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利用小肠和大肠单层界面技术推动牛类类器官的发展

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DOI：

10.3791/67010

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2024年6月14日

 ,  , 
1Department of Veterinary Microbiology and Pathology, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 2Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Washington State University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究介绍了一种从类器官生成牛肠道二维单层细胞的实验方案，为研究宿主与病原体相互作用提供了更便捷的途径。方案包括评估膜完整性和功能性的方法，推动了 体外 模拟牛胃肠道生理的模型。该方法有望带来重要的生物医学和农业效益，包括改进治疗策略。

摘要

推进对胃肠道生理学及其疾病的认识，在很大程度上依赖于精确的、物种特异性的研究方法的发展 体外 能够真实模拟的模型 体内 肠道组织。这对于研究牛体内宿主与病原体的相互作用尤为重要，因为牛是多种对公共卫生构成严重威胁的病原体的重要储存宿主。传统的三维类器官模型对肠上皮顶面的可及性有限，而二维单层培养技术的出现克服了这一障碍。这种二维培养模型由类器官细胞衍生而来，其腔面暴露，便于开展更便捷的研究。本研究介绍了一种详细的实验方案，用于建立和维持源自牛小肠与大肠类器官细胞的二维单层培养体系。该方法包括通过跨上皮电阻和旁细胞通透性检测评估膜完整性的操作流程，以及免疫细胞化学染色技术。这些方案为建立和表征二维牛源单层培养系统奠定了基础，拓展了该方法在具有重要公共卫生意义的生物医学与转化研究中的应用边界。采用这一创新性方法，可构建出具有生理相关性的 体外 用于研究牛肠道生理的正常与疾病状态的模型。这些研究对生物医学和农业进步具有深远意义，有助于开发更有效的牛肠道疾病治疗方法，从而提升动物福利和食品安全水平。

引言

三维（3D）培养肠道上皮干细胞，即肠道类器官，标志着一项重大进展 体外 用于研究肠道功能、营养及与病原体相互作用的技术1,2这些类器官模拟了复杂的结构 体内 通过自我复制并组织形成包含多种肠细胞谱系的三维结构来构建肠上皮3这一特性凸显了它们在推动肠道生物学研究进展方面的重要潜力。

将肠道类器官技术应用于农场动物的兴趣日益增长，这要求对培养和维持技术进行优化4,5。该技术的重要性在于其在研究农场动物肠道健康方面的潜在影响，而肠道健康在动物生产性能中起着关键作用，进而通过影响动物福利和运营成本，关系到食品动物产业的经济效益6,7。特别是，利用肠道类器官培养来探究牛的肠道功能尤为重要，因为牛是沙门氏菌（Salmonella spp.）和大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）O157:H7等动物源性肠道病原体的储存宿主8。这些病原体定位于肠道的特定节段，因此有必要根据不同肠道节段建立差异化的肠道类器官培养方法，以提高研究的精确性9。

肠道类器官研究中的一个重大障碍是难以接近上皮细胞的顶面10当细胞在细胞外基质（ECM）中培养时，会自然定向，使其基底面朝外，顶面朝内。10为解决这一挑战，本文介绍了一种将三维类器官解离为单细胞，并将其接种至半透性细胞培养小室中的方法。该体系可在细胞顶面与基底外侧区室之间建立界面。本方案证明，源自牛肠类器官的细胞能够形成结构完整的二维单层细胞层，跨上皮电阻（TEER）测量和细胞旁通透性检测结果为此提供了证据。此外，通过免疫荧光和电子显微镜观察，证实了类器官来源的二维单层细胞形成了具有刷状缘和紧密连接的细胞极性结构，反映了 体内 肠道上皮的特性

在本研究中，回肠代表小肠肠道，直肠代表大肠肠道。这些选择基于相关的肠道病原体，例如 沙门氏菌 spp.，可易位至回肠11，以及 E. coli O157:H7 被认为主要定植于直肠9 在牛中。选择这些特定的肠段突显了为实现研究精确性而针对不同肠道区域定制肠类器官培养方法的必要性。这些方法详细阐述了从这些肠段有效培养类器官来源的二维单层界面的操作流程，为研究牛肠道健康、病原体感染以及肠道微生物组与宿主之间的相互作用提供了可靠的模型。

方案

肠隐窝取自当地屠宰场的多余肠道样本，供体信息详见补充表1。类器官所用组织来源于在屠宰场人道安乐死的动物，未为本研究专门获取动物；因此，本研究免于接受IACUC审查，无需提供伦理声明。

1. 类器官来源的二维单层培养中细胞培养插件的细胞外基质包被

注意：所有操作均需使用无菌材料，并在生物安全柜中采用无菌技术进行。除非另有说明，所有试剂在操作过程中均需保持在冰上。

  1. 在微量离心管中，将基础培养基与2%（v/v）基于ECM的水凝胶充分混合，为每个0.33 cm2的细胞培养小室准备100 µL ECM包被液。
  2. 使用无菌镊子将单个细胞培养小室从包装中取出，并分别放入24孔透明平底细胞培养板的孔中。
  3. 将步骤1.1中制备的100 µL ECM包被液加入步骤1.2中准备好的每个细胞培养小室的顶室侧。
  4. 盖上盖子，将含有已包被ECM的细胞培养小室的培养板置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育1小时。
    1. 对于回肠类器官细胞，小室在孵育1小时后即可使用。对于直肠类器官细胞，在孵育1小时后，将ECM包被液替换为直肠单层培养基，并过夜孵育（表1）。若计划进行TEER测量，需额外准备用于空白对照的细胞培养小室。
回肠直肠
细胞外基质包被孵育时间1 h1 h，随后
 在单层培养基中过夜培养
补充剂
类器官培养基
CHIR99021
LY2157299LY2157299
Y-27632Y-27632
胎牛血清胎牛血清
细胞接种密度（细胞/孔）5 × 1053 × 105

表1：成年牛回肠和直肠类器官来源的二维单层细胞培养优化方案汇总。

2. 牛回肠和/或直肠类器官细胞接种与二维单层培养

注意：本节所述方案使用牛回肠和直肠类器官，这些类器官采用所述技术在48孔板中进行培养和维持5。为获得最佳结果，建议使用在初次建立后已稳定传代超过3次、且最近一次传代后已培养超过3天的类器官。

  1. 在不扰动含有成熟类器官的基于细胞外基质（ECM）的水凝胶穹顶的情况下，使用连接真空系统的 disposable 玻璃巴斯德吸管移除类器官培养基，并向每孔加入 300 µL 冰冷的 ECM 去聚合溶液。在 4 °C 下孵育至少 1 小时。
    注意：也可在加入 ECM 去聚合溶液后，机械破坏含有类器官的基于 ECM 的水凝胶穹顶，并在 4 °C 孵育前将悬浮液收集至 15 mL 圆锥形离心管中。当同一块培养板上同时培养不用于二维单层培养的类器官时，推荐使用此方法。类器官培养的密度显著影响接种至细胞培养插件所需的类器官培养孔数量。
    1. 对于高密度类器官培养（补充图 1A），直肠细胞培养插件采用 1:1 至 1:2 的接种比例，即一个培养孔可接种一至两个孔。对于回肠类器官，保持 1:1 的比例。相比之下，低密度培养（补充图 1B）需要更多的培养孔；每个直肠细胞培养插件使用 3–4 个直肠类器官培养孔（3–4:1 比例），每个回肠细胞培养插件使用 4–5 个回肠类器官培养孔（4–5:1 比例）。
  2. 目视检查基于 ECM 的水凝胶是否完全溶解，并将类器官悬浮液收集至 15 mL 圆锥形离心管中。
  3. 在 4 °C 下以 200 × g 离心 5 分钟，使类器官沉淀。弃去上清液。将沉淀重悬于 1 mL 含 10 µM Y-27632 的重组细胞解离酶溶液中。
  4. 将类器官悬浮液置于 37 °C 水浴中孵育 10 分钟，每隔 2–3 分钟用涡旋振荡器轻轻振荡 3–5 秒，以促进类器官有效解离。
  5. 酶消化完成后，加入 5 mL 基础培养基，并使用 P1000 移液器剧烈吹打，进一步将类器官解离为单细胞。检查悬浮液中是否存在类器官团块，若仍可见团块，则重复吹打以增强单细胞解离效果。
  6. 准备一个装有 70 µm 细胞筛网的 50 mL 圆锥形离心管。通过加入 1–2 mL 基础培养基预润湿筛网。
  7. 将细胞悬浮液经筛网过滤，以去除残留的基于 ECM 的水凝胶碎片和大块细胞团。用额外的 10 mL 基础培养基冲洗原始的 15 mL 管和 70 µm 细胞筛网。
    注意：若细胞悬浮液难以通过筛网，可能表明类器官解离不完全。可尝试将收集的细胞悬浮液再次通过同一 70 µm 筛网。必要时需进行额外的酶解或机械解离处理。
  8. 在 4 °C 下以 200 × g 离心 5 分钟，使单细胞悬浮液沉淀。弃去上清液，并用适量基础培养基重悬细胞，进行细胞计数。
  9. 使用血细胞计数板在台盼蓝染色后计数活细胞，以计算所收集的总细胞数。
  10. 在 4 °C 下以 200 × g 离心 5 分钟，使单细胞悬浮液沉淀。弃去上清液，并用适当体积的相应单层培养基重悬细胞，达到合适的接种密度（表 1）。
    1. 对于回肠类器官细胞，将细胞重悬至浓度为 2.5 × 106 个细胞/mL，以在 200 µL 回肠单层培养基中实现每个细胞培养插件接种 5 × 105 个细胞的密度。该培养基为类器官培养基添加 500 nM LY2157299、10 µM Y-27632 和 20% 胎牛血清（FBS）。
    2. 对于直肠类器官细胞，将细胞重悬至浓度为 1.5 × 106 个细胞/mL，以在 200 µL 直肠单层培养基中实现每个细胞培养插件接种 3 × 105 个细胞的密度。该培养基为类器官培养基添加 100 nM CHIR99021、500 nM LY2157299、10 µM Y-27632 和 20% FBS。
  11. 取出带有 ECM 包被的细胞培养插件的 24 孔细胞培养板，小心使用真空抽吸清空细胞培养插件的顶室，避免破坏包被层。
  12. 轻柔地将步骤 2.10 制备的 200 µL 单细胞悬浮液加入细胞培养插件的顶室。对于空白对照，在顶室中加入 200 µL 不含细胞的培养基。对于空白对照，在顶室中加入 200 µL 不含细胞的培养基。
  13. 向每孔的基底外侧室加入 500 µL 相应补充的单层培养基（根据回肠或直肠细胞类型而定）。
  14. 在 37 °C、5% CO2 的加湿培养箱中孵育，以促进细胞黏附和生长，从而在细胞培养插件上形成融合的二维单层细胞层。
  15. 从细胞接种后 48 小时开始，每隔一天更换顶室和基底外侧室的培养基。确保空白对照组与含细胞插件的孵育时间一致。

3. TEER 测量

注意：此处描述的方法使用一种 commercially available 的手动 TEER 测量系统，称为带有 Ag/AgCl 电极对的上皮伏特-欧姆计（图 1A）。测定 2D 单层细胞的 TEER 时，需测量空白孔。确保空白读数的测量方式与样品一致。

  1. 从培养箱中取出含有类器官来源的2D单层细胞及空白对照的细胞培养小室板，室温平衡约10分钟。
  2. 用70%乙醇对电极进行消毒，并使其完全干燥。
  3. 小心将电极插入，短端置于顶侧腔室，长端置于基底侧腔室（图1A）。
    注意：需格外谨慎，避免破坏细胞单层。
  4. 待读数稳定后，记录欧姆（ohm）值。
    注意：由于伏欧表的灵敏度较高，在测量电阻时欧姆值可能出现波动。当读数趋于稳定并在某一平台值附近持续波动时，即可获得可靠的测量结果。
  5. 使用以下公式计算2D单层细胞的经上皮电阻（TEER）：
    TEER (Ω × cm2) = 细胞培养小室的表面积 (cm2) × 净电阻值
    其中净电阻值等于细胞单层小室测得的电阻减去空白小室测得的电阻。24孔板用细胞培养小室的表面积为0.33 cm2。

静态平衡，TEER测量装置示意图，顶腔/基底外侧腔过程，数据图。
图1：牛肠道类器官来源的二维单层细胞上皮屏障完整性的评估。（A）用于TEER测量的细胞培养小室中顶腔和基底外侧腔内电极适当放置位置的示意图。短电极插入顶腔，长电极置于基底外侧腔，注意避免与膜接触。（B）通透性测定过程示意图。细胞培养小室用预温的PBS洗涤2次，将含有0.5 mg/mL 4 kDa FITC-葡聚糖示踪剂的PBS加入顶腔。在孵育期间，从基底外侧腔重复取50 µL等份样本，并补充等体积PBS，以维持基底外侧腔总体积不变。使用酶标仪测量所取样本的荧光强度，以定量4 kDa FITC-葡聚糖示踪剂穿过细胞单层的扩散情况。（C）利用TEER测量（空心圆代表回肠，空心方块代表直肠）和通透性测定（实心圆代表回肠，实心方块代表直肠），结合4 kDa FITC-葡聚糖示踪剂，评估回肠和直肠单层细胞随时间推移屏障完整性的动态发展。培养至第3天时，两类单层细胞均表现出稳定且具有功能的上皮屏障，其TEER值和通透性特征可作为证据。结果来自至少两次独立实验，每次实验设两个技术重复。误差条表示测量值的标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 细胞旁通透性检测

注意：本实验通过检测荧光素异硫氰酸盐（FITC）标记的葡聚糖在120分钟内从顶端腔室穿过二维单层细胞向基底外侧腔室扩散所产生的荧光强度来评估屏障功能（图1B）。为获得最佳结果，建议在实验过程中尽量减少光照暴露，并在每次取样后立即使用酶标仪进行测量，以防止荧光信号减弱或淬灭。每个孔仅能使用一次，不可在后续实验中重复使用。每次实验应至少设置2个孔作为技术重复。例如，为获得图1C所示的结果（在培养的第1、3、5天三个不同时间点分别进行双重复实验），共需要6个孔。

  1. 使用磷酸盐缓冲液（PBS）配制4 kDa FITC-葡聚糖的标准曲线稀释系列。每个稀释浓度取50 µL，重复三份加入96孔板中。
    注意：建议配制5–7个稀释浓度，范围为0至0.5 mg/mL。
  2. 使用预先校准的酶标仪，在激发波长495 nm、发射波长535 nm条件下测定各标准品的荧光强度。
  3. 根据荧光强度结果计算线性回归，绘制标准曲线。
  4. 从培养箱中取出含有类器官来源的2D单层细胞的细胞培养小室板。移除待测类器官来源2D单层细胞所在小室的顶腔和基底外侧腔中的培养基。
  5. 分别用200 µL（顶腔）和500 µL（基底外侧腔）预热的PBS轻柔清洗各腔室2次。
  6. 吸除顶腔中的清洗液，向细胞培养小室的顶腔加入200 µL含0.5 mg/mL 4 kDa FITC-葡聚糖示踪剂的PBS溶液。
  7. 在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育20分钟。
  8. 从孵育后的24孔板的基底外侧腔中取50 µL样品，转移至适用于酶标仪检测的96孔板中。
  9. 在取样的孔的基底外侧腔中补充50 µL新鲜PBS。
  10. 立即使用预先校准的酶标仪在激发波长495 nm、发射波长535 nm条件下测定荧光强度。
  11. 每20分钟重复步骤4.6–4.10，直至120分钟。实验结束时，若需保存2D单层细胞，可用新鲜PBS清洗顶腔和基底外侧腔各2次，更换为新鲜的单层细胞培养基后继续培养。
    注意：可对2D单层细胞进行进一步分析，如TEER测量、免疫荧光染色等；但不推荐，因残留荧光示踪剂可能干扰后续分析。
  12. 使用以下公式计算表观通透系数（Papp，单位：cm/s）：
    通透性公式 Papp，示意图显示溶质随时间的通量及浓度分析。
    ΔQ / Δt = 在特定时间内透过单层细胞进入细胞培养小室基底外侧腔的荧光示踪剂浓度，通过荧光强度测定并根据标准曲线换算为µg/mL
    A = 细胞培养小室的表面积
    Co = 加入细胞培养小室顶腔的荧光示踪剂浓度（单位：µg/mL）

5. 类器官来源的二维单层细胞的免疫荧光染色

  1. 用真空抽吸法移除细胞培养小室中的单层培养基，加入 200 µL 4% 多聚甲醛（PFA），室温孵育 15–30 分钟以固定细胞。
  2. 用真空抽吸法移除 PFA，加入 100 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 2 次。
  3. 加入含 0.3% Triton X-100 的 2% 牛血清白蛋白（BSA）PBS 溶液 100 µL，室温孵育 10 分钟以通透细胞。
  4. 用真空抽吸法移除上清液，加入 100 µL PBS 洗涤 2 次。
  5. 移除上清液，替换为含 2% BSA 的 PBS 溶液，室温孵育 1 小时以封闭非特异性结合位点。
  6. 移除上清液，加入用含 2% BSA 的 PBS 稀释的一抗溶液 100 µL，室温孵育 1 小时，或 4 °C 过夜。
    注意：所用一抗的浓度见材料表。除非另有说明，均按照生产商推荐条件进行。
  7. 移除上清液，加入 100 µL PBS 洗涤 3 次。
  8. 加入用含 2% BSA 的 PBS 稀释的二抗溶液 100 µL，室温孵育 1 小时，或 4 °C 过夜。
    注意：若使用的一抗已偶联荧光探针，则可省略此步骤。所用二抗的浓度见材料表。除非另有说明，均按照生产商推荐条件进行。
  9. 移除上清液，加入 100 µL PBS 洗涤 3 次。
  10. 可选步骤：如需对 F-肌动蛋白和细胞核（DAPI）进行复染，可将两种探针按生产商推荐比例分别稀释于 PBS 中，混合后加入 100 µL，室温孵育 30 分钟。随后移除上清液，加入 100 µL PBS 洗涤 3 次。
  11. 用手术刀片小心切下细胞培养小室的膜，将其置于载玻片上，加入封片液，加盖盖玻片后观察。

结果

该方案可从牛的小肠和大肠组织中稳定地生成具有较强功能的肠道类器官来源的二维单层细胞模型，模拟肠道的复杂性 体内 肠上皮。该方法利用在优化条件下培养的健康牛肠道隐窝组织发育而成的成熟类器官。有趣的是，由类器官衍生的二维单层细胞的成功且可重复的培养条件因肠道节段的不同而具有特异性。表1这进一步强调了为感兴趣的肠道区段建立优化培养技术的重要性。

在将解离的成熟类器官接种到细胞培养插件上1天后，出现了形成二维单层细胞的迹象（图2A）。然而，尽管外观如此，此阶段回肠和直肠单层细胞的TEER测量值仍然较低（图1C此外，细胞旁通透性检测显示，培养仅1天后，单层细胞即允许4 kDa FITC-葡聚糖示踪剂穿过细胞层。图1C）。到第3天rd 培养第1天时，两类类器官来源的二维单层细胞均表现出显著成熟，表现为跨上皮电阻值升高以及对4 kDa FITC-葡聚糖示踪剂的通透性降低，这一趋势持续至培养第5天。

尤其值得注意的是物种间的变异性：尽管在相似条件下，牛源类器官衍生的二维单层培养物的TEER值低于人和犬的对应样本12,13,14,15，但其膜完整性仍然保持完整。这一结论基于单层细胞在通透性实验中的适当反应，表明牛样本中的低TEER值并不一定反映屏障功能的缺失。这种完整性对于功能性上皮屏障至关重要，并可通过结合TEER测量结果对通透性实验数据进行仔细解读而有效证明。

通过扫描电子显微镜观察2D单层细胞的顶面，可见清晰的细胞边界和高度发育的微绒毛，显示出特化的微解剖结构，进一步证实了回肠和直肠类器官来源的2D单层细胞均实现了充分成熟（图2B）。此外，对2D单层细胞进行免疫荧光染色，证实了回肠（图3A）和直肠（图3B）类器官来源的2D单层细胞均存在顶面刷状缘、基底外侧黏附连接以及分泌黏液的杯状细胞。这些结果表明，所建立的2D单层细胞在组成和结构上具有复杂性，不仅表达了完整肠上皮的关键特征，而且由多谱系细胞群体构成。

成功的二维单层培养依赖于细胞对细胞外基质（ECM）的黏附以及生长至融合状态，以形成完整的上皮层。值得注意的是，在细胞培养小室中孵育期间，若ECM分布不均或培养条件次优，可能导致细胞层部分脱落，尤其在边缘区域更为明显（图4Ai）。如果细胞接种密度过高，或接种细胞在培养表面分布不均，则该问题会进一步加剧；这种情况通常源于类器官未完全解离为单细胞悬液。此类不均匀分布可导致单层内出现间隙和/或在细胞培养小室上发生三维形态发生（图4Aii）。相反，细胞接种密度过低也可能导致在预期培养周期内单层发育失败或延迟，从而间接影响后续利用二维单层系统开展研究的效率（图4Aiii）。此外，培养系统的污染也可能在单层内形成间隙，破坏原本已形成的融合单层，尤其在培养后期更为显著（图4Aiv）。即使此前未出现上述潜在失败原因，剧烈的清洗或操作技术仍可能扰动细胞层，从而影响跨上皮电阻（TEER）的稳定值及细胞旁通透性反应（图4B）。因此，在建立类器官来源的二维单层过程中，谨慎操作细胞并仔细评估单层的形成情况或可能的破坏，对于有效实施故障排除策略至关重要。

回肠和直肠组织样本；组织学和扫描电镜；细胞形态比较；可见标尺。
图 2：牛回肠和直肠类器官来源的二维单层细胞的显微表征。 （A）在细胞培养小室中培养第1天和第3天（D1和D3）的二维单层细胞的代表性相差显微镜图像。标尺 = 100 µm。（B）二维单层细胞的代表性扫描电子显微镜图像，左侧为较低放大倍数，右侧为较高放大倍数。在回肠（上）和直肠（下）单层细胞中均可清晰观察到细胞表面结构细节，包括微绒毛。左侧标尺 = 10 µm，右侧标尺 = 2 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示F-actin、E-cadherin和SNA定位的回肠和直肠细胞免疫荧光显微镜图像。
图3：源自回肠和直肠类器官的二维单层细胞的免疫荧光表征。（A, B）图（A）显示回肠类器官，图（B）显示直肠类器官。左侧图像中，用鬼笔环肽（红色）标记F-actin纤维，展示细胞骨架结构及顶膜刷状缘的形成；中间图像显示黏附连接蛋白E-cadherin（绿色）的基底外侧定位，提示细胞间黏附及单层结构的完整性；右侧图像通过SNA（绿色）识别黏液分泌性杯状细胞的存在，其中z轴层扫图像显示回肠单层细胞顶膜的黏液分泌情况。所有图像中的细胞核均用DAPI复染（蓝色）。此外，各图像的z轴层扫结果进一步证实了培养小室中形成单一细胞层的结构。比例尺 = 25 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示类器官形成阶段（i-iv）的组织学显微图像及5天内TEER图谱分析。
图4：亚优条件下二维单层细胞形成的表征。（A）代表性相差显微图像显示：（i）单层细胞在细胞培养小室边缘部分脱落；（ii）出现三维外延生长及单层内部形成间隙；（iii）由于接种密度低于最佳水平，导致细胞贴壁不均，表现为斑片状附着，从而造成单层形成不完全或延迟；（iv）在后期阶段，原本已形成的二维单层中出现间隙，可能由疑似污染引起。比例尺 = 100 µm。（B）第3天后TEER值下降，同时通透性升高，表明未能建立稳定且具有功能的上皮屏障。结果来自一次实验（设两个技术重复），以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：基于ECM水凝胶中牛肠类器官培养物的密度变化。 在基于ECM的水凝胶中培养的牛肠类器官；（A）高密度和（B）低密度。比例尺 = 100 µm。 请点击此处下载该文件。

补充表1：组织供体信息汇总。 请点击此处下载该文件。

讨论

肠道健康对牛的生产性能和整体健康至关重要16利用类器官衍生的二维单层技术，科学家现在能够更准确地在体外模拟牛肠道上皮的复杂结构 体外 设置5这种创新方法不仅重现了肠道内衬的多样化细胞组成，包括其多细胞谱系，还捕捉到了关键的功能特征，例如黏液分泌和微绒毛的存在，这对于理解肠道生理学和病理学至关重要。3回肠和直肠组织的定制化培养方案的建立，为研究牛肠道健康提供了一个先进的平台，显著提升了研究能力。这一复杂的方法能够深入探究人畜共患病原体与牛肠道环境之间的相互作用。该技术可精确模拟并研究牛肠道生态系统所具有的独特特征 体外 是开发针对性策略以改善家畜健康并减缓人畜共患病传播的重要一步。

然而，为了利用牛肠道类器官成功实现二维单层培养，关键在于维持类器官及其解离后的单个细胞的健康与活力。谨慎操作并尽量减少细胞应激对于保持细胞完整性和功能至关重要，而这些因素正是类器官有效生长以及后续形成功能性单层结构所必需的。此外，获得均匀的单层结构依赖于将类器官成功解离为单细胞，且避免形成大的细胞团块。此类团块会干扰细胞分布，破坏单层结构的完整性。因此，采用精确的解离技术至关重要，以获得均一的单细胞悬液。同时，在细胞贴壁过程中以及洗去未贴壁的多余细胞时，尽量减少干扰也十分有益。这一策略对于解决潜在的三维形态发生问题尤为重要，有助于全面提升单层培养的质量。

使用生物来源的细胞外基质（ECM）水凝胶时，一个显著的挑战是其成分存在批次间差异17。尽管在使用所述方案和材料时未观察到此类情况，但ECM成分的批次间差异可能会影响单层细胞的成功形成。当更换ECM产品、品牌或批号导致单层形成受损时，可能需要进行优化步骤，以确定用于包被细胞培养小室的合适ECM浓度。

此外，在进行任何操作前将培养基调节至室温，是减轻热休克、保护细胞健康以及维持类器官和单层培养物质量的关键步骤。在单层结构形成及其后续检测过程中，轻柔的洗涤操作对于维持单层完整性也至关重要，避免扰动可防止实验结果出现偏差。当反复洗涤或长时间暴露于PBS（如在细胞旁通透性检测中）导致单层脱落时，用Hank's平衡盐溶液（HBSS）替代PBS似乎有助于减少脱落现象。最后，根据来自肠道不同节段（如回肠和直肠）细胞的特定需求定制培养基，对于准确模拟这些区域的生理环境至关重要 体内 条件。这种特异性可确保细胞处于最佳健康状态和功能活性，有助于精确模拟牛肠道生理及其与病原体的相互作用，从而凸显了类器官研究中这些关键步骤的重要性。

除了采用轻柔的细胞操作技术外，掌握与细胞计数和跨上皮电阻（TEER）测量相关的熟练技术能力，对于成功构建功能性的二维单层细胞层至关重要。由于细胞计数过高或过低分别会导致接种密度过高或过低，进而影响单层细胞的正常生长。因此，当怀疑接种密度不准确时，建议仔细复查细胞计数结果，并确保接种密度适当。此外，不恰当的TEER测量技术可能导致电极意外划伤细胞层，从而破坏单层结构。将电极小心地插入顶端腔室，并特别注意保持其相对于膜表面的垂直方向，有助于降低意外损伤单层细胞的风险。

此处所述的细胞旁通透性检测方法已根据先前的实验方案进行了调整18对已报道方案的修改，包括在120分钟内进行多次取样，并以等体积的磷酸盐缓冲液（PBS）替换所取样品，旨在提高结果的准确性和可靠性。维持腔室内总体积恒定至关重要，原因如下：保持渗透压平衡、确保细胞完整性、维持准确评估通透性所必需的浓度梯度，并防止静水压改变而影响物质转运速率。通过补充与所取含荧光示踪剂PBS体积相等的新鲜PBS至基底外侧腔室，是维持上述条件的关键步骤，从而实现对单层细胞通透性的准确且有意义的评估。旁细胞通透性检测通过直接测定示踪分子穿过细胞单层的迁移情况，可作为跨上皮电阻（TEER）测量的补充手段。此外，由于多种因素（如温度、细胞类型、传代次数以及培养基成分等细胞培养条件）可能影响TEER数值，不同实验室之间的TEER值比较可能无法提供具有可比性的结果。19细胞旁通透性检测提供了一种功能性评估方法 体外 上皮屏障中黏附连接和紧密连接有效表达的评估20.

尽管从三维类器官开发出二维单层细胞培养技术代表了培养技术的重要进步，但有必要认识到二维单层培养系统所存在的局限性。其中一个主要缺点是，该系统仍为静态培养体系，缺乏体内所存在的动态刺激， 体内 环境。此外，由于该培养系统采用带盖培养板的开放式设置，调节系统内氧气含量存在困难，因此不太适合与厌氧菌进行长期共培养。这些局限性或许可通过采用更动态的培养平台（如微流控系统）加以解决。21，可提供更可控且更接近生理条件的环境。此外，必须认识到，尽管目前的培养条件富含有利于维持干细胞生长的营养成分，但这些条件可能并非诱导上皮细胞生理性分化的最佳选择。这一差异凸显了未来研究中亟需优化培养体系，以更精确地模拟生理环境 体内 条件并支持分化过程。通过解决这些局限性并优化这些方法，类器官培养技术的实用性和适用性得到提升，更接近于模拟胃肠道复杂的动态变化和相互作用 体外.

从牛回肠和直肠组织生成二维单层细胞的实验方案为研究人员提供了一种有价值的 体外 小肠和大肠上皮腔面界面模型。该模型为动物营养学基础研究的应用开辟了广阔前景，尤其适用于探究不同条件下营养物质的吸收机制。一个备受关注的研究领域是“肠漏综合征”（leaky-gut syndrome），其特征为胃肠道通透性异常升高，常由饮食改变和极端环境温度所诱发。22,23此外，该模型是研究肠道微生物组与其宿主之间复杂相互作用的重要工具，可用于探讨共生微生物如何影响宿主生物的健康状况，从而解决兽医学和医学科学中的一个关键问题。1,24此外，人类食源性病原体常作为共生菌存在于牛肠道的不同区段8,9,25该方案能够实现对这些人畜共患病原体在其特定生态位中繁殖所需具体条件的深入研究。

在整个研究过程中，观察到直肠和回肠类器官来源的单层细胞需要不同的条件才能成功发育。具体而言，当最初将直肠类器官来源的单层细胞接种至基础培养基中含2%细胞外基质（ECM）水凝胶、预处理1小时的细胞培养小室时，出现了较大的孔洞和细胞脱落现象。通过改用特制的直肠单层细胞培养基，并将孵育时间延长至接种前过夜，该问题得以解决；而回肠类器官来源的单层细胞则可通过较短的制备流程成功建立。此外，在培养基中添加CHIR99021 consistently 有助于直肠单层细胞的建立26，但对回肠单层细胞则非必需27。另外，回肠单层细胞的成功发育相比直肠类器官需要更高的细胞密度27。这些优化后的条件（表1）已多次成功建立具有稳定屏障完整性的单层细胞模型，凸显了根据不同肠道节段特性定制培养条件的重要性。

获得能够准确反映多细胞谱系复杂性的模型 体内 肠道对于这些研究至关重要。它使研究人员能够紧密模拟肠道环境的自然条件，为实验提供更可靠的依据。通过本方案，研究者将获得一个强大的模型，从而增强其研究能力，有望在各自研究领域取得突破性发现。该方法不仅有助于深入理解肠道健康与疾病，还为改善畜牧业管理和食品安全策略的制定提供支持。

披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

本研究部分得到了美国国立卫生研究院院长办公室（资助号：K01OD030515 和 R21OD031903，授予 YMA）以及华盛顿州立大学VCS研究生与博士后研究基金（授予 GDD）的支持。作者感谢参与研究的屠宰场提供供体牛只。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
基础培养基
Advanced DMEM/F12 (1X)Gibco12634-010n/a
GlutaMAX-I (100X)Gibco35050-0612 mM
HEPES (1M)Gibco15630-08010 mM
Pen Strep Glutamine (100X)Gibco10378-0161X
类器官培养基（基础培养基添加物）
A-83-01Sigma-AldrichSML0788-5MG500 nM
B27 Supplement (50X)Gibco17504-0011X
[Leu15]-Gastrin I humanSigma-AldrichG9145-.5MG10 nM
Murine EGFPeproTech315-09-500UG50 ng/mL
Murine Wnt-3aPeproTech315-20-10UG100 ng/mL
N-Acetyl-L-cysteineMP Biomedicals1946031 mM
N-2 MAX Media Supplement (100X)R&D SystemsAR0091X
NicotinamideSigma-AldrichN0636-100G10 mM
Noggin Conditioned Mediumn/an/a10 vol/vol %
PrimocinInvivoGenant-pm-2100 µg/mL
R-Spondin-1 Conditioned Mediumn/an/a20 vol/vol %
SB202190Sigma-AldrichS7067-25MG10 µM
单层培养基（类器官培养基添加物）
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046-5MG2.5 µM
HI FBSGibco10438-03420 vol/vol %
LY2157299Sigma-AldrichSML2851-5MG500 nM
Y-27632StemCellTechnologies7230810 µM
试剂
Alexa Fluor 488 Mouse anti-E-cadherinBD Biosciences5600611:200 稀释
Alexa Fluor 647 PhalloidinInvitrogenA222871:400 稀释
BSACytivaSH30574.022 w/vol %
Cell Recovery SolutionCorning354253n/a
DAPI Solution (1 mg/mL)Thermo Scientific622481:1000 稀释
DPBS (1X)Gibco14190-144n/a
Fluorescein Isothiocyanate–DextranSigma-AldrichFD4-100MG0.5 mg/mL
Matrigel MatrixCorning354234n/a
Paraformaldehyde Solution (4%)Thermo ScientificJ19943K2n/a
ProLong Gold antifade reagentInvitrogenP36930n/a
SNA, EBL, FluoresceinVector LaboratoriesFL-13011:100 稀释
Triton X-100Thermo ScientificA16046.AE0.3 vol/vol %
TrypLE ExpressGibco12605-028n/a
Trypan Blue Solution, 0.4%VWR Life ScienceK940-100MLn/a
材料与设备
0.4 µm 细胞培养插件Falcon353095
24孔细胞培养板Corning3524
48孔细胞培养板Thermo Scientific150687
70 µm 无菌细胞筛Fisher Scientific22-363-548
96孔细胞培养板Greiner Bio-One655086
离心机Eppendorf5910Ri
CO2 培养箱Thermo Scientific370
上皮细胞伏特-欧姆计MilliporeMillicell ERS-2
血细胞计数板LW ScientificCTL-HEMM-GLDR
倒置共聚焦显微镜Leica MicrosystemsSP8-X
倒置相差显微镜Leica MicrosystemsDMi1
显微镜盖玻片Fisher Scientific12-540-B
微孔板读板仪Molecular DevicesSpecrtraMax i3x
显微镜载玻片Fisher Scientific22-034-486
巴斯德吸管Fisher Scientific13-678-20C
手术刀片iMed Scientific-#11 碳钢
涡旋混合器Scientific IndustriesSI-0236
软件
LAS X 成像软件Leica MicrosystemsLAS X 3.7.6.25997
微孔板读板仪软件Molecular DevcesSoftMax Pro 7.1.2

参考文献

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