基于量子点纳米珠的荧光侧向流免疫分析法

摘要

本文介绍了一种量子点纳米微球（QDNB）的制备方法，以及利用基于QDNB的侧向层析免疫检测试纸条检测疾病生物标志物的方案。检测结果可在15分钟内通过紫外光照射进行定性判读，或使用荧光试纸条读数仪进行定量测定。

摘要

量子点（又称半导体纳米晶体）是用于生物成像和传感的新型荧光标记物。然而，通过繁琐的纯化步骤制备的尺寸较小（约10 nm）的量子点-抗体偶联物，在使用侧向流动免疫层析试纸条检测某些痕量疾病标志物时，灵敏度有限。本文介绍了一种采用一步乳化蒸发法制备量子点纳米微球（QDNB）的方法。利用所制备的QDNB，构建了一种荧光侧向流动免疫分析方法，并以C-反应蛋白（CRP）为例检测疾病生物标志物。与单个量子点纳米粒子不同，量子点纳米微球-抗体偶联物由于在一个聚合物复合微球中包封了数百个量子点，实现了信号放大，因而作为免疫分析标记物具有更高的灵敏度。此外，QDNB较大的尺寸有利于在与抗体偶联时进行更简便的离心分离。基于QDNB的荧光侧向流动免疫层析试纸条被成功制备，可在15分钟内完成样本中CRP浓度的检测。检测结果可在紫外光照射下进行定性评估，并在15分钟内使用荧光读板仪进行定量测定。

引言

侧向流动免疫分析（LFIA）试纸条是现场快速检测的关键工具^1,2，尤其在疫情流行期间的疾病筛查中具有重要作用。然而，传统的胶体金基LFIA试纸条检测灵敏度较低，且仅能提供定性结果³。为了提高LFIA的检测灵敏度，多种新型纳米颗粒被开发应用，包括彩色乳胶颗粒^4,5、上转换荧光纳米颗粒⁶、时间分辨荧光微球^7,8以及量子点^9,10,11。量子点（QDs）^12,13，又称半导体纳米晶体，具有可调的发射波长、宽广的激发范围和高发光效率，是生物成像的理想标记物。

然而，单个量子点发出的荧光信号仍然较弱，导致免疫分析中的检测灵敏度相对较低。将大量量子点封装于微球内可实现信号放大，提高基于量子点的免疫分析的灵敏度。已有多种方法被用于将量子点封装在微球内部，例如层层自组装法^{14,15,16,17,18}、溶胀法^19,20以及二氧化硅微球封装法^21,22,23,24。例如，可通过增加每个夹心免疫反应中量子点的负载量来制备量子点功能化的二氧化硅纳米球标记物²⁵。此外，已有研究使用配备超声雾化器的喷雾干燥器制备纳米级QD-BSA纳米球²⁶。然而，上述方法存在步骤复杂、荧光猝灭以及产率低等缺点。

在我们之前的研究²⁷中，报道了一种通过乳液-溶剂蒸发法将量子点封装于聚合物纳米微球内的方法。该制备技术操作简便，能够保持量子点的荧光效率，确保高封装效率，并易于实现规模化生产。已有多个研究团队成功利用通过该方法制备的量子点纳米微球开发了侧向流动免疫分析试纸条，并将其应用于食品毒素检测^28,29,30、传染病生物标志物检测^31,32以及环境监测³³等领域。

本方案介绍了量子点纳米珠（QDNB）的特定制备步骤、QDNB与抗体的偶联、基于QDNB的侧向流动免疫分析（LFIA）的制备，以及人血浆样本中C反应蛋白（CRP）的检测。

方案

本研究经上海皮肤病医院机构审查委员会批准（编号：2020-15）。所有涉及人血样本的实验操作均在生物安全二级实验室中进行。本研究所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 量子点纳米微球的制备

注意：量子点纳米珠的合成采用乳液-溶剂蒸发法，油相与水相的比例为1:5。微乳液的制备如下 通过 超声处理后，通过溶剂（氯仿）蒸发使纳米微珠固化。使用氢氧化钠催化纳米微珠表面酸酐基团的水解，将其转化为羧基。

1. 油相和水相溶液的制备
   1. 制备1 mL油相：0.4 mL聚（苯乙烯-共-马来酸酐）（PSMA）溶液（50 mg/mL），0.1 mL量子点（QDs）溶液（100 mg/mL），用氯仿补足体积至1 mL。
   2. 制备5 mL水相：十二烷基硫酸钠（SDS）水溶液（0.5 wt %）。
2. 乳液的制备与固化
   1. 将1 mL油相和5 mL水相加入一个样品瓶（15 mL）中，并将样品瓶置于磁力搅拌器上。开启磁力搅拌器电源。
   2. 待油相和水相完全混合后，立即将样品瓶转移至程序设定的超声处理仪中（60 s，3 s脉冲后接3 s暂停，50%振幅），并开启电源。
   3. 观察超声处理后的溶液。初始呈深红色的溶液转变为具有红调的乳光相态。
   4. 将样品瓶 重新放回磁力搅拌器，在室温下持续搅拌过夜。氯仿逐渐挥发，乳液固化形成复合纳米微球。
3. 纳米微球的表面修饰
   1. 向纳米微球悬浮液中加入0.1 mL 0.1 mM氢氧化钠溶液，反应1 h。纳米微球表面的酸酐基团水解为羧基。
4. 纳米微球的纯化
   1. 关闭磁力搅拌器，将固化的纳米微球转移至离心管中。在室温下以13523 × g 离心10 min，弃去上清液。
   2. 向沉淀中加入初始体积的去离子水，盖上管盖，将其浸入超声水浴中，并保持浸没状态直至沉淀完全分散。
   3. 重复步骤1.4.1–1.4.2两次，最后将纳米微球转移至玻璃瓶中。4 °C保存备用。
5. 纳米微球的表征
   1. 采用透射电子显微镜（TEM）成像对量子点纳米微球的尺寸和形貌进行表征²²。
      注：通过改变量子点溶液与PSMA溶液的比例可获得不同尺寸的纳米微球。量子点纳米微球的尺寸也可通过动态光散射（DLS）测定²⁷。

2. QDNB-抗体偶联物的制备

1. 羧基活化
   1. 将100 µL已配制的QDNB（10 mg/mL）加入200 µL磷酸盐缓冲液（PB，20 mM，pH 6.0）中，然后加入6 µL EDC（20 mg/mL）。
   2. 在室温下于旋转混合仪中孵育混合物30分钟。
   3. 孵育结束后，在室温下以13523 × g 离心10分钟，弃去上清液。
   4. 向沉淀中加入100 µL PB（20 mM，pH 6.0），盖上管盖，并将离心管浸入工作中的超声水浴中，直至沉淀完全分散。
2. 抗体与纳米珠的偶联
   1. 将100 µg抗体分散于200 µL PB（20 mM，pH 6.0）中，并将步骤2.1中获得的活化QDNB悬液加入抗体溶液中。
   2. 在室温下持续旋转孵育混合物30分钟。在室温下以6010 × g 离心5分钟以去除未结合的抗体，然后小心弃去上清液。
3. 纳米珠的封闭
   1. 向残余物（步骤2.2.2中获得）中加入200 µL 1%酪蛋白溶液（溶于20 mM PB缓冲液，pH 7.4），盖上管盖，并将离心管浸入工作中的超声水浴中，直至残余物完全分散。
   2. 在室温下持续旋转孵育混合物2小时。
      注：此步骤的目的是封闭QDNB表面未反应的位点。
4. 偶联物的保存
   1. 向混合物中加入100 µL保存液（20 mM PB缓冲液，pH 7.4，1% BSA，5%海藻糖，6%蔗糖，0.1% S9，pH 7.4），于4 °C保存以供后续使用。

3. 侧向流动免疫测定试纸条的制备

注意：免疫层析试纸条由硝酸纤维素（NC）膜、样品垫、结合物垫、吸收垫和聚氯乙烯（PVC）板组成（图1）。所有溶液应现配现用。建议在湿度可控的洁净室中制备侧向流动免疫分析试纸条。

1. NC 膜的制备
   1. 配制检测线（T 线）和质控线（C 线）包被液：用 PB 缓冲液将 CRP 捕获抗体和羊抗兔 IgG 稀释至终浓度为 1 mg/mL。
   2. 将 PVC 板妥善放置，并移除距 PVC 板边缘 25 mm 处的保护纸。将 NC 膜沿剩余保护纸的下边缘对齐并粘贴至 PVC 板上。
   3. 以 1 µL/cm 的点样速率将 T 线和 C 线包被液点样到 NC 膜上，确保其距离上边缘 20 mm，形成一条宽度为 1 mm 的检测线。
   4. 将 NC 膜置于湿度低于 30%、温度范围为 18–26 °C 的条件下干燥，干燥时间应不少于 24 小时。
      注意：确保 NC 膜的上下边缘与相邻区域的对应边缘对齐。不得用手直接接触 NC 膜。此步骤中的湿度应控制在 45% 至 65% 范围内。在进行下一步前，T 线包被液、C 线包被液和 NC 膜应平衡至相同温度。
2. 结合物垫的制备
   1. 将结合物垫浸入结合物垫处理液（20 mM PB 缓冲液，pH 7.4，1% BSA）中。
   2. 将浸透的结合物垫置于干燥烘箱中，在室温下过夜干燥。
   3. 将修饰后的结合物垫轻轻粘附到 PVC 板上。
   4. 用保存液（20 mM PB 缓冲液，pH 7.4，1% BSA，5% 海藻糖，6% 蔗糖，0.1% S9，pH 7.4）稀释已制备的 QDNB-抗体结合物溶液。
   5. 以 1 µL/cm 的点样速率将 QDNB-抗体结合物溶液点样到结合物垫上，并将结合物垫干燥 24 小时。
      注意：具体的稀释比例应根据检测目标进行调整。
3. 样品垫的制备
   1. 将样品垫浸入样品垫处理液（20 mM PB 缓冲液，pH 7.4，1% BSA，5% 海藻糖，6% 蔗糖，0.1% S9，pH 7.4）中。
   2. 将浸透的样品垫放入干燥烘箱（45 °C）中干燥 24 小时。
4. 卡片组装及切割成条
   1. 如图 1所示，依次将吸水纸（吸水垫）、结合物垫和样品垫放置在带有 NC 膜的 PVC 板上。
   2. 将卡片切割成宽度为 3.8 mm 的试纸条。
5. 试纸条的包装
   1. 将试纸条装入塑料卡壳中，并密封含有干燥剂的铝箔袋。

4. 检测操作与定性评估

注意：涉及人血样本的操作建议在生物安全二级实验室中进行。人血浆样本来自临床实验室（来源于去身份化的人类受试者）。通常使用EDTA真空采血管采集人血，并按照标准方案³⁴分离血浆。在室温下以3,000 × g离心10分钟以分离血浆。用移液器收集上层黄色血浆，置于1.5 ml离心管中，于-80 °C保存备用。

1. 取10 µL血浆样本或校准液，加入含0.1% Tween 20的1 mL PBS缓冲液中。然后，将100 µL稀释后的样本转移至试纸条的样品垫上。
2. 反应15分钟后，在紫外光照射下观察T线和C线的荧光信号，以获得定性结果。
3. 将试纸条插入荧光侧向流动检测仪，获取荧光强度用于定量分析。
   注：本示例采用夹心免疫分析法^35,36；一条红线（对照线）表示阴性结果，两条红线（检测线和对照线）表示阳性结果。若对照线未出现，则表明该检测无效。

结果

QDNB的制备流程如图1A所示。将含有量子点（QDs）和聚合物的氯仿油相与水相混合，通过超声处理得到微乳液。随后通过氯仿的逐步挥发使乳液固化。QDNB的透射电子显微镜（TEM）图像见图2A。QDNB呈球形形貌，根据TEM图像中50个QDNB的测量结果，其平均直径为96 nm。在纳米微球内部可清晰观察到量子点纳米颗粒，表明封装成功。图2B和图2D分别为QDNB的荧光光谱和吸收光谱。

采用碳二亚胺化学法将QDNB与抗体偶联，如图1B所示。利用QDNB-抗体偶联物制备基于QDNB的侧向流动免疫分析试纸（LFIA）。LFIA的结构如图1C所示。若样本中存在C反应蛋白（CRP）抗原，QDNB-抗CRP偶联物将在检测线处富集。

如图3所示，通过将100 µL稀释后的样品加入样品孔中进行检测。反应15分钟后，可在紫外光照射下定性读取检测结果。定量结果可通过荧光试纸条读取仪获得，并利用试纸条读取仪软件中内置的校准方程计算样品浓度^37,38。

图 1：基于量子点纳米珠的荧光侧向流动免疫分析示意图。（A）量子点纳米珠（QDNB）的制备流程。（B）QDNB-抗体偶联物的原理。（C）基于QDNB的侧向流动免疫分析法（LFIA）检测C反应蛋白（CRP）的原理。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：QDNB 的表征。（A）QDNB 的透射电子显微镜（TEM）图像。比例尺：100 nm。（B）QDNB 的荧光发射光谱。（C）QDNB 的吸收光谱。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：CRP侧向流动免疫分析的操作流程。（A）检测原理示意图。（B）基于QDNB的LFIA试纸条在紫外光下检测0–30 mg/L范围内CRP样本的实物照片。（C）用于结果定量的荧光读数仪。（D）定量结果的实物照片。（E）采用逻辑变换结合线性回归法检测C反应蛋白（CRP）。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

本文介绍了一种量子点纳米珠（QDNB）²⁷的制备方法，以及利用QDNB制备荧光侧向流动免疫分析（LFIA）的方法。文中展示了对样本中C反应蛋白（CRP）进行定性和定量检测的应用。这种基于QDNB的LFIA还可用于其他疾病生物标志物^25,32、食品毒素^29,30、病毒^16,27等多种目标物的检测。

本方案中的关键步骤是QDNB及QDNB-抗体偶联物的制备。应优化QDNB的粒径以及纳米微珠中的量子点含量，以获得在侧向流动免疫分析（LFIA）中荧光信号强且背景信号低的QDNB。捕获抗体与检测抗体配对对免疫分析至关重要，应从不同供应商中筛选出最佳匹配的抗体对。抗体与QDNB的偶联条件需要优化，包括抗体/QDNB比例、缓冲液pH值以及封闭试剂的选择。具体而言，应通过优化偶联过程中的缓冲液pH值、盐浓度和反应时间，避免QDNB和抗体发生聚集。

与其他量子点纳米微球制备方法相比，本方案具有操作简便、易于操作和高产率的优点。此外，聚合物复合纳米微球具有生物相容性，而二氧化硅纳米微球通常需要额外的聚合物表面修饰。然而，采用本方案制备的量子点纳米微球（QDNBs）的单分散性不如采用聚合物¹⁹或二氧化硅²¹模板纳米微球制备的产品。QDNBs的粒径通常在70 nm至200 nm之间。

基于量子点纳米球（QDNB）的侧向流动免疫分析（LFIA）试纸条的制备方法与其他荧光LFIA类似。由于量子点（QDs）具有高量子产率以及QDNB具有信号放大效应，采用本方案的QDNB基LFIA比其他基于荧光微球的LFIA（如时间分辨荧光微球和荧光素微球）更灵敏。此外，QDNB的稳定性优于传统的荧光素，使基于QDNB的LFIA具有更长的保存时间。

然而，量子点表面的镉容易与蛋白质中的巯基在水环境中发生螯合。避免使用高浓度蛋白质对于基于QDNB的侧向流动免疫分析的稳定性至关重要。镉具有毒性，在某些情况下其使用受到限制，因此需要制备具有高量子产率和稳定性的无镉量子点。

综上所述，本文提供了一种一步法制备量子点纳米微球的多功能方法，且该方法可扩展用于工业化生产。利用所制备的量子点纳米微球，构建了用于疾病生物标志物定性与定量检测的荧光侧向流动免疫分析试纸条。适用于侧向流动免疫分析的理想量子点纳米微球应为粒径较小、包载大量量子点且无荧光淬灭的纳米微球。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(二甲氨基)丙基-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐	Sigma-Aldrich	03450
吸水纸	金碧生物技术	CH37K
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	B2064
酪蛋白	Sigma-Aldrich	C8654
CdSe/ZnS量子点	苏州迈世莱特科技有限公司	CdSe/ZnS-625
氯仿	国药集团化学试剂有限公司	10006818
CRP抗体	海思特生物科技	4C28
荧光侧向层析检测仪	苏州赫尔门斯精密仪器有限公司	FIC-H1
玻璃纤维垫	金碧生物技术	SB06
羊抗兔IgG	生工生物工程	D111018
硝酸纤维素膜	Satorious	CN140
聚（苯乙烯-马来酸酐）共聚物	Sigma-Aldrich	S458066
兔IgG	生工生物工程	D110502
十二烷基硫酸钠	国药集团化学试剂有限公司	30166428
氢氧化钠	国药集团化学试剂有限公司	10019718