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采用落锤法改良并经磁共振成像验证的轻度单纯性创伤性脑损伤模型的建立

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DOI：

10.3791/67011

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2025年4月11日

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1Department of Biomedical Imaging and Radiological Sciences, National Yang Ming Chiao Tung University, 2Department of Medical Imaging and Radiological Sciences, College of Medicine, Chang Gung University, 3Department of Medical Imaging and Intervention, Chang Gung Memorial Hospital at Linkou

本文内容

摘要

本文介绍了一种建立闭合性头部损伤动物模型的方案，该模型可复制轻度非复杂性创伤性脑损伤的神经影像学特征，即在急性期保留脑结构完整性，并出现长期脑萎缩。纵向磁共振成像是获取证据的主要方法。

摘要

轻度创伤性脑损伤（mTBI），即脑震荡，占全球脑损伤病例的85%以上。特别是，在急性期常规临床影像学检查中无明显异常的非复杂性mTBI，会阻碍对这些患者进行早期和适当的治疗。已有研究指出，不同的撞击参数可能影响甚至加速mTBI后继发的神经心理症状进展。然而，脑震荡期间的撞击参数与预后之间的关联尚未得到充分研究。本研究详细描述并演示了一种基于落锤致伤范式改良的闭合性头部损伤（CHI）动物模型。将20只成年雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为不同撞击参数的CHI组（每组4只）。在为期50天的研究期间，进行了纵向磁共振成像（MR）检查，包括T2加权成像和扩散张量成像，以及一系列行为学评估，如改良神经功能缺损评分（mNSS）和平衡木行走实验。在伤后第50天进行了星形胶质细胞增生的免疫组织化学染色。与单次损伤组和假手术组相比，重复性CHI大鼠表现出更差的行为学表现。通过纵向磁共振成像（MRI）发现，伤后24小时未观察到明显的脑挫伤。然而，在伤后第50天观察到皮层萎缩以及皮层分数各向异性（FA）的改变，提示成功复制了临床非复杂性mTBI模型。最重要的是，mTBI后观察到的神经行为学结果和影像学特征的变化依赖于撞击次数、损伤间间隔时间以及动物体内选定的撞击部位。该结合临床前MRI的体内mTBI模型为在全脑尺度上探索脑损伤提供了手段，同时也允许研究对mTBI敏感且随不同撞击参数和严重程度变化的影像学生物标志物。

引言

轻度创伤性脑损伤（mTBI）主要见于从事对抗性运动的运动员、军事退伍人员以及交通事故相关人员1。其占所有报告的头部损伤病例的85%以上2。由于mTBI病因广泛且全球发病率持续上升，mTBI已被视为晚发性神经退行性疾病的潜在环境风险因素之一3。非复杂性轻度TBI的特征为格拉斯哥昏迷评分（GCS）为13-15分，在计算机断层扫描（CT）或磁共振成像（MRI）中未观察到结构性异常。非复杂性mTBI患者常见的症状包括头痛、头晕、恶心或呕吐以及疲劳。然而，由于患者失访率较高，对非复杂性mTBI后长期预后的评估面临较大挑战4。

反复性轻度创伤性脑损伤（mTBI）的问题日益受到关注，尤其是在美国国家橄榄球联盟（NFL）职业运动员群体中，这随后也提高了非职业运动员对此问题的认知5。据推测，首次发生mTBI后脑部的脆弱性会增加，后续的脑损伤可能进一步加重损伤后果。来自最大规模橄榄球运动员捐献脑组织队列的最新研究发现，不仅既往参与橄榄球运动与慢性创伤性脑病（CTE）的严重程度相关，还提示多种与橄榄球相关的因素与CTE的风险和严重程度存在关联6。因此，关于脑震荡次数以及重复性损伤模式对损伤结局影响的担忧正在增加。临床前研究已采用多种闭合性头部损伤（CHI）模型，探讨了反复性mTBI后的神经病理学改变、神经炎症级联反应以及神经心理功能障碍7,8,9,10,11,12,13,14。然而，对于影响参数在单纯性mTBI模型中的作用——该模型可能更接近模拟运动相关重复性脑震荡，导致急性期功能性损害和慢性期脑萎缩——目前尚缺乏充分研究。

弥散张量成像（DTI）是一种用于评估水分子弥散特性的技术，已被广泛应用于研究轻度创伤性脑损伤（mTBI）的影响。分数各向异性（FA）是DTI导出的关键指标，用于量化水分子弥散的一致性程度，反映轴突及神经纤维束的结构组织状态。在多种模型中，mTBI后白质（WM）区域的FA值出现改变已被广泛报道8,10,11,15,16,17。此外，前临床研究表明，轴向弥散率（AD）和径向弥散率（RD）——分别反映轴突完整性和髓鞘完整性——在mTBI后亦发生变化10,15,16,18,19,20。然而，既往研究中DTI结果的不一致，可能源于mTBI严重程度的差异、撞击参数的不同、mTBI模型的多样性以及伤后随访时间点的不统一9。

因此，本实验方案旨在建立一种轻度创伤性脑损伤（mTBI）的动物模型，用于评估单次及重复性轻度创伤性脑损伤的累积效应。我们采用了包括动物健康状况、行为学结果、弥散张量成像（DTI）参数和皮层体积在内的全面且纵向的评估方法，以捕捉损伤后动态变化，并探讨不同冲击参数的影响。通过展示急性期功能障碍以及长期的微结构改变，该模型有效复制了既往动物研究中尚未充分涵盖的单纯性轻度创伤性脑损伤的关键特征。本文提供了利用改良的闭合性头部撞击落锤法建立单纯性轻度创伤性脑损伤模型以及在损伤后进行纵向评估的详细实验方案8,11。

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方案

本研究严格遵循美国国立卫生研究院动物研究指南（《实验动物的护理和使用指南》）以及《动物研究：In Vivo 实验报告》指南的建议。所有动物实验均经中国台湾阳明交通大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。将20只动物随机分为5组（每组n = 4）：（i）感觉运动皮层单次冲击（SMCx/单次），（ii）感觉运动皮层两次冲击，间隔1小时（SMCx/两次冲击/1 h），（iii）感觉运动皮层两次冲击，间隔10分钟（SMCx/两次冲击/10 min），（iv）中枢脑区两次冲击，间隔1小时（中枢/两次冲击/1 h），以及（v）假手术组，仅接受手术操作但头部无直接冲击，用于纵向结局评估（图1）。值得注意的是，本研究选择的损伤间期（1小时 vs. 10分钟）旨在模拟接触性运动运动员在一个赛季中可能经历的重复性亚震荡性冲击8,10,11,13,21，此类冲击次数可高达上千次22,23。

1. 闭合性头部损伤（CHI）的诱导

注意：将10至12周龄、体重超过250 g的成年雄性Sprague-Dawley大鼠饲养在12小时光照/12小时黑暗循环条件下，可自由获取食物和水。

  1. 将大鼠放入小型诱导室中，使用异氟烷（5%）与医用空气（2.5–3 L/min）混合气体进行麻醉。当大鼠对足垫或尾部夹捏无反应时，将其从诱导室中取出。
  2. 将大鼠放置在加热垫上。
    注意：手术期间打开加热垫以维持大鼠体温。
  3. 将大鼠置于立体定位仪上，并用门齿杆固定。通过连接的鼻罩以1.5–2 L/min的医用空气流速输送2%异氟烷，用于术中维持麻醉。
  4. 放置耳棒。确保大鼠在立体定位仪框架上居中且对称。
    注意：所有手术操作均应在无菌条件下进行。手术器械使用高压蒸汽灭菌器在术前进行灭菌。为防止污染，动物体表覆盖手术巾。术者佩戴帽子以遮盖头发，佩戴口罩以遮盖面部，并在操作过程中穿戴实验服和外科手套。24.
  5. 将脉搏血氧仪传感器连接至动物后肢足垫，以监测其呼吸频率、心率、血氧水平和体温。
  6. 皮下注射利多卡因（20 mg/mL）至大鼠头皮，剂量为1 mL/kg体重 作为局部麻醉剂。
  7. 将脱毛膏涂抹于动物头部，静置3分钟。用70%异丙醇棉签擦去脱毛膏。
  8. 用浸有碘液的无菌棉签多次擦拭剃毛区域，然后用浸有70%乙醇的棉签去除残留的碘液。
  9. 使用无菌手术刀在剃毛的皮肤上做一条长约2-2.5 cm的正中切口 以暴露颅骨表面。
  10. 用棉垫去除骨骼上的组织以暴露颅骨。使用浸有0.9%生理盐水的棉签清洁颅骨表面，然后用干燥的棉垫擦拭。
    注意：此时可轻松识别颅骨缝以及前囟点和后囟点。
  11. 以bregma作为参考点，根据坐标进一步确定撞击区域。
    注意：本方案中采用两组坐标进行CHI诱导：位于感觉运动皮层（SMCx）上方的（-2.5，-2.0）（即冠状缝前2.5 mm，后2.0 mm）以及位于中央脑区（central）上方的（0，-3.0）。
  12. 在颅骨表面确定选定的坐标位置，使用牙科水泥在指定区域固定一个圆形不锈钢头罩（直径10 mm，厚度1 mm）。移除加热垫和脉搏血氧仪。
  13. 将立体定位装置和大鼠一起移至CHI撞击器下方的升降台（长14 cm，宽8 cm，深6.15 cm）上。
  14. 使用泡沫海绵（长19 cm，宽10 cm，厚4 cm，密度为18 kg/m³）将大鼠身体抬高3).
  15. 将大鼠从立体定位仪的耳杆上取下，使其保持在连接鼻罩的门齿固定杆上，并持续输送2%异氟烷。确保大鼠头部与身体在前后方向上保持水平对齐。
  16. 调节升降台，确保CHI撞击器与头盔之间无间隙。在撞击前立即关闭异氟烷。
    注意：为了明确由脑损伤引起的翻正反射，暂时停止了异氟烷的使用25.
  17. 从1米高处将一个600克的黄铜块通过一根不锈钢管（长1米，内径20毫米，用于清理一列不锈钢黄铜砝码）下落，撞击固定在圆头冲击器上的金属头盔。
    注意：假手术组动物未受到冲击，因为黄铜坠落物被释放后并未与大鼠头部的头盔发生接触。
  18. 降低升降台。将大鼠从立体定位仪中取出，并置于加热垫上呈仰卧位。
  19. 记录翻正反射的时间，即动物试图从仰卧位转为俯卧位的时间26,27.
    注意：在重复性CHI前3分钟，对动物再次进行麻醉nd 影响。对于 SMCx/double/10 min 组中未能及时翻转回俯卧位的动物，其翻正反射的对应时间记录为 420 s。
  20. 记录翻正反射后，使用步骤1.1中的方法再次用异氟烷麻醉大鼠。
  21. 使用步骤1.3中的立体定位仪固定大鼠。
    注意：在确认头盔在颅骨顶部固定稳定后，重复步骤 1.13–1.17，以执行第 2 次操作nd 影响。
  22. 取下头盔，清除颅骨顶部的所有结缔组织和粘固剂。
  23. 用牙科水泥覆盖颅骨，并使其干燥。使用镊子背面检查牙科水泥是否变硬且坚固。
    注意：在颅骨上涂抹牙科水泥，以消除术后颅骨与头皮之间因颅骨-空气或颅骨-血液界面所引起的磁化率伪影。
  24. 使用4-0缝线缝合切口 带4-5个独立结的尼龙外科缝线。
    注意：伤口长度约为2-2.5 cm。确保手术缝线无毛细作用，且由丝线或尼龙材料制成。缝合切口时不得使用单个结，以防止动物抓挠导致伤口裂开。
  25. 在大鼠手术切口处涂抹利多卡因和丙胺卡因外用乳膏，以防止其过度抓挠。
  26. 皮下注射颈背部，按1 mL/kg体重给予卡洛芬（50 mg/mL），作为术后镇痛药物。
  27. 将大鼠置于铺有加热垫的清洁笼具中，直至其恢复意识。待大鼠能够直立坐起后，将其放回原饲养笼。
  28. 术后连续3天，每天将5 mL对乙酰氨基酚（24 mg/mL）溶于200 mL水中，经口给予动物，作为镇痛剂。

2. 磁共振成像（MRI）

注意：在闭合性头部损伤（CHI）前，以及损伤后第1天和第50天，使用串联式PET/MR 7T系统进行T2加权成像和扩散张量成像（图1）。基线MRI在CHI操作前1周内完成。在CHI后第1天和第50天的评估中，行为学评估于上午进行，随后于同日下午进行MRI扫描。

  1. 在充满异氟烷（5%）与医用空气（2.5–3 L/min）混合气体的小型诱导室中麻醉大鼠。
  2. 当大鼠对足部或尾部夹捏无反应时，在将其转移至动物固定架时暂时中断麻醉，采用头前腹侧朝下的体位。
  3. 将大鼠置于与鼻罩相连的头部固定装置中，通过流速为1.5–2 L/min的医用空气输送2%异氟烷，以在图像采集期间维持麻醉。
  4. 用一小块胶带固定头部，以避免扫描过程中发生移动。
    注意：在颅脑损伤后第一天，于大鼠头部涂抹少量牙膏，以防止因去除头皮而产生磁化率伪影28,29.
  5. 将压力垫置于大鼠胸廓下方以监测呼吸。将针状电极插入四肢以监测心率。
  6. 插入直肠探头以测量直肠温度。实验期间，使用循环温水加热毯和组织包裹物覆盖大鼠，以维持其体温。
    注意：在整个实验过程中，需监测生理状况，包括心率、呼吸频率和直肠温度。扫描前应检查大鼠的所有生理信号，以确保生命体征监护仪的信号质量。
  7. 使用PET/MR扫描仪的激光定位系统标记头部中心，以实现精确定位。
  8. 使用电动动物传输系统将动物自动送入磁共振成像仪孔洞内，直至头部中心与扫描仪的等中心对齐。
    注意：集成在PET/MR系统中的电动动物转运系统可确保动物精确定位，并在不同成像模式之间转换时简化工作流程。
  9. 获取MRI序列。
    1. 进行初步定位和整体调整。
    2. 使用正中矢状切面并使8对齐th 从前方切取包含前连合交叉的切片。
      注意：冠状切面垂直于连接前连合与小脑基底部的水平面，相对于胼胝体长轴大约呈15°角。中线矢状切面T2-RARE扫描的关键参数如下：重复时间（TR）= 2500 ms，回波时间（TE）= 44 ms，视野（FOV）= 3.5 cm，矩阵大小 = 256 × 256，层厚 = 1 mm，层数 = 1，RARE因子 = 8，带宽 = 75 kHz，平均次数 = 1，采集时间 = 1分20秒。
    3. 使用带有脂肪抑制和在脑下方设置饱和带的快速采集弛豫增强（RARE）序列获取T2加权图像，作为解剖参考（图2).
      注意：T2-RARE 扫描的关键参数如下：重复时间（TR）= 3600 ms，回波时间（TE）= 40 ms，视野（FOV）= 2 cm，矩阵大小 = 256 × 256，层厚 = 1 mm，层数 = 16，RARE 因子 = 8，带宽 = 75 kHz，平均次数 = 8，采集时间 = 7 分 40 秒。
    4. 使用四次激发自旋回波EPI采集扩散张量成像（图2).
      注意：DTI扫描的关键参数如下：TR = 3000 ms，TE = 28 ms，视野（FOV）= 2 cm，矩阵大小 = 96 × 96，层厚 = 1 mm，切片数 = 16，脉冲持续时间（δ）= 5 ms，两个脉冲之间的时间间隔（Δ）= 15 ms，B0采集次数 = 5，扩散梯度方向数 = 30，b值 = 1000 s/mm²3带宽 = 150 kHz，平均次数 = 4，采集时间 = 14 分钟。
    5. 完成扫描程序。将动物托架从磁体中滑出。将动物从托架中取出。
    6. 将大鼠转移至底部放置加热垫的清洁笼具中，以维持其体温。待大鼠恢复意识后，将其放回原居住笼具。
  10. 图像预处理
    注意：使用 MRtrix3、统计参数映射（SPM）软件和自定义 MATLAB 脚本进行数据处理与分析。
    1. 使用 MRtrix3 命令（dwidenoise）对 DTI 图像进行去噪处理30.
    2. 使用 MRtrix 命令（mrdegibbs）去除 DTI 图像中的吉布斯 ringing 伪影30.
    3. 使用 SPM 函数（spm_coreg.m 和 spm_powell.m）将单个受试者在纵向扫描中的 DTI 图像与 T2 加权图像进行配准。
    4. 对T2加权图像进行颅骨剥离，方法是逐层手动勾画脑区轮廓，随后去除强度低于通过Otsu法计算所得阈值的像素31 （自定义 MATLAB 脚本 thr_otsu2.m）
    5. 使用 SPM 函数（spm_coreg.m 和 spm_powell.m）对同一实验组内的动物进行被试间共配准。将脑掩模应用于相应的 DTI 图像。
      注意：进行颅骨剥离是为了减少计算机处理时间。
    6. 基于DTI计算张量图（自定义MATLAB脚本，tensormap.m）。
    7. 计算FA图（自定义MATLAB脚本，calFA.m）
      注：所有自定义的 MATLAB 脚本均可通过以下数据库获取（https://doi.org/10.57770/9ZESXD）。
  11. 图像分析-FA
    1. 在CHI坐标的下方连续三个图像切片中，于皮层和胼胝体（CC）内绘制感兴趣区域（ROIs）。
      注意：所有感兴趣区域（ROI）均由两名对实验分组不知情的资深研究人员手动绘制，并进行视觉检查以排除明显错误。
    2. 从感兴趣区域（ROI）中提取并计算FA值的平均值。
      注意：对于皮层下方的胼胝体，FA值的像素 < 0.35 的像素被排除在选定的感兴趣区域（ROI）之外，以消除部分容积效应。对于皮层，所有 FA 值 < ROI 内为 0.35 的样本被纳入分析。
  12. 图像分析-体积
    1. 手动绘制覆盖前囟-7至+3 mm处连续11个图像切片皮层区域的ROI。
      注意：所有感兴趣区域（ROI）均由2名对实验分组设盲的经验丰富研究人员手动绘制。
    2. 将各切片中 ROI 的总像素数相加，并乘以切片厚度（1 mm），转换为体积。
    3. 以每只动物在颅脑损伤（CHI）前相应的皮层体积对颅脑损伤后的皮层体积进行标准化。
      注意：在展示数据前，需对数据进行标准化处理，以消除动物间脑容量的个体差异。

3. 行为评估

注意：行为学实验在颅脑损伤（CHI）前以及损伤后第1天和第50天，采用平衡木行走试验和mNSS进行（图1）。所有评估均由至少两名观察者完成，以确保所收集数据的准确性、一致性和客观性。

  1. 平衡木行走测试
    1. 打开摄像机并启动计时器。
    2. 将大鼠置于平衡梁的一端（深3 cm，宽3 cm，长80 cm，距地面60 cm）。
    3. 当大鼠完成一次往返、跌倒或静止不动超过3分钟时，停止计时。
      1. 实验过程中，观察动物状态，使用mNSS进行评估11,32,33,34遵循以下标准进行评估：
      2. 如果大鼠在横梁上保持平衡且姿势稳定，则评分为0。
      3. 如果大鼠抓住横梁的侧面，则记为1分。
      4. 若大鼠有一只肢体滑落横梁，则评分为2分。
      5. 如果大鼠有两只肢体脱离横梁或在横梁上旋转（>60 秒），评分为 3。
      6. 如果大鼠试图在横梁上保持平衡但掉落（>40 秒），评分为 4 分。
      7. 如果大鼠试图在横梁上保持平衡但掉落（>20 秒），评分为 5。
      8. 如果大鼠未尝试在横梁上保持平衡或抓握横梁，且在20秒内掉落，则评分为6分。
      9. 若大鼠未能完成任务，则记为耗时最长的3分钟，并赋予6分的评分。
    4. 在特定时间点安排检测日。
      注意：在CHI前两次试验中未能完成横梁行走往返的大鼠，应从后续手术及随访行为评估中排除。
  2. 改良神经功能缺损评分（mNSS）
    注意：mNSS 评估包括运动测试、感觉测试、反射缺失、异常运动、横梁平衡和地面行走32,33，该操作每日迅速进行 基础。
    1. 进行运动功能测试。
      1. 抓住大鼠尾根部将其提起，观察其四肢反射约15秒，以评估屈曲和伸展是否正常。
      2. 若观察到前肢有正常屈曲，评分为0；若未观察到屈曲，评分为1。
      3. 若观察到后肢有正常屈曲，评分为0；若未观察到屈曲，评分为1。
      4. 如果头部移动 >在提起大鼠尾部后30秒内，若其身体与垂直轴夹角小于10°，则评分为0；否则评分为1。
        注意：本次测试中最多将给出3个评分。
    2. 进行肢体放置试验。
      注意：放置试验用于评估感觉（视觉、触觉和本体感觉）与运动功能之间的协调性。
      1. 缓慢将大鼠向桌面靠近。观察大鼠的前爪是否朝向桌面伸展并触及表面。
      2. 如果大鼠用双侧肢体伸展并前伸到达水面，则评分为0。如果出现延迟或无反应，则评分为1。
      3. 将大鼠置于台面，将其足部拉向台缘。观察其足部是否能恢复至台面正常位置。
      4. 若观察到立即且正常的放置反应，则评分为0；若观察到延迟的放置反应，则评分为1；若无反应，则评分为2。
        注意：本次测试中最多将给出3个评分。
    3. 观察反射的缺失和异常运动。
      1. 用棉签的棉端触碰外耳道，观察是否出现头部摇晃，以评估耳廓反射。
      2. 若观察到正常反射，则评分为0；若未观察到反射，则评分为1。
      3. 用棉签的棉头轻触角膜，评估角膜反射是否存在。
      4. 若出现正常反应，记为0分；若未出现眨眼反应，记为1分。
      5. 双手快速用力拍击一次，观察是否出现惊吓反射。
      6. 若观察到反射，评分为0；若未观察到反射，评分为1。
      7. 观察大鼠是否出现癫痫发作、肌阵挛或肌张力障碍。
      8. 若出现其中任何一项，则评分为1。
        注意：本次测试中最多将给出4个评分。
    4. 按照之前所述的方法（步骤 3.1）进行横梁平衡测试。
      注意：本次测试最多将给出6个评分。
    5. 进行地面行走测试。
      1. 准备开阔场实验箱（75 cm 长，50 cm 宽，40 cm 深），确保其清洁且无任何先前的气味线索。
      2. 将一只大鼠置于开放旷场的中央，观察其在旷场中的行走行为。
      3. 如果大鼠进行正常行走，则评分为0。
      4. 如果大鼠无法直线行走，则评分为1。
      5. 如果将大鼠放置在地面后向偏瘫侧倾倒，则评分为3分。
        注意：本次测试中最多将给出3个评分。
    6. 将所有分数相加，最高可能得分为18分。
      注意：分数越高，表示预后越差。

4. 免疫组织学

  1. 进行经心脏灌注35。
    注意：经心脏灌注在创伤性脑损伤（CHI）后50天的MRI扫描完成后进行（图1）。
    1. 将大鼠置于小型诱导室中，使用异氟烷（5%）麻醉，直至其对足垫或尾部夹捏无反应。
    2. 通过腹腔注射给予唑拉西泮（Zoletil，50 mg/mL）50 mg/kg体重和赛拉嗪（Roumpun，23.32 mg/mL）10 mg/kg体重，以实现深度麻醉。
    3. 将大鼠置于仰卧位。
    4. 使用剪刀在胸腔下方做一条长约4–5 cm的横向切口。
    5. 定位膈肌并剪开，以暴露心脏。
    6. 使用止血钳夹闭肺动脉，然后在右心房处做一条长约0.5–1 cm的切口。
    7. 将针头连接至与输液泵相连的管道。
    8. 将针头插入左心室。
    9. 通过经心脏灌注（40 mL/min）使用500 mL的0.9%生理盐水冲洗动物，直至血液完全清除。
    10. 通过经心脏灌注（40 mL/min）使用500 mL的4%多聚甲醛（PFA）对动物进行固定灌注。
    11. 取下大鼠头部，并小心地将脑组织从颅骨中剥离。
    12. 将脑组织置于含有约20 mL 4% PFA的瓶中，固定后处理保存48小时。
  2. 进行组织处理及免疫组化染色36,37。
    注意：使用免疫过氧化物酶二抗检测系统试剂盒，对福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片进行免疫组化染色。
    1. 使用福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片。
    2. 进行脱蜡处理，并用3% H2O2处理载玻片以阻断内源性过氧化物酶活性。使用柠檬酸缓冲液在90 °C条件下进行抗原修复。
    3. 使用免疫过氧化物酶二抗检测系统试剂盒进行免疫组化染色。
      注意：染色步骤按照试剂盒制造商的推荐方法进行。
    4. 使用苏木精对样本进行复染。
    5. 使用抗荧光淬灭试剂封片。
    6. 使用抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体进行免疫组化染色。
    7. 使用光学显微镜载玻片扫描仪获取感兴趣区域（ROI）的图像（图6）。

5. 行为与图像结果的统计分析

注意：本研究中的统计分析在 SPSS 中进行；然而，统计分析也可在其他统计工具箱中完成。

  1. 在 SPSS *.sav 文件中以宽格式加载数据。
  2. 进行重复测量方差分析（ANOVA），以比较各组在不同时间点的行为学指标（标准化体重、mNSS 和平衡木行走时间）和影像学结果（皮层和胼胝体中的 FA 值）。
    1. 点击 分析 > 一般线性模型 > 重复测量。
    2. 在 组内因子名称 框中输入名称（例如，“time”），在 水平数 框中输入“3”（表示三个具有不同随访时间点的水平），并在 重复测量：定义因子 对话框中的 测量名称 框中指定名称（例如，“mNSS”）。
    3. 在 重复测量 对话框中加载需要检验的 组内变量（即在 CHI 前、D1 和 D50 后获得的数据），并指定组间因子（例如，具有不同撞击参数的动物组）。
    4. 在事后多重比较的 观测均值的事后检验 对话框中，选择 Bonferroni 法作为 因子的事后检验（例如，针对动物组）。
      注：为校正多重比较，采用 Bonferroni 校正法调整 I 类错误（0.05/3），用于时间点间的比较。统计学显著性定义为 p < 0.05（SPSS 调整后）。
  3. 进行单因素方差分析（ANOVA），以比较各组之间的翻正反射和皮层体积变化。
    1. 点击 分析 > 比较均值 > 单因素 ANOVA。
    2. 在 单因素 ANOVA 对话框中，将变量（翻正反射和皮层体积变化）加载至 因变量列表，并将组别作为 因子 输入。
    3. 在 单因素 ANOVA：事后多重比较 对话框中选择 Bonferroni 法作为事后检验。
      注：为校正多重比较，采用 Bonferroni 校正法调整 I 类错误（0.05/5），用于组间比较。统计学显著性定义为 p < 0.05（SPSS 调整后）。

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结果

图2 显示了假手术组和重复性颅脑冲击伤（CHI）组在初级躯体感觉皮层（SMCx）的代表性动物纵向磁共振成像（MRI）结果。在CHI后第1天和第50天的T2加权图像中未发现明显的颅骨骨折或脑挫伤。在CHI后第1天和第50天的各向异性分数（FA）图中未发现明显的白质（WM）水肿或变形。本研究中所有接受CHI处理的动物均存活至整个实验期结束（50天），表明该CHI模型的死亡率较低（0–5%）7。

脑损伤后即刻的意识障碍程度通过动物翻正反射的丧失情况进行评估，翻正反射是指动物自我纠正体位的内在倾向。与假手术组和SMCx单次闭合性头部损伤（CHI）组相比，重复性CHI后动物恢复翻正反射所需时间延长（图3A）。CHI后动物的一般健康状况通过标准化体重变化和改良神经功能缺损评分（mNSS）来反映。各组在CHI后均未观察到显著的体重下降（图3B）。单次CHI后第50天出现较...

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讨论

本研究旨在建立一种非复杂性轻度创伤性脑损伤（mTBI）的动物模型，以评估单次与重复性损伤的累积效应，以及对不同脑区冲击所导致的结果。该闭合性头部损伤（CHI）模型改编自闭合性头部落锤损伤范式，旨在模拟运动员及佩戴头盔个体常见的脑震荡。该模型在最大程度减少局灶性脑损伤的同时，能够精确调控关键冲击参数，包括冲击次数、损伤间间隔时间以及冲击脑区。研究结果表明，这些参数显著影响了行为学结果和各向异性分数（FA）值的进展。值得注意的是，无论冲击负荷或位置如何，在慢性期均观察到明显的皮层萎缩，这是慢性创伤性脑病（CTE）的典型特征。该实验模型为研究非复杂性mTBI后功能与微结构改变的纵向研究提供了可靠的框架，弥补了以往动物模型中的不足。

为了模拟在接触性运动或摩托车事故等临床场景中观察到的轻度创伤性脑损伤（mTBI），已有多种啮齿类动物头盔设计被应用于不同的动物模型7。与针对暴露脑表面的损伤模型相比，对闭合颅骨或头部的冲击通常导致更轻微且更弥散性的脑损伤15,

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披露

作者无潜在利益冲突需披露。

致谢

本研究工作得到了中国台湾国家科学与技术委员会（NSTC）的研究资助（NSTC 113-2314-B-A49-047）。我们感谢阳明交通大学脑研究中心小型动物影像核心设施及台湾动物联盟在Bruker 7T PET/MR技术方面的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
对乙酰氨基酚Center Laboratories 公司N02BE01
抗生素（Dermanest 软膏）康为制药有限公司49391
抗原修复缓冲液（100倍浓缩柠檬酸盐缓冲液）AbcamAB93678
抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体Bioworld Technology, IncBS6460
平衡梁定制定制深3 cm，宽3 cm，长80 cm，距地面60 cm
行为实验装置
圆形头盔定制定制不锈钢，10 毫米直径，1 毫米厚度
闭合性头部损伤
闭合性头部损伤撞击器定制定制一根不锈钢管（高 1 米，内径 20 毫米），管底固定一个带圆形顶端的冲击器（不锈钢，顶端直径 10 毫米），以及一个重物（不锈钢，600 克）。 
甲醛Bioworld Technology, IncC72
气体麻醉仪（蒸发器）RWD Life Science Co.R580S 动物麻醉蒸发器及配件
苏木精Bioman Scientific Co., Ltd17372-87-1
免疫组织学
免疫过氧化物酶二抗检测系统试剂盒Bio-Check Laboratories LtdK5007
异氟烷 伴侣 & BF Biotech Inc.8547
利多卡因Step Technology Co., LtdN01BB02
光学显微镜玻片扫描仪OlympusBX63
MR兼容的小动物监测与门控系统SA InstrumentsModel 1025 带有呼吸垫、心电图电极和直肠探头的监测套件 
磁共振成像
MRI运行委员会BrukerBiospecParavision 360 软件
MRI 系统BrukerBiospecPET/MR 扫描仪（PET 内置），7 T，105 厘米  梯度设置下的内孔直径 
开放场实验箱定制定制75 cm 长，50 cm 宽，40 cm 深
脉搏血氧仪STARR Life Sciences Corp. MouseOx Plus小鼠 && 大鼠脉搏血氧仪
大鼠适配器RWD Life Science Co.68021
SPSS Statistics 29IBM版本 29.0
立体定位仪RWD Life Science Co.G1124901-001
体积线圈布鲁克Biospec内径为40 mm的射频激发与信号接收收发器。
赛拉嗪拜耳中国台湾有限公司
ZoletilVirbacBN8M3YA

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