开发用于评估精神病学动物模型中前脉冲抑制和神经活动的行为框

Summary

该协议提供了一个基于微控制器的行为框，通过从框下方的传感器收集加速度数据来评估前脉冲抑制 （PPI）。该数据评估了社会孤立大鼠的感觉门控缺陷，并增加了一种将数据与神经元活动同步的方法，以推进行为障碍的神经生理学研究。

Abstract

早期生活痛苦被认为是神经发育障碍的潜在前兆。在动物模型中研究这种情况的一种方法是断奶后社会隔离。啮齿动物的这种早期生活痛苦已被证明会导致类似于精神分裂症患者观察到的神经变化，包括前额叶皮层体积减少、树突棘密度降低和腹侧被盖区多巴胺能活动增加。前脉冲抑制 （PPI） 范式是评估人类和动物模型中感觉门控缺陷的成熟方法。PPI 是指当惊吓反射之前有较弱的声学预刺激（例如 65 dB 脉冲）时，对较强的声学刺激（例如 120 dB 脉冲）的惊吓反射的抑制。这种现象在精神病患者和精神疾病的动物模型中通常会减少。本文介绍了一种为 PPI 研究构建行为框的协议，从而能够使用可访问的、具有成本效益的精神分裂症动物模型，并将行为框与模型中的神经元记录（例如，电生理记录）同步。这种定制的行为框有效地检测了惊吓反应，并促进了 PPI 评估，同时在断奶后隔离后行为自由的啮齿动物中进行神经元记录。

Introduction

被诊断患有精神分裂症 （SCZ） 的个体通常表现出感觉运动缺陷。这些患者经常报告对感觉刺激的反应降低和难以从不同的感觉输入中辨别相关信息 ^1,2。对于健康的人来说，在较强的刺激之前传递较弱的刺激会减少通常对较强刺激的惊吓反射³。这种现象被称为前脉冲抑制 （PPI），已用于研究 SCZ 患者和 SCZ⁴ 动物模型的感觉门控缺陷。

在声学 PPI 任务中，将对单个强声脉冲（例如，~120 dB）的惊吓反应与在短间隔（30 到 500）中在同一刺激之前有较弱的刺激（例如，~65 dB）时的惊吓反应进行比较^3,4。在健康个体中，当出现较弱的前脉冲时，对脉搏的惊吓反应会减弱（与单独对单个强脉搏的惊吓反应相比）。这种现象在 SCZ 患者中被破坏，即使较弱的前脉冲出现在强脉冲之前，他们对惊吓反应的抑制也较小 ^1,5,6,7,8。

与 SCZ 患者类似，中脑边缘多巴胺过度活跃的大鼠也表现出声学 PPI⁹ 降低，使该范式成为研究精神分裂症动物模型中行为和生理改变的有用工具。通常，用于 PPI 的商业设备包括一个声室，其中包含传感器、扬声器和用于设置实验参数（例如，脉冲间间隔和刺激强度）、记录啮齿动物的惊吓反应和处理数据的软件。但是，商业系统通常提供有限的自定义选项并且成本高昂。构建灵活研究设备的 DIY （DIY） 方法正在增加对设备和知识转移的访问¹⁰.用于研究 PPI 等感觉运动门控机制的 DIY 解决方案必须考虑几个关键因素，以确保有效性和可靠性。一些基本考虑因素包括设计规范、环境和光线控制、声音衰减、刺激传递系统、行为测量传感器以及数据采集和分析。

已经针对不同的功能开发了行为框的 DIY 解决方案，例如作性舔舐实验¹¹、听觉辨别任务^{12 和前}肢功能¹³。尽管有几种 DIY 方法侧重于视频跟踪¹⁴，但这种类型的数据需要大量的计算资源来分析。开源硬件和软件平台可用于构建低成本的 PPI 行为盒，具有测试定制实验^15、16、17 的灵活性，并同步自由行为动物的神经元记录。

本文介绍了一种开发行为盒以评估 PPI 的方法，该方法使用低成本平台来研究断奶后隔离大鼠模型，这是一种导致 SCZ 样症状发展的早期压力，该模型也可以与同步脑电生理记录一起使用。

Protocol

动物试验按照《实验动物护理和使用指南》进行。该项目已获得 CEUA Santos Dumont 研究所伦理委员会的批准（批准号 04/2016）。对于 PPI 测试，在 PPI 盒中单独评估了 35 只 Wistar 大鼠 （3 个月大，290-490 g;19 只雄性和 16 只雌性）。所有 35 只大鼠都接受了断奶后隔离方案，将它们单独饲养在 12/12 小时的光照循环下，温度为 23 °C，湿度为 70%，受控设施可 随意 获取食物和水。 材料表中提供了研究中使用的试剂和设备的详细信息。

1. PPI 盒

1. 制作一个长 25 厘米、宽 20 厘米、高 25 厘米的亚克力透明盒子，以保持一只行为自由的老鼠和有线头台。这个高度对于防止大鼠逃跑和保持头部自由和安全以进行神经元记录很重要。
   1. 使用自粘橡胶垫将亚克力盒与外部机械振动（例如，带有其他设备的实验室工作台）隔离开来，并将加速度计固定在盒子下方，而不会与其他部件（例如，工作台或电线）发生物理接触。
      注意：根据任务要求（例如，鼠标、大鼠、狨猴）调整透明亚克力盒的大小。
2. 将带状电缆 （26 AWG） 直接焊接到加速度计板的四个引脚孔中：VCC（电压）、GND（接地）、SCL（串行时钟）和 SDA（串行数据）。清洁亚克力的中心和加速度计的平面面板。使用氰基丙烯酸酯胶或环氧树脂将加速度计牢固地固定在亚克力盒下方。
   1. 等到它完全固化（图 1）。将带状电缆的另一端连接到微控制器，如下所示：VCC 到 3.3V、GND 到 GND、SCL 到 SCL （I2C SCL） 和 SDA 到 SDA （I2C SDA）。将加速度计固定在盒子下方，不要与其他部件（例如工作台或电线）进行物理接触。
      注意：DYI 加速度计和微控制器有多种品牌。微控制器和加速度计的尺寸和类型取决于预期用途和盒子尺寸/规格。考虑每次测试后的清洁程序，如果需要，在焊点和电路上涂上一层电子清漆，以隔离并防止意外飞溅到加速度计金属部件上。为了进行比较，DYI 加速度计和商用加速度计并排放在盒子下方。
3. 使用 80 毫米厚的中密度纤维板 （MDF） 制作一个带有前门和边缘的隔音室 15 厘米。用声学泡沫衬垫盒子的内部。将扬声器放置在亚克力盒上方 20 厘米处，以便头部和电缆可以自由移动。
   1. 通过商用音频检测器将计算机音频输出连接到微控制器板（模拟输入和 GND）和扬声器，该检测器接收来自扬声器的声学刺激并生成 TTL（晶体管-晶体管逻辑）事件标记以同步行为和神经元数据（图 2）。
      注意：根据实验要求构建一个声学室（例如，考虑需要摄像头、额外的灯光和扬声器）。使用电阻分压器（例如 10 kΩ 和 10 kΩ 电阻）将计算机音频保持在 0-5 V 的微控制器模拟输入范围内。商用音频检测器设备接收音频输入并发送 TTL（晶体管-晶体管-逻辑）作为计算机发送的每个声学刺激的刺激开始标记（0-0.4 V 被视为低状态，2.8-5 V 被视为高状态）。通常，电生理系统具有母 BNC 输入端口，用于接收 TTL 或模拟信号（例如，听力刺激）。
4. 使用 USB 数据线将微控制器板连接到计算机。打开 microcontroller board 的集成开发环境软件。
   1. 选择相应的 微控制器板、 COM 端口和 波特率。打开文件 sketch，编译并将代码上传到微控制器板。单击 监视器串行端口 以检查传入数据。关闭开发环境软件。
      注意： 通过 USB 将微控制器板连接到计算机时，会为其分配一个 COM 端口。在Windows控制面板中打开设备管理器，然后点击 端口 （COM & LPT）以查看微控制器分配的COM端口（COM号码）。COM 编号必须与开发软件 COM 端口设置匹配。https://github.com/neurodeveloperISD 中提供了草图的示例。
5. 将数字声杆计放在动物在盒子中的同一位置。在门关闭的情况下检查暗室中的背景噪音。播放声刺激并调整声级计的检测范围（30-80 dB 或 80-130 dB），以校准计算机发送的声刺激级。
   注意：根据实验方案，可以使用首选的开源语言（例如 Python）创建不同的刺激序列。在本研究中，使用随机前脉冲和脉冲组合呈现 68 dB 白噪声 7 min。将文件导出为波形文件和预脉冲/脉冲组合的序表，以便进行离线分析。
6. 打开首选的开源软件程序以获取和保存串行端口数据。配置 COM 端口、微控制器板和波特率。单击 connect （连接 ） 以读取原始数据或图表。单击 Save 开始记录实验的数据。
   注意：有开源软件可以记录串行端口（例如 CoolTerm、Python）和市售软件（例如 Matlab）。
7. 在放置动物之前，确保每个组成部分（刺激传递、反应检测）都正常工作。验证刺激的时间和顺序（根据所选的 PPI 协议）。检查加速度计响应的准确检测和记录。
8. 收集并分析响应数据以评估 PPI 效果（步骤 5）。使用统计工具解释结果并评估感觉运动门控缺陷。

图 1：加速度计牢固地安装在行为框下方。 该图显示了一个低成本的加速度计板（左）和一个高端商用加速度计（右），用于数据比较。加速度计必须牢固地连接到亚克力盒上，并且扁平电缆必须连接到亚克力上，以避免因清洁程序和动物更换而损坏它。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：基于微控制器的集成行为盒。 示意图显示了丙烯酸盒中的大鼠，其有线头台连接到大脑电生理记录系统。连接到微控制器的盒子下方的加速度计将三轴加速度计数据发送到计算机，并获取激励触发标记以进行离线数据处理。扬声器播放噪声背景和声音脉冲，从而触发加速度计数据的标记。麦克风获取声学刺激以与电生理数据同步（例如，在任务期间获取发声行为）。 请单击此处查看此图的较大版本。

2. 大鼠断奶后分离程序

1. 断奶后立即（出生后第 17^{至 21} 天）将大鼠的幼崽隔离在各个笼子中，并将它们隔离在出生后至少 90 天。
2. 使用既定方案^18,19 在出生后 90 天后进行神经外科微电极阵列植入。
3. 术后 7-10 天后进行 PPI 任务（参见第 4 步）。

3. 电极阵列脑植入手术程序

1. 微电极阵列必须事先消毒（本研究使用了 32 根直径为 50 μm 的钨丝， 图 3A）。将动物置于异氟醚麻醉（5% 在 0.5 L/min O₂ 中，遵循机构批准的方案）的隔离箱中。
2. 从盒子中取出动物，用麻醉鼻锥（1% in 0.5 L/min O₂）将其保存在异氟醚麻醉下。肌肉注射阿托品 0.05 mg/kg。使用消毒液用薄片剃掉动物的头部。5 分钟后，以 70 mg/kg 腹膜内注射氯胺酮，以 3 mg/kg 肌肉注射甲苯噻嗪。
3. 在可吸入异氟醚（1%-5% in 0.5 L/min O₂）下，将动物置于 37 ± 0.2 °C 的多轴立体定位装置中的加热垫上。插入直肠传感器来控制加热垫，并插入直肠传感器以监测 PO₂ 饱和度和心率。确保血氧饱和度高于 95%，心率在 200-300 bpm 之间。
   注意：在整个手术过程中观察这些参数，并在必要时调整异氟醚浓度。
4. 将无菌眼用润滑剂涂抹在动物的眼睛上，并用无菌手术单覆盖动物。
   注意：在无菌条件下进行以下所有外科手术。
5. 打开动物头部区域的手术区域，并使用缝合线 （4-0） 将其与皮肤固定。将 20% 利多卡因皮下涂抹在动物的颅骨上，并在头部皮肤上做纵向切口 （~1.5 cm），然后切除颅骨膜。用过氧化氢清洁骨表面。
6. 将前囟和 lambda 对齐在同一水平面上，以提高开颅手术的准确性，尤其是在从多个大脑区域记录时（这项研究记录自腹侧被盖区、杏仁核、伏隔核、海马体和前额叶皮层， 图 3B）。
7. 用机器人钻头标记钻孔位置，并在开颅手术颅骨远处位置的分布位置插入 3 到 4 个螺钉，而不会穿孔硬脑膜（图 3C，D）。
8. 进行手动开颅手术¹⁹，使用牙钻以最大速度钻出开颅手术的周边，以瞄准大脑目标（图 3E）。
9. 去除骨头，用无菌盐水保留硬脑膜，然后去除硬脑膜。
   注意：注意提取硬脑膜的整个过程，以防止脑损伤，这可能会危及深度精度。
10. 将阵列的电极放在开颅手术位置，然后沿着电极阵列向下移动，直到最深的位置电极轻轻接触脑组织。使用电线将电极接地，放置在颅骨表面，围绕四个螺钉布置（图 3F）。
    注意：请参阅使用替代主题的动物模型¹⁹ 中神经外科植入物的培训。
11. 每 100 μm 插入一次电极，直到目标位置，并用牙科水泥固定，以保持连接器牢固地固定在颅骨上，远离皮肤。
    注意： 小心避免将牙科粘固剂掉落在脑组织或连接器针孔中。

图 3：微电极阵列植入物。 （A） 带有 32 根 50 um 钨丝的微电极阵列，用于前边缘和边缘下 PFC、VTA、AMY、NAcc 和 HIPC。（B） 大鼠头骨显示大脑靶标、前囟和 lambda。（C） 开颅手术和螺钉的钻孔位置。（D） 支撑微电极阵列植入物和开颅手术拉丝的螺钉。（E） 没有硬脑膜的颅骨开口。（F） 穿透大脑的微电极。 请单击此处查看此图的较大版本。

4. PPI 和神经元记录

1. 非常小心地将头部连接到大鼠头骨上的连接器植入物。
   注意：此步骤对于避免折断头部公连接器的微针或损坏头骨上的牙科丙烯酸至关重要。如果需要，可以将动物放在异氟醚麻醉（5% 在 0.5 L/min O₂ 中）的盒子中以帮助连接。使用麻醉连接头部时，请等待异氟醚洗掉，以免影响 PPI 行为和大脑活动。
2. 打开神经元数据采集系统，并确保它通过微控制器或连接到音频检测器或麦克风的 TTL 发生器接收来自声学刺激的数据。打开之前在步骤 1.6 中检查的串行端口开源记录器。
   注意：根据实验室设施的不同，这些同步程序可能会有所不同。
3. 开始使用电生理学采集软件采集电生理学（尖峰和局部场电位）和加速度计数据。
   注意：检查输入数据并调整增益设置，以避免削波信号或取消检测尖峰波形和尖峰检测阈值。根据记录系统和记录的数据，只能在在线模式下调整增益和阈值。确保正确指定低频信号 （LFP） 的滤波器设置（通常为 0.5 Hz 至 100 Hz）、高频（尖峰）（通常为 300 Hz 至 5000 Hz）和低频噪声（通常为 50/60 Hz），以便进行离线分析。
4. 将动物暴露在白色背景噪声 （~68 dB） 中 7 分钟，随机呈现所有类型的脉冲，每种脉冲 10 次（图 4）。 图 4 举例说明了本协议中使用的五种脉冲类型：脉冲 1（75 dB 前脉冲、30 ms 间隔和 120 dB 脉冲）、脉冲 2（85 dB 前脉冲、30 ms 间隔和 120 dB 脉冲）、脉冲 3（75 dB 前脉冲、100 ms 间隔和 120 dB 脉冲）、脉冲 4（85 dB 前脉冲、100 ms 间隔和 120 dB 脉冲）， 和脉冲 5（120 dB 单脉冲）。
5. 在录制会话结束时，关闭采集软件并断开 Headstage 连接器。

图 4：听觉刺激的类型。 随机呈现 7 分钟白噪声的插图会话，其中包含 5 种类型的前脉冲 + 脉冲组合。 请单击此处查看此图的较大版本。

5. 电生理和行为分析

1. 在信号处理平台中导入包含大脑数据、加速度和声学刺激的原始数据。提取以每个声学刺激为中心的 epoch。
2. 相应地对平均值进行标准化，以比较动物之间的值。使用单个脉冲（本协议中的脉冲 5）作为最大响应，并将对其他脉冲的反射标准化为该值。
3. 将脉冲 5 的惊吓幅度视为 100%，其他脉冲的惊吓幅度与脉冲 5 的函数关系。
   注意：使用三个加速度计轴的均方根 （RMS） 提取振幅（图 5A），以一组 n 值表示惊吓的大小（图 5B）。RMS 是一个数学公式²⁰，其中：
   
   AX = 加速度计 x 轴，ay = 加速度计 y 轴，az = 加速度计 z 轴
   t = 声刺激开始 plus 200 ms
   n = 集合值
   要计算与脉冲 5 相关的脉冲 1 到 4 的 RMS 惊吓百分比：
   
   RMS_脉冲 = 脉冲 1、2、3、4 的 RMSstartle
   RMS_pulse5 = 脉冲 5 的 RMSstartle
4. 使用发送到神经元数据采集系统的 TTL 来分析围绕声学刺激和反射反应的大脑数据。

图 5：三轴加速度计数据和 RMS。 （A） 在基线 6 分钟和随机白噪声 80 PPI 刺激期间记录说明性三轴加速度计（x、y、z 轴 （g））数据。（B） 从三个加速度计轴（x、y、z 突出显示的灰色列，在 B 中展开）进行 Startle RMS 计算。 请单击此处查看此图的较大版本。

Results

与脉冲 5 相比，脉冲 1 和 3 的前脉冲抑制显示没有差异（仅 120dB），但脉冲 2 和 4 显示统计差异 （p < 0.05）（图 6）。

图 6：五种脉冲中对听觉刺激的平均响应幅度。 脉冲 1 和 3 的 PPI% 与脉冲 5 没有差异。脉冲 2 和 4 的 PPI% （*） 与脉冲 5 不同。误差线表示标准误差。 请单击此处查看此图...

Discussion

该协议提出了一个 DIY 行为框，用于研究自由行为的 Wistar 大鼠的前脉冲抑制任务，同时记录大脑数据（在本例中，局部场电位和尖峰活动）。该盒子可以使用神经科学实验室中常见的组件构建和定制，因此易于使用且价格低廉。这种 DIY 解决方案还允许在设计和个性化实验方面具有更大的灵活性。

使用 DIY 系统可以观察到许多好处，包括低成本和易用性。开源软件和硬件允许构建和测试新协议，从而促进它们在各种应用程序中的使用。另一方面，缺点和局限性，例如与更先进的微控制器或单板计算机相比处理能力较低，可能会限制 DIY 系统在具有多个输入传感器（例如，具有高采样率的传感器）的更复杂和计算要求更高的应用中的使用。

就现有方法的重要性而言，该方法可以使用带有集成传感器和软件的自动启动室来重现商业系统的设置，用于数据收集和分析，并提供详细的分析，从而实现更一致和可靠的 PPI 测量。为了测试行为框的准确性，将来自这个开源行为框的数据与商业系统的加速度计数据进行了比较。基准测试显...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
亚克力盒	定制		5 毫米厚的亚克力板，20 厘米 x 25 厘米 x 25 厘米
粘性橡胶保险杠垫	大猩猩砂砾	MPU6050	直径 0.8 英寸，高度 0.38 英寸。橡胶垫可稳定亚克力盒并隔离外部振动。由于盒子下方有MPU6050，高度应大于 5 毫米。
Arduino 乌诺	阿杜伊诺 Arduino	ATmega328P	基于 ATmega328P 的 Arduino 微控制器板，具有 14 个数字输入/输出引脚、6 个模拟输入和 16 MHz 的时钟速度。
Cedrus 刺激追踪器（音频检测器）	雪松	https://cedrus.com/stimtracker/index.htm	Cedrus 刺激跟踪器检测声学刺激并将 TTL 标记发送到加速度计数据。
Cineplex 研究系统	丛子	https://plexon.com/plexon-systems/cineplex-behavioral-research-system/	记录动物与电生理数据同步的视频。
氰基丙烯酸酯胶		MPU6050	强力胶将MPU6050牢固地固定在盒子下方。
数字声杆计			分贝计用于校准实验前设置的刺激。
IBM SPSS	SPSS（美国社会科学统计软件包）		IBM SPSS Statistics 软件平台。
马特实验室	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	用于数据分析、算法开发和模型创建的 MATLAB 平台。
微型不锈钢螺丝			直径 1.2 毫米、长度 4 毫米的眼镜螺钉。
微电化物阵列	内部定制		它使用omnetics连接器和涂有加州细线聚对二甲苯的钨50微米线。
麦克风			麦克风用于获取与电生理数据同步的声学刺激。
MPU-6050型	英文感	https://invensense.tdk.com/products/motion-tracking/6-axis/mpu-6050/	MPU-6050是一款3轴陀螺仪和3轴加速度计。
多通道采集处理器	丛子	尖刺/磷酸铁锂电池	MAP Plexon 用于获取神经元电生理数据 SPIKE/LFP 和辅助通道（麦克风、TTL 标记、加速度计）。
神经探索者	Nex	https://www.neuroexplorer.com/	连续记录的信号和时间戳（尖峰列车、行为事件）的 NeuroExplorer 数据分析程序
神经探索者	Nex Technolgie	https://www.neuroexplorer.com/	用于SPIKE和LFP神经生理学数据分析的软件。
离线排序器	丛子	https://plexon.com/products/offline-sorter/#38957t34842	用于离线尖峰分选的软件。
离线排序器	离线排序器	https://plexon.com/products/offline-sorter/	离线排序器是一款离线尖峰排序软件
直肠兽医 SpO2 传感器	KTMED的	FS-03型	用于小动物的 SpO2 传感器
带状电缆			细带状电缆，用于将MPU6050连接到 Arduino。
机器人钻头	神经星	https://robot-stereotaxic.com/drill-injection-robot/	与 Neurostar 立体定位一起使用的机器人钻头。可以用手动钻头代替。
议长			扬声器的范围为 100 至 40 kHz，强度高达 150 dB。
立体定位装置	神经星		立体定向用于啮齿动物神经外科