本方案描述了用于移植克隆猪胚胎的外科手术技术的应用 通过 未产母猪剖腹术
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摘要
摘要
本方案旨在演示将克隆猪胚胎移植至输卵管的手术技术，该方法广泛应用于生物医学研究中转基因猪的制备。九头母猪接受激素同步化处理，并通过剖腹手术将体细胞核移植（SCNT）技术获得的、发育至第2天最多4细胞阶段的克隆胚胎移植至输卵管。随后进行妊娠诊断 通过 移植手术后30天进行超声检查。九头手术母猪中有六头在超声检查中显示妊娠迹象。然而，经超声评估，胎儿发育未见进展，因此在术后60天对母猪实施安乐死，以采集生物样本并评估生殖系统。剖检发现子宫角、卵巢和输卵管存在粘连。从两头安乐死母猪的子宫腔内分别获得1个和4个胚胎结构，其妊娠年龄介于12至20天之间。尽管未获得活仔猪，这可能归因于克隆猪胚胎移植效率较低，而移植效率受多种因素影响，包括移植胚胎的数量和质量，但本研究所采用的手术技术证明是快速且安全的。
引言
猪由于在解剖学、生理学和遗传学方面与人类具有高度相似性，是生物医学研究中极为理想的实验模型1。这些动物常被用于异种移植相关研究，旨在培育出在移植到人体后具有较低排斥风险的器官、细胞或组织。异种移植研究的目标是增加可供人体移植的器官数量，从而缩短患者的等待名单2。
用于异种移植的猪的制备涉及多个步骤，包括利用基因编辑的猪细胞生产克隆个体。在 体外 转基因克隆胚胎的制备过程中，将胚胎移植至具有同步发情周期的母猪生殖系统中，以调节其子宫生理状态，为新胚胎的着床和妊娠做好准备3.
猪的胚胎移植可通过非侵入性或侵入性方法进行4在非侵入性方法中，经宫颈转移无需任何外科手术干预。然而，该方法仅限于较晚发育阶段的胚胎（即桑葚胚或囊胚阶段）的转移，且无法精确定位导管插入位置及胚胎放置部位。5腹腔镜和剖腹手术被认为是侵入性的胚胎移植方法。腹腔镜侵入性较小，但需要特定且昂贵的设备，其效率因多种因素（如生殖结构操作难度和所用导管类型）而有很大差异（从低于20%到超过80%）。4,6因此，转移 通过 与手术移植方法相比，腹腔镜技术的效率仍然较低 通过 剖腹手术4.
母猪胚胎移植手术 通过 剖腹手术是一种相对简单且快速的操作，通常耗时约30分钟。然而，该手术应在配备吸入式麻醉设备和专业团队的外科中心进行。对于商用猪品系（如长白猪、大白猪或其杂交品种），由于动物体重较大（约130–150 kg），必须配备用于抬升后备母猪的吊装设备以及宽大坚固的手术台。
为了确保手术成功，必须预先评估胚胎的发育阶段。建议将不超过4细胞阶段的胚胎移植至输卵管内。而对于4细胞以上的胚胎，如桑葚胚和囊胚，则应移植至子宫角7,8。
尽管全球各地的研究团队正在开展基因修饰克隆猪胚胎的制备及手术移植工作，但目前仍缺乏通过视频形式完整展示该操作流程的标准化方案。该技术对于妊娠成功至关重要，因其要求将胚胎精确地移植至输卵管的特定位置，操作中需定位输卵管腹腔口，并将含有胚胎的移液管插入其中。通过展示整个操作过程的解说视频，可更有效地理解该技术。因此，本文旨在演示将克隆胚胎移植至后备母猪输卵管的剖腹手术，这是未来生产用于异种移植或其他相关用途的基因修饰猪所必需的关键步骤。
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方案
本研究经巴西圣保罗大学兽医与动物科学学院动物研究使用伦理委员会批准，方案编号为6088030523。实验使用了9头来自巴西圣保罗州伊图市Água Branca核心猪场的7月龄后备母猪，在第二次发情检测后立即投入使用9。研究中所用试剂和设备的详细信息列于材料表中。
1. 动物准备
- 术前禁食动物12小时，并限制饮水4小时。
- 使用40 mm × 12 mm针头，将10 mg/kg的氯胺酮和0.2 mg/kg的咪达唑仑抽入同一支50 mL注射器中。将注射器连接至静脉输液装置，以便给药，同时保持与动物的安全距离，使其能够自由活动。
- 给予麻醉前用药 通过 注射至外耳道后方的斜方肌内
- 用20 G导管穿刺耳缘静脉，并连接至宏观输液装置，术中以0.9% NaCl溶液按10 mL/kg/h速率进行液体治疗。
- 以4 mg/kg的丙泊酚静脉注射诱导麻醉（遵循机构批准的方案）。
- 使用喉镜和带套囊的9号气管插管对动物进行经口插管10.
- 使用1.5%至2%异氟烷吸入维持麻醉。同时通过评估生理参数监测麻醉深度，包括心率（应维持在每分钟100至120次）、血氧饱和度（应保持在99%至100%）、肌肉松弛程度、有无自主运动以及反射反应。
注意：应监测并控制体温，保持在37.5–38.5 °C之间。必要时，除异氟烷外，可使用丙泊酚以维持参数稳定。盐酸芬太尼应以每20分钟0.02 mg/kg的剂量作为镇痛剂给药。所有参数应每5分钟记录一次。 - 术前镇痛采用静脉注射单次剂量0.002 mg/kg的芬太尼，以及肌肉注射4 mg/kg的盐酸曲马多，注射部位为臀肌或斜方肌。
- 将心脏电极置于胸部区域，用于术中监测心率。每5分钟记录一次心率、直肠温度和血氧饱和度。
2. 手术步骤
- 将母猪置于手术台上，呈仰卧位。
- 用手术手套覆盖动物的四肢，以尽量减少手术区域的污染。
- 使用手术剪在倒数第二对乳腺之间去除腹部腹侧的毛发。
- 使用浸有氯己定的消毒刷，从脐部瘢痕区域向最后一对乳腺进行环形擦拭，完成术前皮肤消毒。随后用干净的湿敷料擦去氯己定。
- 确保外科医生和助手进行外科消毒，并在手术期间穿戴无菌手术衣和手套。
注意：动物应在与手术区域分开的准备区进行手术前准备。 - 在手术台上准备好下列已适当消毒的手术器械 材料表.
- 使用无菌纱布和氯己定消毒剂对最终手术区域进行消毒，从切口部位开始，以鱼骨状模式向两侧扩展清洁。
- 用氯己定消毒剂重复此操作三次，然后使用酒精氯己定重复该操作。
- 用无菌手术巾完全覆盖动物，若手术巾无预开窗口，则使用剪刀在手术巾上剪出一个约10 × 20 cm²的矩形开口。
- 将手术巾覆盖在倒数第二对腹股沟乳腺上，使用4个巴考夹将手术巾固定在动物皮肤上。
- 使用手术刀切开皮肤，形成一条长约10 cm的切口。
- 使用止血钳和/或2号可吸收缝线实现皮下血管的止血。
- 用手指或精细尖头剪刀分离皮下组织，加深切口以到达目标位置 白线 在腹部肌肉组织中。
注意：触诊腹部正中线，可感觉到腹白线为较坚韧且呈纤维性的区域；观察腹直肌的分离情况，并在解剖过程中注意组织质地的变化，以识别该结构 白线 准确地11. - 用艾利斯钳夹住肌肉组织并提起，进行穿刺切开 白线 用手术刀。
- 将示指插入切口以评估有无粘连。使用钝头/钝头或精细/钝头剪刀，沿中线白线向尾侧和头侧小心延长切口，注意避免损伤其他器官及深层结构。
- 切口长度应足以使术者的一只手能够进入腹腔，以定位并牵出子宫角和/或卵巢。可使用Gosset拉钩以方便进入腹腔，并在手术结束时便于将肌肉层单层缝合。
- 如果一侧子宫角位于卵巢前方，应轻柔地沿其走向追踪至子宫角尖端及同侧卵巢。在此过程中，需评估子宫内是否存在液体，因为液体可能影响妊娠。
- 找到卵巢后，轻轻牵拉并小心暴露。评估是否存在排前卵泡、出血性黄体、周期性黄体和白体，以判断后备母猪的同步化是否符合预期。
- 轻柔地移除覆盖卵巢的输卵管伞部，外翻其黏膜，并找到输卵管的开口。
注意： 如果术者难以辨认输卵管伞端的开口，可使用圆体缝合针在输卵管壶腹部创建一个口袋，注意避免刺破血管，以便插入含有胚胎的Tomcat导管。 - 将装有胚胎的Tomcat导管小心插入输卵管伞部的开口，直至到达输卵管壶腹部。
- 将1 mL注射器连接至Tomcat导管，将含有胚胎的液体推入输卵管。用伞部覆盖卵巢，并将其放回腹腔。
- 找到对侧子宫角和卵巢，重复步骤 2.17–2.21。
- 将腹腔内的结构复位，并加入1 L预热至39 °C的生理盐水或乳酸林格液，以预防粘连，然后开始关腹缝合。
- 用2号可吸收缝线缝合腹部肌肉组织 "X" 间断缝合（Sultan）
- 使用2号可吸收缝线，以连续水平褥式缝合法缝合皮下组织。
- 使用2号尼龙缝线行间断单纯缝合、外科缝钉或乙基氰基丙烯酸酯粘合剂关闭皮肤。在本操作中，我们选择使用粘合剂。
- 用浸有双氧水的纱布清洁手术伤口，并用敷料擦干，以增强手术粘合剂在伤口上的固定效果。涂抹利福霉素或皮尔逊软膏，覆盖纱布，最后使用手术粘合剂。
注意：伤口应保持闭合并覆盖敷料5天。
3. 术后护理
- 根据Luna等人提出的评分标准12，至少在术后连续3天内评估动物是否出现特征性临床疼痛表现。
注：该评分标准基于猪在不同疼痛程度下表现出的不同行为，如姿势、与环境的互动和兴趣、活动能力、食欲以及对受损区域的关注程度。每项评估参数的评分范围为0至3分。评估结束后，各项得分的总和反映动物所经历的疼痛强度，其中0分表示无疼痛，18分表示剧烈疼痛12。 - 作为术后护理，每天一次通过肌肉注射（臀部或颈部肌肉）给予15 mg/kg剂量的阿莫西林和0.4 mg/kg剂量的2%美洛昔康，连续使用3天，以预防疼痛、炎症反应和感染。
注：若动物在所用疼痛评分量表（评分范围0–18）上的得分大于或等于6分，则需在抗炎药和抗生素基础上，额外每天一次肌肉注射（臀部或颈部肌肉）5,000 mg/头的安乃近。或者，按照当地IACUC指南规定的镇痛方案进行镇痛处理。 - 术后第6天，去除手术粘合剂，使用浸有2%酒精氯己定溶液的纱布清洁伤口，并局部涂抹Pearson软膏，持续至第10天，此时建议拆除缝线或手术钉（如使用过）。
4. 妊娠的超声诊断
- 在胚胎移植手术后30天，使用超声设备（频率范围为4.5至8.5 MHz）进行经腹妊娠超声评估。
- 将超声耦合剂涂抹于探头，并将其置于腹股沟腹部区域附近，探头朝向内侧。
注：由于子宫腔内有液体存在，可观察到圆形无回声的胚胎囊泡，提示妊娠。若未观察到宫腔内液体，或 虽有宫腔内液体但未能清晰显示胚胎囊泡，则提示未发生妊娠。
5. 动物安乐死
注意： 对超声检查中未见符合妊娠周期大小和形态的胎儿的后备母猪实施安乐死。
- 使用40 mm × 12 mm针头，将15 mg/kg的氯胺酮和2 mg/kg的咪达唑仑抽入连接静脉输液装置的同一支50 mL注射器中，作为麻醉前用药，经肌肉注射至外耳道后方颈区的斜方肌部位。
- 用20 G导管穿刺耳缘静脉，以4 mg/kg剂量静脉推注丙泊酚进行麻醉诱导，直至出现心动过缓（遵循机构批准的操作规程）。
- 随后，静脉注射10至20 mL的19.1%氯化钾溶液。通过观察呼吸运动消失、黏膜苍白、角膜反射消失，并用听诊器置于心脏区域确认心音消失，以判定心肺停止。
- 从剖检后的雌性动物中采集任何类型的宫内内容物（胚胎组织、液体或黏液分泌物）13，送检进行微生物学分析以检测可能的病原体，必要时也用于克隆的基因型鉴定。肉眼检查黄体是否存在、卵巢囊肿、异常分泌物，以及子宫、卵巢和输卵管是否存在粘连14。
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结果
本文旨在演示将克隆胚胎移植至后备母猪输卵管的剖腹手术。所有动物在整个手术过程中均保持适当的麻醉状态，麻醉恢复期间未发生任何术中意外或并发症。后备母猪在手术结束后平均需要 2–3 小时才能站立。
所有外科手术平均持续44分钟。共对9头青年母猪进行了手术，每头母猪平均移植185个克隆胚胎， bilateral共移植1,664个胚胎（表1）。卵巢的定位、暴露以及将含有胚胎的Tomcat导管插入输卵管漏斗部，是手术过程中最关键的步骤。术中对所有青年母猪的卵巢进行了检查，均可见近期排卵后的出血性卵泡，这与所实施的发情同步化方案预期结果一致，该方案旨在排卵后不久即进行胚胎移植。所有手术均无术中并发症发生。
术后未见任何动物出现剧烈疼痛迹象，每头手术母猪在术后3天内每日疼痛评分（评分范围为0～18）分别为0.33、0.33、3.67、1.33、0.33、1.33、4.67、2.00和0.33表 2）。仅1头手术母猪在术后12天出现皮下液体积聚（血清肿）th
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讨论
已有其他研究团队在进行克隆猪或基因修饰克隆猪研究时采用过本研究所描述的手术方法，并有实施该技术后成功分娩的报道15,16,17,18,19,20。自2017年以来，利用不同细胞系产生的体细胞核移植（SCNT）胚胎，其妊娠率和分娩率约为20%–30%（共264次移植），平均每窝产仔数为3.2 ± 0.4头3,21。该技术效率较低的原因涉及多种因素，包括受体母猪所用的同步化方案、受体母猪与移植胚胎发育阶段之间的同步性、胚胎移植部位、用于SCNT的卵母细胞及所获得胚胎的质量、供核体细胞的质量及其细胞周期阶段，以及移植胚胎的数量
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披露
所有作者均声明不存在利益冲突
致谢
我们感谢巴西圣保罗大学兽医学院（FMVZ/USP）的马科动物兽医医院和反刍动物兽医医院、圣保罗研究基金会（FAPESP，资助号 2022/11459-3）、EMS Pharma 公司、国家科学技术发展委员会（CNPq，资助号 405254/2022-9）以及位于巴西圣保罗州伊图市的 Água Branca 猪场。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25 mL 吸管 | generic | - | 外科材料 |
| 1 mL 注射器 | Descarpack | 341001 | 外科材料 |
| 10 mL 注射器 | Descarpack | 324601 | 外科材料 |
| 20 mL 注射器 | Descarpack | 324801 | 外科材料 |
| 3 mL 注射器 | Descarpack | 324201 | 外科材料 |
| 5 mL 注射器 | Descarpack | 324401 | 外科材料 |
| 60 mL 注射器 | Descarpack | 323201 | 外科材料 |
| 9 mm 气管插管 | Rusch | 112482-000090 | 外科材料 |
| Allis 止血钳 | generic | - | 外科器械 |
| Amox LA | JA Saúde Animal | MAPA 注册号: 8.781/2004 | 药品 |
| Bakhaus 止血钳 | generic | - | 外科器械 |
| 20G 导管 | Descarpack | 362401 | 静脉通路导管 |
| Cetamin | Agener União | MAPA 注册号: SP-000292-5.000011 | 麻醉剂 |
| 导电临床凝胶 | RMC | ANVISA 注册号: 80122200013 | 外科材料 |
| 安乃近 D-500 | Zoetis | MAPA 注册号: SP0000728-46 | 药品 |
| 一次性手术刀片 22 号 | Wiltex | ANVISA 注册号: 10150470565 | 外科器械 |
| 一次性无菌海绵刷 | Rioquimica | 7.89778E+12 | 外科无菌 |
| Easy-Scan:Go | IMV | ESCG01 | 超声设备 |
| Endozime AW Plus | Ruhof | 34514 | 外科器械清洗剂 |
| 芬太尼 (Fentanest) | Cristália | ANVISA 注册号: 1029800810159 | 麻醉剂 |
| Gosset 牵开器 | generic | - | 外科器械 |
| Halstead-蚊式止血钳 | generic | - | 外科器械 |
| 愈合软膏 - Unguento Pearson | Pearson SA | MAPA 注册号: SP0000094-16 | 药品 |
| 过氧化氢溶液 | Rioquimica | ANVISA 注册号: 218690015 | 外科材料 |
| 异氟烷 | Biochimico | ANVISA 注册号: 100630222 | 麻醉剂 |
| 静脉输液延长管 | generic | - | 液体治疗 |
| 大滴速静脉输液器 | Descarpack | 410301 | 液体治疗 |
| Lactofur (头孢噻呋) | Ourofino SA | MAPA 注册号: SP0000051-50 | 药品 |
| 喉镜 | - | - | 外科器械 |
| Maxicam 2% | Ourofino SA | MAPA 注册号: SP0000051-69 | 药品 |
| 微孔胶带 5 cm x 10 cm | generic | 1530 | 外科材料 |
| 咪达唑仑 | Hipolabor | ANVISA 注册号: 1134301430035 | 麻醉剂 |
| 多通路静脉输液器 | Descarpack | 413201 | 液体治疗 |
| 针头 40 mm x 1.2 mm | Descarpack | 353601 | 用于注射药物和麻醉剂的无菌针头 |
| 针头 40 mm x 1.6 mm | Wiltex | ANVISA 注册号: 10150470664 | 用于注射药物和麻醉剂的无菌针头 |
| 持针器 | generic | - | 外科器械 |
| 尼龙 2 号缝合线 | Shalon Medical | N502CTI40 | 外科材料 |
| 普通笔 | generic | - | 用于记录的普通笔 |
| 0.9% 生理盐水 500 mL 袋装 | JP Farma | MS:1.0491.0070 | 液体治疗 |
| 聚乙醇酸 2 号缝合线 | Atramat | G4099-75H | 外科材料 |
| 氯化钾 | Samtec | ANVISA 注册号: 1559200010139 | 肠外用药 |
| 检查手套 | Descarpack | 122401 | 个人防护装备 (PPE) |
| 丙泊酚 (Provive) | União Química | ANVISA 注册号: 1049714490057 | 麻醉剂 |
| 乳酸林格液 500 mL 袋装 | JP Farma | MS:1.0491.0061 | 液体治疗 |
| Riohex 0.5% 氯己定酒精溶液 | Rioquimica | 218690356 | 外科无菌 |
| Riohex 2% 含表面活性剂氯己定溶液 | Rioquimica | 218690356 | 外科无菌 |
| 头皮穿刺针 21G | Descarpack | 421201 | 外科材料 |
| 鞋套 | generic | - | 个人防护装备 (PPE) |
| 无菌敷料 | Cremer | ANVISA 注册号: 10071150065 | 外科材料 |
| 无菌纱布垫 | Procitex | ANVISA 注册号: 80245210083 | 外科材料 |
| 无菌手术单 140 cm x 90 cm | Venkuri | 7010003 | 外科材料 |
| 无菌手术单 150 cm x 190 cm | PolarFix | F00208 | 外科材料 |
| 无菌外科手套 | Mucambo | CA: 39.317 | 个人防护装备 (PPE) |
| 听诊器 | generic | - | 外科设备 |
| 手术帽 | Descarpack | 93201 | 个人防护装备 (PPE) |
| 手术衣 | Descarpack | 231101 | 个人防护装备 (PPE) |
| 外科口罩 | Descarpack | 110701 | 个人防护装备 (PPE) |
| 钝头-钝头手术剪 | generic | - | 外科器械 |
| 锐头-锐头手术剪 | generic | - | 外科器械 |
| 外科缝合器 | Tradevet | - | 外科材料 |
| Tekbond 超强胶 | Tek Bond | 78072720030 | 外科材料 |
| 体温计 | generic | - | 外科设备 |
| 三通旋塞阀 | Solidor | 374 | 外科材料 |
| 盐酸曲马多 | Agener União | MAPA 注册号: SP-000292-5.000002 | 麻醉剂 |
| 透明薄膜敷料 | Skinupper | ANVISA 注册号: 82307460014 | 外科材料 |
| 防水胶带 10 cm x 4.5 cm | generic | 364828 | 外科材料 |
参考文献
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