mm × 6 mm。
- 准备一块丙烯腈-丁二烯-苯乙烯（ABS）板（312 mm × 147 mm × 2 mm）作为笼子底座。
- 准备一块尺寸为 239 mm × 107 mm、厚度为 2 mm 的不透明亚克力板，用作底板。
- 准备一块尺寸为 239 mm × 107 mm、厚度为 5 mm 的透明亚克力板，用作顶板。
- 准备一块尺寸为 107 mm × 50 mm、厚度为 7 mm 的透明亚克力板，用作端板。
- 通过堆叠积木构建两个不透明的侧墙，高度为 54 mm。
- 将亚克力板嵌入基于丙烯腈-丁二烯-苯乙烯（ABS）的笼体中，如图 1A所示。
- 准备一个饲料室，由五块尺寸为 90 mm × 50 mm、厚度为 2 mm 的透明亚克力板构成，如图 1B所示。在这五块透明亚克力板中，两块用作侧板，一块用作顶板，一块用作底板，一块用作端板。
- 准备一块尺寸为 60 mm × 50 mm × 2 mm 的透明亚克力板作为饲料引入板，并将其放置在饲料室内。
2. 动物行为学评估
- 将2只7周龄的ICR雄性小鼠同窝饲养于普通笼具中。
- 为2只小鼠的同窝幼鼠提供颗粒饲料和自来水，任其自由取食，适应1周时间。
- 1 周后，将 2 只小鼠的同窝仔鼠与一瓶乙醇（约 40% v/v）一起引入。
注意：确保他们仅被允许嗅闻或吸入所提供的水性乙醇 随意摄取 在限制饮水的情况下进行基础代谢测定。 - 使用9-10周龄小鼠模型和图示的透明立方体笼进行行为学实验 图1A.
- 拆卸所有亚克力板和丙烯腈-丁二烯-苯乙烯板，并彻底清洁。首先用超纯水冲洗至少3次，然后用纸巾擦干。接着喷洒75%乙醇，再用镜头纸擦拭清洁。最后静置空气中干燥至少15分钟。
- 称量小鼠体重，并在每次行为学实验重复前记录其体重。
- 称取1 g市售芥末和4.5 g花生酱，放入密封塑料袋中，新鲜配制混合物。
注意：由于芥末中的异硫氰酸酯具有挥发性，因此需将市售芥末储存在 -20 °C 冰箱中。 - 称取并提供两份各0.5 g的花生酱，或在饲料引入板上提供芥末与花生酱的混合物，如图所示 图1B，C.
- 将准备好的饲料引入板放置在幼崽饲养箱内，如图所示 图1B，C，以使这两只小鼠能够 随意摄取 每次视频录制期间的食物获取
- 在下方凹槽中加入 30 mL 液体（纯水或酒类液体，约 42% v/v 乙醇），以促进同步吸入，如图所示。 图1B，C.
- 使用放置在两端手机支架上的两部智能手机，开始录像。
注意：视频规格如下：帧宽度 1920；帧高度 1080；码率 20745 kbps；帧率 30.00 帧每秒（fps）。 - 将2只经过训练的同窝小鼠从上方小心放入指定的动物行为学研究平台，并立即用顶板固定笼具。
注意：确保此步骤在 15 秒内完成。 - 每个视频录制2-3分钟。
注意：确保整个实验过程，从花生酱-芥末混合物的制备到视频录制完成，总时长不超过5分钟。 - 重复整个实验3次。
注意：确保每次实验重复之间至少间隔6小时。 - 模拟不同场景。
注意：例如，在本研究中，采用上述实验设置模拟了4种不同情景，每种情景使用一对小鼠，共分为4组。这些情景包括情景A（背景研究）、情景B（阳性对照研究）、情景C（芥末-酒精味觉-嗅觉相互作用研究）和情景D（阴性对照研究）。 表1 对这些情景进行了总结。
3. 图像识别
与许多图像处理研究类似23,24,25，通过训练卷积神经网络（CNN）获得了分类模型。深度学习操作的脚本使用 Python v.3.10 在 Jupyter Notebook（anaconda3）中编写，可在以下 GitHub 仓库获取：git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git。为构建和训练 CNN，使用了多个开源库，包括 numpy v.1.21.5、seaborn v.0.11.2、matplotlib v.3.5.2、cv2 v.4.6.0、sklearn v.1.0.2、tensorflow v.2.11.0 和 keras v.2.11.0。这些库提供了开发和训练用于图像识别的卷积神经网络所必需的工具和功能。
- 使用提供的 Jupyter Notebook（名为 Step1_ExtractingAndSavingVideoFrameImages.ipynb）从采集的视频片段中导出一系列视频帧图像，以生成用于模型训练的数据集。
- 仅选择至少有一只小鼠在摄食所提供糊状物的图像。所选图像的示例如下：补充图1、补充图2、补充图3、补充图4、补充图5、补充图6 和 补充图7。
- 通过执行 Jupyter Notebook 中提供的脚本（名为 Step2_DataAugmentation.ipynb），对生成的图像进行水平翻转以实现数据增强。
- 保留每次实验的第二次重复所获得的图像数据，用于外部独立的 CNN 模型验证；使用每次实验的第一和第三次重复的图像数据进行内部模型训练与测试。
- 运行 Jupyter Notebook 中名为 Step3_CNNmodeling_TrainTest.ipynb 的脚本，对用于 CNN 建模的图像数据进行预处理，包括图像缩放、黑色背景转换以及图像信号归一化。
- 将训练数据以 8:2 的比例随机划分为内部训练集和测试集。
- 初始化 CNN 网络结构，并根据需检测的场景数量设计 CNN 的输出类别数。
注：例如，在本研究中，神经网络被设定为分类 3 个类别。请确保已编译用于处理类别权重不平衡问题的脚本。 - 寻找在内部测试样本上产生最小损失的超参数组合，用于 CNN 构建。
- 采用最优的超参数组合来构建 CNN 网络结构。
- 打开提供的 Jupyter Notebook 文件 Step4_CNNmodel_ExternalValOriginal.ipynb 和 Step5_CNNmodel_ExternalValFlipped.ipynb，利用动物行为实验第二次重复中获得的独立图像（原始及翻转图像）对所获得的模型进行验证。
- 部署经过验证的模型，使用 Jupyter Notebook Step6_CNNmodel_Application.ipynb 对实验组生成的视频帧图像进行分类。
注：例如，在本研究中为情景 C。
4. 小鼠面部表情量表人工评分
注意：为了验证卷积神经网络（CNN）模型预测所提供的结果，还应用了 Langford 等人先前开发并验证的另一种方法16。该方法基于5种特定的小鼠面部动作单元（AUs）对小鼠面部表情评分（MGS）进行评分：眼眶收缩、鼻部隆起、颊部隆起、耳朵外展收缩以及胡须变化。每种动作单元根据其缺失、中等程度出现或明显出现分别赋予0、1或2分。该评分系统可对每种动作单元进行量化和分级，以评估小鼠所经历的伤害性感受或不适程度。
- 为每个视频片段捕获同一窝幼鼠摄取膏状物的 3 帧视频图像。确保每帧之间至少间隔 3 秒。
- 使用提供的名为 "shuffleSlides.pptm" 的模板文件（补充文件 1），运行其中嵌入的宏代码，对来自不同情景类别的图像进行盲法编码并随机重新排序。
- 邀请至少 10 名评估人员对样本图像进行评分。
- 培训评估人员使用 MGS 对图像样本进行评分。向评估人员提供培训材料，包括关于 MGS 的原始文献及其操作手册15,16。
- 通过计算相应 5 个面部动作单元（AUs）评分点的平均值，得出每只实验动物在捕获帧中的 MGS 评分。以均值 ± 测量标准误（SEM）的形式呈现 MGS 评分。
- 采用单因素方差分析（ANOVA）结合 Bonferroni 多重比较事后检验，判断不同情景类别之间是否存在统计学显著差异。
注意：当 P < 0.05 时，认为差异具有统计学显著性。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本研究的主要目标是建立一个用于探究小鼠味觉与嗅觉相互作用的稳健框架。该框架结合人工智能和定性行为评估（QBA），以构建预测性分类模型。此外，通过定量小鼠面部表情评分（MGS）进行内部独立分析，对深度学习（DL）所得结果进行交叉验证。该方法的主要应用是考察小鼠嗅闻饮食性酒精饮料时，芥末诱发的伤害性感受被抑制的程度。
深度学习模型对芥末阴性-酒精阳性组中29%的芥末-酒精联合处理图像的识别
食用市售芥末酱后，人类可能会出现面部过度反应。小鼠中也可能观察到类似现象（补充视频 1）。由于伤害性感觉与啮齿类动物的面部表情高度相关，本研究通过监测2只同窝幼鼠的行为，以确定其在摄食含有或不含市售山葵的饲料时的反应。本研究中，采用深度学习技术训练了一个卷积神经网络（CNN）。由于每种实验条件均设置了3个重复，因此从3次重复实验中获取的图像资料用于后续分析。st 和 3rd 用于CNN模型超参数调优以及模型内部训练与测试的重复实验。本研究中CNN架构的演变过程详见于
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本研究中提出的用于分析味觉-嗅觉相互作用的方法，基于 Langford 等人开发的小鼠疼痛面部表情行为编码原始方法16。近年来发表的多篇文献已将卷积神经网络（CNN）应用于小鼠面部的自动追踪及后续的 MGS 评分21,26,27,28。相较于仅使用原始方法，应用 CNN 具有优势，因其可生成一系列视频帧图像，用于训练预测模型。相比之下，原始方法需预先选择有限数量的图像用于 MGS 评分，这可能引入主观性和偏差。
在先前发表的基于卷积神经网络（CNN）的方法中，所有方法均是针对将致痛物质直接注入血液循环后评估动物痛苦或不适程度而开发的26,28。这种药物引入方式的一个...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
Cai Z. 感谢郭钟宝芬慈善基金在设立郭一羽环境与生物分析讲席教授职位过程中提供的资金支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 无水乙醇（EtOH） | VWR Chemicals BDH | CAS# 64-17-5 | |
| 丙烯腈-丁二烯-苯乙烯塑料砖 | Jiahuifeng 旗舰店 | https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html | |
| 丙烯腈-丁二烯-苯乙烯塑料板 | Jiahuifeng 旗舰店 | https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html | |
| 烯丙基异硫氰酸酯（AITC） | Sigma-Aldrich | CAS# 57-06-7 | |
| 无水二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | CAS# 67-68-5 | |
| 中国白酒 | 洋河青瓷 | https://www.chinayanghe.com/article/45551.html | |
| 市售芥末 | S&B FOODS INC. | https://www.sbfoods-worldwide.com | |
| 甲酸（FA） | VWR Chemicals BDH | CAS# 64-18-6 | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | https://www.graphpad.com | |
| 高效液相色谱级乙腈（ACN） | VWR Chemicals BDH | CAS# 75-05-8 | |
| 高效液相色谱级甲醇（MeOH） | VWR Chemicals BDH | CAS# 67-56-1 | |
| Microsoft Excel 2016 | Microsoft | https://www.microsoft.com | |
| Microsoft PowerPoint 2016 | Microsoft | https://www.microsoft.com | |
| Milli-Q 超纯水系统 | Millipore | https://www.merckmillipore.com | |
| 小鼠：ICR | 实验动物服务中心（中国香港，香港中文大学） | N/A | |
| 花生酱 | Skippy | https://www.peanutbutter.com/peanut-butter/creamy | |
| Python v.3.10 | Python 软件基金会 | https://www.python.org | |
| 透明亚克力板 | 淘宝店铺 | https://item.taobao.com/item.htm?_u=32l3b7k63381&id=60996545797 0&spm=a1z09.2.0.0.77572e8dFPM EHU |
参考文献
- Isshiki, K., Tokuoka, K., Mori, R., Chiba, S. Preliminary examination of allyl isothiocyanate vapor for food preservation. Biosci Biotechnol Biochem. 56 (9), 1476-1477 (1992).
- Li, X., Wen, Z., Bohnert, H. J., Schuler, M. A., Kushad, M. M. Myrosinase in horseradish (Armoracia rusticana) root: Isolation of a full-length cDNA and its heterologous expression in Spodoptera frugiperda insect cells. Plant Sci. 172 (6), 1095-1102 (2007).
- Depree, J. A., Howard, T. M., Savage, G. P. Flavour and pharmaceutical properties of the volatile sulphur compounds of Wasabi (Wasabia japonica). Food Res Int. 31 (5), 329-337 (1998).
- Hu, S. Q., Wei, W. Study on extraction of wasabi plant material bio-activity substances and anti-cancer activities. Adv Mat Res. 690 - 693, 1395-1399 (2013).
- Lee, H. -K., Kim, D. -H., Kim, Y. -S. Quality characteristics and allyl isothiocyanate contents of commercial wasabi paste products. J Food Hyg Saf. 31 (6), 426-431 (2016).
- Bacon, T. Wine, wasabi and weight loss: Examining taste in food writing. Food Cult Soc. 17 (2), 225-243 (2014).
- Fleming, P. A., et al. The contribution of qualitative behavioural assessment to appraisal of livestock welfare. Anim Prod Sci. 56, 1569-1578 (2016).
- Shi, X., et al. Behavioral assessment of sensory, motor, emotion, and cognition in rodent models of intracerebral hemorrhage. Front Neurol. 12, 667511(2021).
- Stevenson, R. J., Prescott, J., Boakes, R. A. Confusing tastes and smells: How odours can influence the perception of sweet and sour tastes. Chem Senses. 24 (6), 627-635 (1999).
- Pfeiffer, J. C., Hollowood, T. A., Hort, J., Taylor, A. J. Temporal synchrony and integration of sub-threshold taste and smell signals. Chem Senses. 30 (7), 539-545 (2005).
- Simons, C. T., Klein, A. H., Carstens, E. Chemogenic subqualities of mouthfeel. Chem Senses. 44 (5), 281-288 (2019).
- Andrade, E. L., Luiz, A. P., Ferreira, J., Calixto, J. B. Pronociceptive response elicited by TRPA1 receptor activation in mice. Neuroscience. 152 (2), 511-520 (2008).
- Palazzo, E., Marabese, I., Gargano, F., Guida, F., Belardo, C., Maione, S. Methods for evaluating sensory, affective and cognitive disorders in neuropathic rodents. Curr Neuropharmacol. 19 (6), 736-746 (2020).
- Topley, M., Crotty, A. M., Boyle, A., Peller, J., Kawaja, M., Hendry, J. M. Evaluation of motor and sensory neuron populations in a mouse median nerve injury model. J Neurosci Methods. 396, 109937(2023).
- Langford, D. J., et al. Mouse Grimace Scale (MGS): The Manual. , https://www.nc3rs.org.uk/sites/default/files/documents/Guidelines/MGS%20Manual.pdf (2015).
- Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
- Liu, H., Fang, S., Zhang, Z., Li, D., Lin, K., Wang, J. MFDNet: Collaborative poses perception and matrix Fisher distribution for head pose estimation. IEEE Trans Multimedia. 24, 2449-2460 (2022).
- Liu, T., Wang, J., Yang, B., Wang, X. NGDNet: Nonuniform Gaussian-label distribution learning for infrared head pose estimation and on-task behavior understanding in the classroom. Neurocomputing. 436, 210-220 (2021).
- Liu, T., Liu, H., Yang, B., Zhang, Z. LDCNet: Limb direction cues-aware network for flexible human pose estimation in industrial behavioral biometrics systems. IEEE Trans Industr Inform. 20 (6), 8068-8078 (2023).
- Grant, E. P., et al. What can the quantitative and qualitative behavioural assessment of videos of sheep moving through an autonomous data capture system tell us about welfare. Appl Anim Behav Sci. 208, 31-39 (2018).
- Vidal, A., Jha, S., Hassler, S., Price, T., Busso, C. Face detection and grimace scale prediction of white furred mice. Mach Learn Appl. 8, 100312(2022).
- Zylka, M. J., et al. Development and validation of Painface, A software platform that simplifies and standardizes mouse grimace analyses. J Pain. 24 (4), 35-36 (2023).
- Liu, H., Zhang, C., Deng, Y., Liu, T., Zhang, Z., Li, Y. F. Orientation cues-aware facial relationship representation for head pose estimation via Transformer. IEEE Trans Image Process. 32, 6289-6302 (2023).
- Liu, H., Liu, T., Chen, Y., Zhang, Z., Li, Y. F. EHPE: Skeleton cues-based Gaussian coordinate encoding for efficient human pose estimation. IEEE Trans Multimedia. , (2022).
- Liu, H., et al. TransIFC: Invariant cues-aware feature concentration learning for efficient fine-grained bird image classification. IEEE Trans Multimedia. , (2023).
- Akkaya, I. B., Halici, U. Mouse face tracking using convolutional neural networks. IET Comput Vis. 12 (2), 153-161 (2018).
- Andresen, N., et al. Towards a fully automated surveillance of well-being status in laboratory mice using deep learning: Starting with facial expression analysis. PLoS One. 15 (4), e0228059(2020).
- Ernst, L., et al. Improvement of the mouse grimace scale set-up for implementing a semi-automated Mouse Grimace Scale scoring (Part 1). Lab Anim. 54 (1), 83-91 (2020).
- Tuttle, A. H., et al. A deep neural network to assess spontaneous pain from mouse facial expressions. Mol Pain. 14, 1744806918763658(2018).
- Lencioni, G. C., de Sousa, R. V., de Souza Sardinha, E. J., Corrêa, R. R., Zanella, A. J. Pain assessment in horses using automatic facial expression recognition through deep learning-based modeling. PLoS One. 16 (10), e0258672(2021).
- Steagall, P. V., Monteiro, B. P., Marangoni, S., Moussa, M., Sautié, M. Fully automated deep learning models with smartphone applicability for prediction of pain using the Feline Grimace Scale. Sci Rep. 13, 21584(2023).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
