利用质谱技术对人类脑类器官进行分子成像

摘要

开发了一种用于脑类器官质谱成像（MSI）的先进方法，可实现对这些模型内代谢物分布的图谱绘制。该技术有助于揭示早期发育及疾病过程中脑部的代谢通路和代谢物特征，有望加深对人类脑功能的理解。

摘要

脑类器官模型是研究人类大脑发育和功能的有力工具。质谱成像（MSI）是一项前沿技术，能够在无需特异性分子探针的情况下，对这些类器官内多种分子（如脂质、糖类、氨基酸、药物及其代谢物）的空间分布进行图谱绘制。高质量的MSI数据依赖于精细的样品制备。固定剂在此过程中起着关键作用，但传统的固定剂（如戊二醛、多聚甲醛）以及用于冷冻保护的蔗糖等可能无意中影响组织中的代谢物。理想的固定方法是液氮速冻。然而，对于小型类器官而言，更合适的方法是将类器官直接从培养箱转移至预热的包埋液中，随后在干冰冷却的乙醇中冷冻。另一个关键步骤是在冷冻切片前进行包埋，该步骤同样需要与MSI兼容的材料，因为传统试剂可能干扰基质沉积和离子化过程。本文介绍了一种针对人类脑类器官的高分辨率基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）优化方案，涵盖样品制备、切片及质谱成像全过程。该方法能够以高质荷比准确性和灵敏度展示小分子代谢物（如氨基酸）的分子分布。因此，结合脑类器官的其他互补研究，该技术有助于揭示调控早期大脑发育、代谢细胞命运轨迹以及特异性代谢物特征的复杂过程。此外，它还能提供分子在类器官内精确定位的信息，从而加深我们对三维脑类器官模型空间组织结构的理解。随着该领域的持续发展，预计未来将有越来越多的研究利用MSI深入探索脑类器官及其他复杂生物系统，进一步推动对人类大脑功能与发育中代谢层面的理解。

引言

类器官模型源自原代组织干细胞、胚胎干细胞或诱导性多能干细胞（iPSCs）^1,2,3，通过提供高度模拟器官特异性功能的三维模型，推动了人类生物学研究的发展，有助于人类发育、疾病机制及药物发现的研究^4,5。在此背景下，解析脑类器官的复杂性对于理解生理和病理状态下的脑发育至关重要^6,7，这需要质谱成像（MSI）等技术的支持^8,9。与传统质谱技术不同，MSI能够在单个组织切片中直接、无需标记地绘制数百至数千种生物分子的分布图，无需特异性分子探针即可提供脂质、肽段、氨基酸、药物及其代谢物等分子空间分布的详细信息^10,11。此外，MSI获得的分子图像可与组织学染色和免疫组化切片共定位，从而全面呈现组织形态、细胞特异性和分子组成。

质谱成像（MSI）在类器官研究中具有重要意义，可提供关于疾病分子基础、基因型-表型关系以及对环境刺激响应的深入见解^12,13,14,15。在制药行业中，MSI有助于在临床前模型中分析药物的吸收、分布、代谢和排泄过程^11,16。此外，它还可用于鉴定具有药理活性的生物转化代谢产物¹⁷。

在质谱成像（MSI）方法中，基质辅助激光解吸/电离（MALDI）、解吸电喷雾电离（DESI）和二次离子质谱（SIMS）占据主导地位^{9,18,19,20,21}。其中，MALDI-MSI 因其多功能性、宽质量范围、直接分析能力以及与多种组织特异性化学物质的兼容性而尤为突出²²。然而，尽管具有潜力，MALDI-MSI 在脑类器官研究中的应用仍鲜有探索。为弥补这一空白，已提出一种针对脑类器官的高分辨率 MALDI-MSI（HR-MALDI-MSI）分析的定制化实验方案，以优化组织保存、基质选择和成像条件，确保可靠地获取高质量数据¹⁵。该详细方案展示了 HR-MALDI-MSI 的能力，为研究人员提供了有力工具，可更深入、前所未有地探索类器官的代谢图谱。

方案

该方案的整体流程如图1所示。材料表中列出了本研究中所用试剂和设备的详细信息。

1. 脑类器官切片制备

1. 按照先前发表的文献方法^23,24，利用诱导性多能干细胞（iPSC）制备脑类器官（培养30-60天时大小为2-3 mm），并使用宽口吸头在所需时间点收集类器官。
   1. 在室温下用不含CaCl₂和MgCl₂的1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）清洗制备好的类器官三次，以去除培养基残留，随后在室温下迅速用蒸馏水冲洗，以去除DPBS中的盐分。
2. 通过搅拌并加热明胶（10 mg溶于100 mL DPBS中）于70-80 °C条件下持续2小时，制备来自冷鱼皮的10%明胶溶液，然后将溶液转移至37 °C培养箱中孵育30分钟，以去除气泡并使其温度与类器官培养环境一致。
   注：建议每次实验均新鲜配制明胶溶液，但如有需要，也可在4 °C保存最多1周。明胶在室温下会凝固，使用前需加热使其融化，以便作为包埋液使用。
3. 用小吸头将类器官固定于塑料模具（25 mm × 20 mm × 5 mm）中央，缓慢倒入10%明胶包埋液，直至类器官完全浸没（模具约填充一半）。
   1. 将模具置于含有冰冷100%乙醇的培养皿中，并放置于干冰上，快速冷冻1-2分钟。当完全冻结（颜色变为均匀白色）后，取出类器官-明胶块，用铝箔包裹或放入密封的锡杯中，防止水分浓缩，并于−80°C保存，直至进行冷冻切片。
4. 进行冷冻切片时，将含有类器官的塑料包埋块置于-20 °C至-25 °C的冷冻腔内，平衡10-15分钟，使其温度与腔内一致。使用冷冻切片机将类器官切成14 µm厚的切片，并贴附于氧化铟锡涂层载玻片（ITO载玻片）上，用于质谱成像（MSI）。
5. 可立即在质谱仪中扫描结构均匀的切片，或将其密封于容器中，于-80°C保存以备后续研究使用。

2. 基质制备及在基质辅助激光解吸电离质谱成像中的应用

1. 对于基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI），需将载玻片喷洒并用基质覆盖组织切片，基质是一种有助于不同代谢物离子化的有机化合物²⁵。不同分子种类的成像需使用不同的基质；因此，首先必须选择最适合本研究的基质。
   注意：本研究重点关注与线粒体代谢通路相关的小分子代谢物和氨基酸的定位与分布，因此相应地选择了基质（如需进行脂质成像，请参见 Cappuccio 等人¹⁵）。
2. 首先，将 ITO 载玻片从 -80 °C 取出后，立即放入干燥器中静置 20 分钟，以最大限度减少大气水分在表面凝结。
3. 配制盐酸萘乙二胺（NEDC），该基质适用于小分子代谢物，因其可在 m/z 500 Da 以下产生目标分析物的强信号，同时不干扰背景信号²⁶。在载玻片干燥后，使用加热气动喷雾器将 10 mg/mL 的 NEDC 甲醇溶液（70% 甲醇）喷洒至类器官切片上。
4. 设定基质喷雾仪参数如下：喷嘴温度 = 75 °C，喷嘴移动速度 = 1,250 mm/min，泵流速 = 100 µL/min，喷雾次数 = 8 次，轨道间距 = 2.5 mm，气体流速 = 3 L/min，干燥时间 = 10 秒，氮气压力 = 10 psi。

3. 基质辅助激光解吸电离质谱成像仪器

1. 为实现高分辨率 MALDI-MSI 平台以可视化脑类器官代谢物，将带有双离子漏斗接口的 MALDI 离子源安装至质谱仪上。
2. 使用波长为 349 nm、重复频率为 1 kHz、脉冲能量约为 1.3–1.4 µJ 的 Q 开关、三倍频 Nd 激光器。
3. 为避免过度采样，将激光聚焦至直径约 15 µm 的光斑尺寸。
4. 将样品固定于 MALDI 注入器载物台上。使高压离子漏斗工作并维持在 7.4–7.5 Torr，低压离子漏斗维持在 1.6–1.8 Torr。
5. 分别对高压和低压离子漏斗施加 604 kHz、80 V₀-峰值和 780 kHz、191 V₀-峰值的射频电压。
6. 为提高低质量范围内小分子代谢物的检测灵敏度，将 MALDI-MSI 源中低压和高压漏斗的射频振幅分别降低至约 20% 和 15%。
7. 将质量分辨率设为 70,000。在 MALDI 注入器软件中选择待测区域及像素尺寸（25 µm/像素）。

4. MALDI-MSI 数据采集与数据分析

1. 在负离子和正离子模式下采集 m/z 范围为 80-900 的数据。对 14 µm 器官样体切片以每像素 25 µm 的横向分辨率进行样品扫描。
2. 将质谱仪的离子注入时间设置为 250 ms，并在自动增益控制（AGC）关闭的情况下以轮廓模式采集傅里叶变换质谱（FTMS）数据²⁶。
3. 使用 NEDC 基质峰作为内部在线质量校准，使质量精度优于 ±5 ppm。
4. 使用兼容软件处理数据。将质谱成像（MSI）谱图数据直接导入软件，然后使用卷积算法进行基线校正，并采用总离子流计数（TIC）对数据进行归一化。
5. 利用 Δm/z = 0.01 或 ±5 ppm 的质荷比区间宽度，从原始数据文件生成离子图像特征列表，以基于质量缺陷和像素覆盖率区分不同的 m/z 图像。
6. 从单个代谢物离子种类生成伪彩色（Jet）或 RGB（红-绿-蓝）图像。将从 MALDI-MSI 获得的原始数据文件的 m/z 列表上传至人类代谢组数据库（HMDB）（质量容差 <5 ppm，相对于理论 m/z 值），以鉴定代谢物。
   注：同时利用 LC-MS/MS 数据获得的代谢物精确质量、预测分子式及结构，查询代谢组学数据库（如 HMDB、Metlin），用于代谢物的比对与鉴定。

结果

以下方案通过质谱成像技术（MSI）优化了分子（代谢）成像（图1，另请参见 Cappuccio 等人¹⁵）。经连续切片的组织学染色验证，使用来自冷水鱼皮的10%明胶包埋可实现最可靠的数据结果和最佳的组织形态保存。利用鱼源明胶包埋60天的人脑类器官，通过MSI对三羧酸循环相关代谢物进行成像，展示了其空间分布特征（图2）。

总体而言，优化后的方案始终能够获得可靠的结果，其中以冷鱼皮来源的10%明胶作为首选包埋材料，并对NEDC基质喷涂参数进行了精细优化以提高图像分辨率。在脑类器官中检测到的小分子代谢物为理解该组织的分子复杂性提供了重要见解。

图1人类脑类器官代谢组学研究的一般流程 由个体成纤维细胞衍生的类器官 通过 诱导性多能干细胞用于液相色谱-质谱联用和质谱成像，以揭示代谢物的空间分布。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图 2：Krebs 循环相关代谢物的定位图谱。 使用来自健康对照组的 60 天类器官，通过质谱成像（MSI）技术鉴定并分析 Krebs 循环相关代谢物的分布。图中显示了苏木精和伊红染色结果。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

针对人脑类器官的高分辨率基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）优化方案，系统性地完善了关键实验步骤，以确保结果的可靠性。样本保存至关重要，为避免组织开裂和损伤，本方案提出一种替代性冷冻方法，即采用预热的包埋液与干冰冷却的乙醇进行冷冻。该方法特别适用于微小尺寸的组织，例如人脑类器官¹⁵。应避免使用最佳切削温度（OCT）包埋剂和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）等包埋材料，因其会干扰基质沉积与离子化过程。相反，推荐使用来自冷鱼皮的10%明胶作为最优包埋溶液，其在冷冻切片过程中可有效维持组织完整性¹⁵。此外，基质的选择及其沉积技术（如干法喷涂）对于减少低质荷比（m/z）小分子代谢物的位移并提高成像分辨率具有关键作用。

该方案的稳健性和可靠性已通过成功检测和可视化人脑类器官中多种分子得到证实¹⁵，从而提供了关于这些分子空间分布及其潜在生物学意义的宝贵见解。这些发现显著加深了对脑类器官内复杂分子图谱的理解，阐明了支撑大脑发育与功能的关键信号通路和代谢过程。

尽管当前数据为多种物种的定位提供了新的见解，但本研究中使用的Spectroglyph MALDI成像源尚未达到单细胞水平的分辨率（目前约为~10-20 µm）。其他平台，如布鲁克的timsTOF和沃特世的MRT，可在5 µm实现单细胞分辨率，因此在实验中需充分考虑所选用的仪器。

尽管存在这些限制，脑类器官的高分辨率HR-MALDI-MSI仍具有巨大潜力。该技术能够绘制类器官内代谢物和脂质分布图谱，为代谢相关的细胞命运轨迹、通路以及对类器官发育和成熟至关重要的特异性分子特征提供独特的研究视角。该方法架起了传统组织学与分子分析之间的桥梁，有助于深入理解基因组、表型组与环境响应之间的相互关联。

综上所述，人脑类器官高分辨率基质辅助激光解吸电离质谱成像（HR-MALDI-MSI）的优化方案为研究类器官模型的科研人员提供了一项重要工具。该方法通过细致优化关键步骤、提供故障排除策略并明确其局限性，为深入阐明脑发育与功能背后的分子复杂性奠定了基础。随着质谱成像技术的不断发展和日益普及，该技术有望推动我们对人类早期发育、疾病建模及药物发现的理解。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(1S,2S)-1,2-二-1-萘基-乙二胺二盐酸盐	Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	1052707-27-3	基质辅助激光解吸电离质谱用基质物质， ≥99.0%（HPLC）
1× 杜尔贝科’磷酸盐缓冲液（DPBS）	美国 Life Technologies	14190-144	不含 CaCl2 和 MgCl2
ART宽孔带滤芯吸头	美国马萨诸塞州赛默飞世尔科技公司	2069G	降低潜在污染风险
冷冻模具	Tissue-Tek	25608-916	标准模具，平面表面
Entellan	Fisher Scientific	M1079610500	盖玻片
伊红Y	Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）	E511-25	认证生物染色剂
鱼明胶	Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	G7041	来自冷水鱼皮的粉末形式
苏木精	Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）	517-28-2	经认证的生物染色剂 高压成像光源
HTX M5+ 喷雾器	HTX Technologies LLC，美国卡里		基质喷涂仪
铟锡	哈德逊表面技术公司	PL-IF-000010-P25	为基质辅助激光解吸电离成像提供导电表面
MALDI 离子源	Spectroglyph LLC，美国		双离子漏斗接口
甲醇	Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）	67-56-1	HPLC 级
氧化铟锡（ITO）导电–包被载玻片	美国纽约
猪明胶	Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	G1890	来自猪皮的粉末形式
Q-Exactive 质谱仪	赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州		高分辨率质谱法
SCiLS Lab 软件	2024a 版本 Pro		用于数据处理
水	Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）	W6500	HPLC 级
	（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）