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利用小胶质细胞构建视网膜类器官

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DOI：

10.3791/67016

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2024年7月26日

 ,  , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University

通讯作者： Zi-Bing Jin <jinzibing@foxmail.com>

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

小胶质细胞是视网膜中独特的常驻免疫细胞，在多种视网膜变性疾病中发挥关键作用。建立视网膜类器官与小胶质细胞的共培养模型，有助于更深入理解视网膜疾病的发病机制及发展过程。

摘要

由于人类视网膜的可及性有限，视网膜类器官（ROs）是研究人类视网膜疾病的最佳模型，有助于揭示视网膜发育机制及视网膜疾病的发生过程。小胶质细胞（MG）是视网膜和中枢神经系统（CNS）中独特的常驻巨噬细胞，具有重要的免疫功能。然而，由于视网膜类器官的分化来源为卵黄囊，其本身缺乏小胶质细胞。小胶质细胞在这些视网膜疾病中的特异性致病机制仍不明确，因此，建立包含小胶质细胞的视网膜类器官模型显得尤为必要。本文中，我们成功构建了由人源干细胞分化而来的小胶质细胞与视网膜类器官共培养的模型。在该研究中，我们将小胶质细胞进行分化后，在早期阶段与视网膜类器官进行共培养。由于引入了免疫细胞，该模型为视网膜疾病建模和药物筛选提供了优化平台，有助于深入研究视网膜及中枢神经系统相关疾病的发病机制与治疗策略。

引言

由于人视网膜来源有限，将人类干细胞分化为三维（3D）视网膜类器官成为模拟视网膜结构与功能的一种颇具前景的体外模型1。该模型包含视网膜中的多种细胞类型，如光感受器细胞、视网膜神经节细胞、双极细胞、Müller细胞、水平细胞和星形胶质细胞2。这一模型使得研究人员能够模拟并研究视网膜发育机制以及视网膜疾病的发病过程。然而，由于目前采用的定向分化方法使视网膜类器官主要来源于神经外胚层3，因而缺少来自其他胚层的多种细胞类型，例如源自卵黄囊的小胶质细胞以及源自中胚层的血管周细胞4,5,6。

目前，许多视网膜疾病，如视网膜色素变性7、青光眼8和视网膜母细胞瘤9，已被证实与视网膜内的小胶质细胞密切相关。然而，由于缺乏合适的研究模型，小胶质细胞与这些疾病之间关系的具体机制仍不明确。尽管小鼠已被广泛用作研究视网膜疾病的理想模型，但近期研究指出，小鼠与人类的小胶质细胞在寿命、增殖速率以及人类同源基因的缺失等方面存在显著差异10,11。这些发现表明，从小鼠模型中得出的结论可能并不完全可靠，因此构建包含小胶质细胞的人类视网膜类器官显得尤为重要。

在过去的几十年中，已开发出多种用于视网膜类器官三维分化的技术12,13。为了促进小胶质细胞在视网膜类器官中的共培养操作，我们选择了一种从贴壁培养过渡到悬浮培养的分化方法。该方法成功实现了将小胶质细胞整合入视网膜类器官，并至少维持其存活60天14。

方案

本研究经首都医科大学附属北京同仁医院机构伦理委员会批准。HESC 细胞系 H9 来源于 WiCell 研究所。实验前将细胞培养基在室温（RT）预温 30 分钟。

1. 人小胶质细胞的制备

  1. 将hESCs在干细胞培养基中培养至细胞密度达到80%-90%。每孔接种至少1 × 106个细胞。
  2. 吸除干细胞培养基，并用1× DPBS（每孔1 mL，6孔板）清洗细胞。下一步需要2 × 107–1 × 108个细胞。若数量不足，可合并2–5孔的细胞进行后续操作。
  3. 使用0.5 mM EDTA溶液在37 °C培养箱中孵育约5分钟以解离干细胞集落（每孔1 mL，6孔板）。
  4. 5分钟后观察集落形态。当集落边缘略微卷起并出现松散间隙时，细胞已准备好进行分化，此时吸除EDTA溶液。若未达到该状态，继续在37 °C孵育1–2分钟。总孵育时间不得超过8分钟。
  5. 用6 mL含6 µL 10 mM ROCK抑制剂Y-27632溶液的Medium A（表1）轻柔冲洗每孔细胞。轻敲培养皿底部以帮助细胞脱落。将此日记为第0天。
    注意：不要使用移液器吹打细胞。次日细胞将形成拟胚体（EBs）。
  6. 24小时后，在显微镜下观察细胞，确认拟胚体形成。用10 mL移液器将EBs收集至15 mL离心管中，静置5分钟使EBs沉降至管底。
  7. 小心吸除上清液，用6 mL新鲜Medium A重悬EBs，转移至新的低黏附6孔板孔中。置于37 °C培养箱中继续培养。
    注意：第1天更换培养孔的目的是减少EB形成过程中大量死亡细胞对细胞生长状态的不利影响。
  8. 每天更换新鲜Medium A，直至第4天（每孔6 mL，6孔板）。
  9. 第4天，在10 cm培养皿中加入3 mL 0.1%鱼胶原溶液，于5% CO2、37 °C培养箱中包被至少1小时。
    注意：若包被时间少于1小时，后续操作将难以进行。
  10. 用10 mL移液器小心收集EBs至15 mL离心管中，静置5分钟使EBs沉降至管底。
  11. 吸除0.1%胶原溶液，并用5–6 mL 1× DPBS清洗10 cm培养皿一次。吸除DPBS。
  12. 在15 mL离心管中用15 mL Medium B（表1）轻柔重悬EBs，转移至已包被的10 cm培养皿中。置于37 °C、5% CO2培养箱中培养1周。
    注意：前7天内请勿移动培养皿。
  13. 每周更换一次新鲜Medium B，直至第49天（每10 cm培养皿15 mL），并每周在显微镜下观察细胞状态。
    注意：第49天后，可在培养皿上清液中观察到若干分泌细胞。
  14. 在室温下以200 ×g离心上清液中的细胞5分钟。
  15. 小心吸除上清液，用2 mL新鲜Medium B重悬细胞，转移至新的低黏附6孔板孔中。置于5% CO2、37 °C培养箱中培养。
    注意：接下来的7天内请勿移动培养板。小胶质细胞可能黏附于低黏附孔底部。
  16. 第56天，更换为Medium C（表1）（每孔2 mL，6孔板）。小胶质细胞将黏附于低黏附孔底部，并在显微镜下呈现分支状形态。
    注意：每3天更换一次Medium C（每孔2 mL，6孔板），小胶质细胞可在Medium C中持续培养约15天。

2. 人类视网膜类器官的生成及与小胶质细胞的共培养

  1. 将hESCs在干细胞培养基中培养至细胞密度达到80%-90%，每孔接种至少1 x 106个细胞。
  2. 向培养孔中加入Dispase（6孔板每孔1 mL），37 °C孵育5分钟，随后吸除Dispase溶液。
  3. 向孔中加入Medium D（表1）（6孔板每孔1 mL），用10 µL移液器将细胞切割成小块。
  4. 轻柔收集所有细胞碎片及培养基至1.5 mL微量离心管中。
  5. 以200 x g离心5分钟，弃去上清液。
  6. 将细胞轻柔重悬于200 µL冷基质中，将1.5 mL微量离心管放入培养箱孵育20分钟。操作需迅速，因基质在室温（RT）下会凝固。20分钟后，基质将在培养箱中完全凝固。
  7. 准备一个10 cm培养皿，加入15 mL Medium D。用Medium D重悬基质，并轻轻摇动培养皿。
  8. 随后将培养皿放入培养箱培养5天，期间勿移动培养皿。将该日设定为第0天（ROs）。细胞将在3天内贴壁。
  9. 在第5天（ROs）和第10天（ROs），更换Medium D培养基。
  10. 在第12天（ROs），移除培养基，每皿加入3 mL Dispase，作用5分钟。
  11. 吸除Dispase，每皿加入15 mL Medium E（表1）。
  12. 收集小胶质细胞：在第56天（MGs），轻柔吸除Medium C，每6孔板孔加入Accutase（1 mL/孔），37 °C孵育3分钟。
  13. 用5 mL移液器将小胶质细胞收集至15 mL离心管中，于室温下以200 x g离心5分钟。
  14. 轻柔吸除上清液，将小胶质细胞重悬于1 mL Medium E中，并加入第12天消化后的ROs中。
    注：第12天（ROs）时细胞处于贴壁状态；第13天（ROs）时细胞开始悬浮于Medium E中。若从第12天（ROs）至第19天（ROs）期间培养基变黄，需用Medium E更换培养基。
  15. 在第19天（ROs），通过轻柔旋转培养皿使类器官聚集至皿中央，轻柔吸除Medium E，并更换为Medium F。
  16. 将含Medium F的类器官转移至新的悬浮培养皿中。
  17. 每周更换一次培养基，并挑选类器官用于实验。

结果

视网膜类器官的生成步骤已在我们之前的研究中描述15。本文展示了小胶质细胞以及小胶质细胞与视网膜类器官共培养的代表性结果。

此处展示了小胶质细胞分化的各个阶段（图1A）。第0天代表干细胞培养阶段。随后，将干细胞消化并进行悬浮培养以形成拟胚体（EB）。在该过程的最初4天内，细胞将形成拟胚体（图1B）。接着，我们将悬浮的拟胚体转移至贴壁培养的10 cm培养皿中。大约7天后，细胞形态接近图1C所示状态。随着培养的进行，贴壁细胞会向培养上清液中分泌造血祖细胞（图1D）。此过程大约需要45天。此时，可从上清液中收集细胞并转移至6孔板中。在接下来的7天内，小胶质细胞将逐渐成熟（图1E），并可用于后续实验。

在视网膜类器官分化的第12天，将贴壁细胞消化并转为悬浮培养，并向视网膜类器官中加入含有小胶质细胞的E培养基。小胶质细胞将迁移进入视网膜类器官内部。为了清晰观察小胶质细胞的形态，我们在人胚胎干细胞（hESCs）中加入了EGFP慢病毒转染，使分化后的小胶质细胞表达GFP并具有自发荧光（绿色）（图2A-C）。我们还通过免疫荧光染色检测了与小胶质细胞共培养50天后的视网膜类器官的组织结构，使用了光感受器细胞标志物CRX和小胶质细胞标志物IBA1进行分析（图2D）。

干细胞分化过程示意图；hESC 经培养基变化在 63 天内分化为小胶质细胞。
图 1：由人胚胎干细胞（hESC）分化获得小胶质细胞的示意图与时间线。（A）该方案从在6孔板中解冻并传代hESC开始。（B）在含培养基A的条件下形成均一的拟胚体（EB）。（C）将拟胚体转移至包被培养皿中，在第4–56天形成造血祖细胞。（D、E）在第56天收集含有细胞的上清液（D），并将其转移至低黏附性6孔板中，于第63天形成小胶质细胞（E）。比例尺：500 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞分化实验；EGFP荧光显微镜；类器官分析，结果比较。
图2：小胶质细胞与视网膜类器官共培养过程中的代表性时间点图像。（A）来源于EGFP-hESC的小胶质细胞的代表性图像。（B）EGFP+小胶质细胞与视网膜类器官共培养，分化18天后的图像。（C）EGFP+小胶质细胞与视网膜类器官共培养，分化30天后的图像。比例尺：300 µm。（D）使用CRX（光感受器细胞标志物；红色）和IBA1（小胶质细胞标志物；绿色）检测与小胶质细胞共培养50天后视网膜类器官的组织结构。DAPI（蓝色）标记细胞核。比例尺：30 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：本研究中所用培养基的组成。 表中列出了配制每种培养基500 mL所需的成分。请点击此处下载该表格。

讨论

由于人视网膜来源受限，目前对视网膜炎症反应的理解几乎都来自动物模型。为克服这一局限，研究人员分化获得了视网膜类器官。视网膜类器官模型的开发一直是研究热点，旨在模拟人视网膜的复杂性，用于疾病建模和治疗策略开发。已有多个研究成功报道了从人多能干细胞生成视网膜类器官1,2,12,13。然而，这些模型大多缺乏小胶质细胞，而小胶质细胞在视网膜发育和疾病发病机制中具有关键作用。近期研究尝试将小胶质细胞整合到视网膜类器官或脑类器官模型中16,17,18，但具体方法尚不明确。本文提供了一种详细的分步操作方案，用于在早期阶段将来源于同一条hESC系的小胶质细胞与视网膜类器官进行共培养。尽管已有研究利用动物模型或细胞培养系统探讨了小胶质细胞在视网膜疾病中的作用7,8,9，但本文所呈现的共培养模型为研究小胶质细胞-视网膜相互作用及其在疾病发病机制中的意义，提供了一个更具生理相关性的基于人源的系统。

关键步骤在于人干细胞的状态以及小胶质细胞和视网膜类器官的分化。小胶质细胞和视网膜类器官（ROs）应逐步分化，并在不同阶段使用正确的试剂和培养皿（经组织培养处理的培养皿或悬浮培养皿）。该模型有助于我们理解小胶质细胞如何参与视网膜疾病发生的过程，在未来的药物筛选和疾病机制研究中具有重要意义。然而，我们目前发表的方法仍存在一些局限性。由于小胶质细胞的分化周期较长，且缺乏合适的冷冻保存方法，因此在进行共培养时，需合理规划小胶质细胞和视网膜类器官的分化时间。

除了视网膜类器官外，我们认为将免疫细胞整合到其他类器官模型中也有助于促进类器官的发育。因此，测试其他类器官系统至关重要。将多种细胞类型与类器官整合以形成完整器官，代表了未来极具前景的研究模型。

披露

作者们未意识到存在任何可能影响本研究客观性的附属关系、会员资格、资助或财务持有情况。

致谢

本研究由国家自然科学基金（82101145）和北京市自然科学基金（Z200014）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AcctuaseStemcell Technologies07920
Advanced DMEM/F12Thermo12634-010
Anti-CRX(M02)abnovaH00001406-M02抗体；稀释比例按照制造商说明书进行
Anti-IBA1Abcamab5076抗体；稀释比例按照制造商说明书进行
B27Life Technologies17105-041
Dispase (1U/mL)Stemcell Technologies07923
DMEM 基础培养基Gibco10566-016
DMEM/F12Gibco10565-042
DPBSGibcoC141905005BT
EDTAThermo15575020
F12Gibco11765-054
FBSBiological Industry04-002-1A
明胶SigmaG7041-100G固体
GlutamaxGibco35050-061
H9 细胞系WiCell Research Institute
IL-3RD Systems 203-IL-050
IL-34PeproTech200-34-50UG
KSRGibco10828028
基质胶（Matrix）Corning356231
M-CSFRD Systems 216-MC-500 
MEM 非必需氨基酸溶液SigmaM7145
N2Life Technologies17502-048
NeurobasalGibco21103-049
青霉素-链霉素（Pen/strep）Gibco15140-122
干细胞培养基 Stemcell Technologies5990
牛磺酸SigmaT-8691-25G
X-ViVOLONZA04-418Q
Y27632SelleckS1049
β-巯基乙醇Life Technologies21985-023

参考文献

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