采用落锤法改良并经磁共振成像验证的轻度单纯性创伤性脑损伤模型的建立

摘要

本文介绍了一种建立闭合性头部损伤动物模型的方案，该模型可复制轻度非复杂性创伤性脑损伤的神经影像学特征，即在急性期保留脑结构完整性，并出现长期脑萎缩。纵向磁共振成像是获取证据的主要方法。

摘要

轻度创伤性脑损伤（mTBI），即脑震荡，占全球脑损伤病例的85%以上。特别是，在急性期常规临床影像学检查中无明显异常的非复杂性mTBI，会阻碍对这些患者进行早期和适当的治疗。已有研究指出，不同的撞击参数可能影响甚至加速mTBI后继发的神经心理症状进展。然而，脑震荡期间的撞击参数与预后之间的关联尚未得到充分研究。本研究详细描述并演示了一种基于落锤致伤范式改良的闭合性头部损伤（CHI）动物模型。将20只成年雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为不同撞击参数的CHI组（每组4只）。在为期50天的研究期间，进行了纵向磁共振成像（MR）检查，包括T2加权成像和扩散张量成像，以及一系列行为学评估，如改良神经功能缺损评分（mNSS）和平衡木行走实验。在伤后第50天进行了星形胶质细胞增生的免疫组织化学染色。与单次损伤组和假手术组相比，重复性CHI大鼠表现出更差的行为学表现。通过纵向磁共振成像（MRI）发现，伤后24小时未观察到明显的脑挫伤。然而，在伤后第50天观察到皮层萎缩以及皮层分数各向异性（FA）的改变，提示成功复制了临床非复杂性mTBI模型。最重要的是，mTBI后观察到的神经行为学结果和影像学特征的变化依赖于撞击次数、损伤间间隔时间以及动物体内选定的撞击部位。该结合临床前MRI的体内mTBI模型为在全脑尺度上探索脑损伤提供了手段，同时也允许研究对mTBI敏感且随不同撞击参数和严重程度变化的影像学生物标志物。

引言

轻度创伤性脑损伤（mTBI）主要见于从事对抗性运动的运动员、军事退伍人员以及交通事故相关人员¹。其占所有报告的头部损伤病例的85%以上²。由于mTBI病因广泛且全球发病率持续上升，mTBI已被视为晚发性神经退行性疾病的潜在环境风险因素之一³。非复杂性轻度TBI的特征为格拉斯哥昏迷评分（GCS）为13-15分，在计算机断层扫描（CT）或磁共振成像（MRI）中未观察到结构性异常。非复杂性mTBI患者常见的症状包括头痛、头晕、恶心或呕吐以及疲劳。然而，由于患者失访率较高，对非复杂性mTBI后长期预后的评估面临较大挑战⁴。

反复性轻度创伤性脑损伤（mTBI）的问题日益受到关注，尤其是在美国国家橄榄球联盟（NFL）职业运动员群体中，这随后也提高了非职业运动员对此问题的认知⁵。据推测，首次发生mTBI后脑部的脆弱性会增加，后续的脑损伤可能进一步加重损伤后果。来自最大规模橄榄球运动员捐献脑组织队列的最新研究发现，不仅既往参与橄榄球运动与慢性创伤性脑病（CTE）的严重程度相关，还提示多种与橄榄球相关的因素与CTE的风险和严重程度存在关联⁶。因此，关于脑震荡次数以及重复性损伤模式对损伤结局影响的担忧正在增加。临....

方案

本研究严格遵循美国国立卫生研究院动物研究指南（《实验动物的护理和使用指南》）以及《动物研究：In Vivo 实验报告》指南的建议。所有动物实验均经中国台湾阳明交通大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。将20只动物随机分为5组（每组n = 4）：（i）感觉运动皮层单次冲击（SMCx/单次），（ii）感觉运动皮层两次冲击，间隔1小时（SMCx/两次冲击/1 h），（iii）感觉运动皮层两次冲击，间隔10分钟（SMCx/两次冲击/10 min），（iv）中枢脑区两次冲击，间隔1小时（中枢/两次冲击/1 h），以及（v）假手术组，仅接受手术操作但头部无直接冲击，用于纵向结局评估（图1）。值得注意的是，本研究选择的损伤间期（1小时 vs. 10分钟）旨在模拟接触性运动运动员在一个赛季中可能经历的重复性亚震荡性冲击^{8,10,11,13,21}，此类冲击次数可高达上千次^22,23。

结果

图2 显示了假手术组和重复性颅脑冲击伤（CHI）组在初级躯体感觉皮层（SMCx）的代表性动物纵向磁共振成像（MRI）结果。在CHI后第1天和第50天的T2加权图像中未发现明显的颅骨骨折或脑挫伤。在CHI后第1天和第50天的各向异性分数（FA）图中未发现明显的白质（WM）水肿或变形。本研究中所有接受CHI处理的动物均存活至整个实验期结束（50天），表明该CHI模型的死亡率较低（0–5%）⁷。

脑损伤后即刻的意识障碍程度通过动物翻正反射的丧失情况进行评估，翻正反射是指动物自我纠正体位的内在倾向。与假手术组和SMCx单次闭合性头部损伤（CHI）组相比，重复性CHI后动物恢复翻正反射所需时间延长（图3A）。CHI后动物的一般健康状况通过标准化体重变化和改良神经功能缺损评分（mNSS）来反映。各组在CHI后均未观察到显著的体重下降（图3B）。单次CHI后第50天出现较.......

讨论

本研究旨在建立一种非复杂性轻度创伤性脑损伤（mTBI）的动物模型，以评估单次与重复性损伤的累积效应，以及对不同脑区冲击所导致的结果。该闭合性头部损伤（CHI）模型改编自闭合性头部落锤损伤范式，旨在模拟运动员及佩戴头盔个体常见的脑震荡。该模型在最大程度减少局灶性脑损伤的同时，能够精确调控关键冲击参数，包括冲击次数、损伤间间隔时间以及冲击脑区。研究结果表明，这些参数显著影响了行为学结果和各向异性分数（FA）值的进展。值得注意的是，无论冲击负荷或位置如何，在慢性期均观察到明显的皮层萎缩，这是慢性创伤性脑病（CTE）的典型特征。该实验模型为研究非复杂性mTBI后功能与微结构改变的纵向研究提供了可靠的框架，弥补了以往动物模型中的不足。

为了模拟在接触性运动或摩托车事故等临床场景中观察到的轻度创伤性脑损伤（mTBI），已有多种啮齿类动物头盔设计被应用于不同的动物模型⁷。与针对暴露脑表面的损伤模型相比，对闭合颅骨或头部的冲击通常导致更轻微且更弥散性的脑损伤^15,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
对乙酰氨基酚	Center Laboratories 公司	N02BE01
抗生素（Dermanest 软膏）	康为制药有限公司	49391
抗原修复缓冲液（100倍浓缩柠檬酸盐缓冲液）	Abcam	AB93678
抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体	Bioworld Technology, Inc	BS6460
平衡梁	定制	定制	深3 cm，宽3 cm，长80 cm，距地面60 cm
行为实验装置
圆形头盔	定制	定制	不锈钢，10 毫米直径，1 毫米厚度
闭合性头部损伤
闭合性头部损伤撞击器	定制	定制	一根不锈钢管（高 1 米，内径 20 毫米），管底固定一个带圆形顶端的冲击器（不锈钢，顶端直径 10 毫米），以及一个重物（不锈钢，600 克）。
甲醛	Bioworld Technology, Inc	C72
气体麻醉仪（蒸发器）	RWD Life Science Co.	R580S 动物麻醉蒸发器及配件
苏木精	Bioman Scientific Co., Ltd	17372-87-1
免疫组织学
免疫过氧化物酶二抗检测系统试剂盒	Bio-Check Laboratories Ltd	K5007
异氟烷	伴侣 & BF Biotech Inc.	8547
利多卡因	Step Technology Co., Ltd	N01BB02
光学显微镜玻片扫描仪	Olympus	BX63
MR兼容的小动物监测与门控系统	SA Instruments	Model 1025	带有呼吸垫、心电图电极和直肠探头的监测套件
磁共振成像
MRI运行委员会	Bruker	Biospec	Paravision 360 软件
MRI 系统	Bruker	Biospec	PET/MR 扫描仪（PET 内置），7 T，105 厘米  梯度设置下的内孔直径
开放场实验箱	定制	定制	75 cm 长，50 cm 宽，40 cm 深
脉搏血氧仪	STARR Life Sciences Corp.	MouseOx Plus	小鼠 && 大鼠脉搏血氧仪
大鼠适配器	RWD Life Science Co.	68021
SPSS Statistics 29	IBM	版本 29.0
立体定位仪	RWD Life Science Co.	G1124901-001
体积线圈	布鲁克	Biospec	内径为40 mm的射频激发与信号接收收发器。
赛拉嗪	拜耳中国台湾有限公司
Zoletil	Virbac	BN8M3YA